本发明涉及组织细胞培养技术领域，具体涉及一种一种骨髓间充质干细胞细胞冻存剂及其制备方法和应用。
背景技术：
骨髓中除含有能分化发育成各种血细胞的造血干细胞之外，还含有产生非造血组织的间充质干细胞(mscs)，因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此有的文献也把msc、称做贴壁细胞(成纤维细胞集落形成单位(cfu-f)。由于它们来自骨髓的支持结构，并且可以作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞。
mscs具有多向分化潜能已经被体内外试验所验证。friedenstem首先证实了msg、具有分化为骨、软骨、纤维组织的能力。1999年pittenger等从人的骼骨骨髓样本中分离得到了mscs，在体外不同分化条件的诱导下，可以形成成骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞，并且克隆以后的细胞具有类似的分化特性，充分证明骨髓mscs是多潜能干细胞。但是，pittenger等人的实验尚不能证实分离到的msg、是否是定型祖细胞的混合物，骨髓中是否真的存在具有多向分化潜能的单个干细胞。halleu等将分离到的间充质细胞稀释后以低密度接种，结果由单个细胞生长而成的克隆能在体外连续扩增培养20多代，并可分化为成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞，从而证实了骨髓中分离出来的间充质细胞中含有具有干细胞特性即高度自我更新能力和多系分化潜能的单个细胞。anita等通过使用骨髓基质细胞的克隆培养，分析185个非无限增殖的人骨髓基质细胞克隆分化为成骨、成软骨、成脂肪细胞的能力，证实了mscs的体外分化模型:能分化成这三个细胞系的细胞是早期的间充质祖细胞，其分化潜能的有序丢失使得分化的方向逐步减少。近20年来关于msg、多潜能性的报道很多，这类体外研究试验均是针对不同分化方向采用了各种不同的诱导剂，分别使mscs向不同的终末细胞例如成骨、成软骨、成脂肪、成肌细胞等分化。
mscs具有取材方便，在体外培养能保持其多向分化潜能，遗传背景稳定，植入体内无免疫排斥反应，易于临床应用等特点，是组织工程中理想的种子细胞。虽然mscs的多向分化潜能已经被广泛的证实，但是它的体内试验仅限于用小动物mscs来修复自身的组织缺损。为了将mscs用于大动物和与人类接近的灵长目动物，傅文玉等将培养的人骨髓mscs注入裸鼠皮下，一个月后在注射局部观察到了人mscs分化的骨、软骨、脂肪、骨骼肌、肌键样组织等多种组织类型。tippi等建立了异基因的人胎羊模型，将人msg、植入到胎羊中，观察到人mscs在胎羊中存活长达13个月，并且部位特异性地分化为脂肪、软骨、肌细胞等，进一步证实了移植以后mscs仍具有多系分化潜能，还观察到在人胎羊模型的损伤部位，人mscs分化的细胞量增加，推测可能是植入的mscs在这种损伤环境下被诱导扩增和参加组织修复或者再生反应。该研究为那些在子宫中就可以诊断出来的骨生成缺损，肌肉萎缩症等疾病的临床治疗奠定了基础。
mscs比较容易从病人的骨髓中分离出来，在体外多倍扩增以后，进行多种目的性操作，然后重新输回病人体内，其间制备好的细胞不可避免的需要冷冻保藏备用。目前，干细胞冻存使用的冻存液有含血清和无血清的两类，由于血清具有成分复杂、质量不稳定、价格昂贵等缺点，无血清冻存和复苏技术成为发展趋势。低温保存干细胞主要依靠抗冻液二甲基亚砜(dmso)和血清的保护。常用到的细胞保护剂还有羟乙基淀粉0es)、聚乙二醇(peg)等。但是，dmso会对细胞产生毒性作用，对冻存的干细胞造成不可逆的损伤。为获得来源方便的mscs干细胞，开展有效的mscs干细胞冻存方法是本领域迫切的需求，建立一种长期低温保存mscs干细胞的方法对于促进mscs干细胞的研宄和应用具有重大意义。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种骨髓间充质干细胞细胞冻存剂以及相应的制备方法及使用方法。
本发明的技术方案如下：
一种骨髓间充质干细胞细胞冻存剂，其特征在于由如下各组分组成：0.2％w/v蔗糖，0.5％w/v低密度脂蛋白，3％w/v的海藻糖，2％w/v卵磷脂，多肽100ppmw/v，bfgf1.5％w/v，维生素e1％w/v，甘油5％v/v最后用dmem培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，所述多肽的序列如seqidno：1-2任一所示。所述多肽由发明人通过特异性针对mscs细胞进行的前期的大量的基因库筛选得到，所述多肽具有保护mscs细胞免受损伤的功能。其名称分别为mscs-1(sektwfvwyswrkqgciedsrptyhyc)、mscs-2(karewepdrhmthwipgfhhmgcsyh)。
在本发明的细胞的冻存液中，甘油和海藻糖以及维生素e和多肽具有明确的抵御外来伤害对细胞的损伤，特别是多肽，还具有保护细胞免受冻存时冰结晶对细胞的损伤，其余集中组分对于维持特异性的mscs细胞的生存是必须的。
本发明还提供了一种细胞的冻存液的制备方法，即将所述各组分混合摇匀即成。
