一种西瓜病害的防控方法与流程

本发明属于生物病原菌领域，具体涉及一种西瓜病害的防控方法。
背景技术：
：西瓜枯萎病在世界范围广泛发生，其病原为尖孢镰刀菌西瓜专化型(fusariumoxysporumf.sp.niveum)，是土传和种传病害。多年来，土传西瓜枯萎病是严重影响西瓜生产的重要病害，一般病株率为10％～20％，重者达80％～90％，甚至可造成绝产。其常见病害症状有以下3种类型。(1)猝倒型：发生在幼苗期，受害瓜苗子叶失水萎蔫下垂，茎基部溢缩，最后猝倒枯死。(2)侏儒型：发生在团棵伸蔓期，病株生长缓慢，蔓细、节间短、瘦小，叶片发黄边缘向上卷曲，呈畸形小老苗；有的病株呈直立状，根系稀少发黄，维管束变褐，最后枯死。(3)萎蔫型：多发生在结瓜期，这是西瓜枯萎病的典型症状，按其表现形式有全株枯萎，或同一株上有的蔓枯萎，有的蔓正常，或同一条蔓上有的端部枯萎，另一部分正常。经过国内外农业工作者的多年努力，现在土传西瓜枯萎病可以通过抗病品种、轮作、土壤消毒、嫁接育苗和定植后药剂灌根处理等技术进行防治。目前，国内外关于种传西瓜枯萎病的报道较少，boughalleb等研究发现种子也可携带致病菌，携带致病菌的西瓜种子播种栽培后其感病率高达50％以上；我国也有研究者曾经从我国的西瓜种子上分离得到枯萎病菌；有试验表明种传西瓜枯萎病可以通过用咯菌腈处理种子来防治。技术实现要素：本发明的一个目的是提供一种西瓜枯萎病的防治方法。本发明提供的西瓜枯萎病的防治方法包括对西瓜种子进行干热处理的步骤；所述西瓜枯萎病为尖孢镰刀菌fusariumoxysporum引起的西瓜枯萎病，该病害的具体表现为：病害发生在育苗期，幼苗子叶展开时，从生长点开始沿下胚轴纵向开裂，同时，沿着子叶边缘进行侵染；嫁接时剔除病苗，使用尚未发病的幼苗进行嫁接，待盖膜保湿的薄膜揭开后，仍可发现嫁接苗成片发病，病株成为发病中心使得病情不断向周围植株扩展，采用嫁接方法不能阻止发病接穗死亡。至移栽时病死苗率高达80％。上述方法中，所述西瓜枯萎病的传播途径为种传。上述方法中，所述干热处理的方法为将西瓜种子先在(30-35)℃条件下干热处理24h；然后在(45-50)℃条件下干热处理24h；最后在(78-82)℃条件下干热处理72-96h。在本发明的具体实施例中，所述干热处理的方法为将西瓜种子先在35℃条件下干热处理24h；然后在50℃条件下干热处理24h；最后在80℃条件下干热处理(72～96)h。本发明还有一个目的是提供上述方法的新用途。本发明提供了上述方法在提高西瓜枯萎病的防治效果中的应用。本发明还提供了上述方法在降低西瓜枯萎病的植株发病率中的应用。本发明还提供了上述方法在控制西瓜枯萎病的发生和发展中的应用。上述应用中，所述西瓜枯萎病为尖孢镰刀菌fusariumoxysporum引起的西瓜枯萎病。上述应用中，所述西瓜枯萎病的传播途径为种传。2016年以来，我国西瓜生产中开始出现一种新的苗期病害，本发明首先发现了该西瓜病害具有西瓜枯萎病病害新症状，具体表现为：子叶展开时，从生长点开始沿下胚轴纵向开裂，同时，沿着子叶边缘进行侵染，采用嫁接方法不能防止发病接穗死亡，病死苗率高达80％，造成育苗期毁灭性的损失。查阅国内外资料未见该种病害症状的相关报道，于是采集典型发病样本，开展了形态和分子鉴定，结果表明：该病害的病原是尖孢镰刀菌，并开展种子检测，发现该病害是一种种传的西瓜枯萎病病害。最后为了找到该病害的防治方法，开展了种子包衣、药剂浸种和不同温度下的干热处理试验，并分析比较了不同处理后的种子的植株发病率及防病效果，最终得出防治该病害的最有效的方法，达到从源头控制该病害的发生和蔓延，避免或最大程度地减少种传西瓜枯萎病给生产造成损失的目的。附图说明图1为西瓜枯萎病的发病症状。从左至右分别为发病的西瓜幼苗、发病接穗和发病嫁接苗。图2为尖孢镰刀菌的分生孢子的形态。从左至右分别为大型分生孢子和分生孢子梗。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的西瓜品种“京欣307”和“京颖”均购自京研益农(北京)种业科技有限公司。下述实施例中的供试药剂为6.25％精甲霜灵·咯菌腈悬浮种衣剂、2.5％咯菌腈悬浮种衣剂和50％咯菌腈可湿性粉剂，均是瑞士先正达作物保护有限公司的产品。下述实施例中的cla培养基是将灭菌的3～5mm2康乃馨叶段放入培养皿，然后加入2％水琼脂培养基(配方：1l水、20g琼脂)得到的培养基，通常每2ml培养基加1个康乃馨叶段。下述实施例中的pda培养基是将土豆200g、葡萄糖20g、琼脂17g和蒸馏水1000ml混匀得到的培养基。下述实施例中的pl培养基是将土豆200g、乳糖20g和蒸馏水1000ml混匀得到的培养基。实施例1、一种尖孢镰刀菌引起的新的西瓜枯萎病病害一、病害的发现及症状2016年年初，我国西瓜主产区出现一种新的西瓜枯萎病病害。