本发明还提供了一种骨髓间充质干细胞冻存方法，包括以下步骤:
a.冻存液制备:制备所述的细胞冻存液，将各组分按照常规的操作方法将各组分按照相应的比例混合即可获得；
b.细胞悬液制备:培养生长成单层的mscs细胞一瓶，0.25％胰蛋白酶液消化4分钟，弃胰酶液，加入dmem培养液15ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，离心4000转/分，弃上清，加入步骤a冻存液2ml，混均，置入无菌的冻存管内；
c.冷冻:先将冻存管在4℃下冻存30min，然后放入-30℃冻存lh，再放入-80℃冻存3h，最后移入液氮中保存；
d.细胞复苏:取出冻存管快速置于37℃水浴，震荡直至细胞悬液完全融化，然后用5倍dmem液稀释，1000r/min离心5min,离心去除上清液,再重复3次。所述细胞悬浮浓度为108细胞/ml-1010细胞/ml。
本发明的有益效果:
本发明的细胞冻存液，复苏细胞存活率可达98.5％以上，较使用常规细胞冻存液的复苏存活率有了显著提高，基本上没有细胞的损耗。
本发明的mscs干细胞冻存液可以长期保存mscs干细胞，细胞活性不发生变化，保证了细胞生物学活性。
本发明神经细胞冻存方法，操作简单可行，价格适宜，具有较好的实用价值。
具体实施方式
实施例1
分别加入0.2％w/v蔗糖，0.5％w/v低密度脂蛋白，3％w/v的海藻糖，2％w/v卵磷脂，多肽100ppmw/v，bfgf1.5％w/v，维生素e1％w/v，甘油5％v/v最后用dmem培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。其中多肽的序列如sektwfvwyswrkqgciedsrptyhyc所示。
实施例2
分别加入0.2％w/v蔗糖，0.5％w/v低密度脂蛋白，3％w/v的海藻糖，2％w/v卵磷脂，多肽100ppmw/v，bfgf1.5％w/v，维生素e1％w/v，甘油5％v/v最后用dmem培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。其中多肽的序列如karewepdrhmthwipgfhhmgcsyh所示。
比较例i
分别量取70ml的mem细胞培养液、20ml的小牛血清、i0ml的二甲基亚砜，混合制得常规细胞冻存液。
比较例ii
将二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，最后用dmem培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。
比较例iii
将二甲基亚砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，维生素e1％w/v，最后用dmem培养基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。
实施例3冻存液的效果验证
以上实施例1-2及比较例i-iii所制备的细胞冻存液，分别按照下述方法进行细胞冻存和复苏实验。
细胞冻存过程:
培养生长成单层的人白血病干细胞，其细胞密度约6*109个/ml，加入ph7.0的pbs洗细胞表面一次。
将细胞用0.25％胰蛋白酶液消化4分钟，弃胰酶液，加入dmem培养液15ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，离心4000转/分，弃上清，加入实施例1-3和比较例1所制备的冻存液2ml，混均，置入无菌的冻存管内；
冷冻:先将冻存管在4℃下冻存30min，然后放入-30℃冻存lh，再放入-80℃冻存3h，最后移入液氮中保存；分别冻存1周，4个月，8个月。每组3个重复。
细胞复苏:取出冻存管快速置于37℃水浴，震荡直至细胞悬液完全融化，然后用5倍dmem液稀释，1000r/min离心5min,离心去除上清液,再重复3次，计算细胞存活率。结果如下：
取8个月的冻存细胞，进行细胞分化培养，其中所述的mscs细胞能够正常进行分化，分化效率达到95.3％，而比较例i-iii取出的细胞其分化率只能达到58.4％,60.2％，80.5％，这充分的说明细胞活性收到很大的影响。
实施例4特异性检测
将实施例1的培养基，分别针对其他几种干细胞：造血干细胞，神经干细胞，脂肪干细胞进行采用实施例3的培养方式进行冷冻试验，通过8个月的冻存试验，发现，8个月之后的这几种细胞存活率均处于80％-90％的存活率之间，说明，本发明的冷冻剂可以特异性的培养mscs。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
〈110〉陈印平
〈120〉一种骨髓间充质干细胞细胞冻存剂
〈160〉2
〈210〉1
〈211〉27
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉mscs-1
sektwfvwyswrkqgciedsrptyhyc
〈211〉26
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉mscs-2
karewepdrhmthwipgfhhmgcsyh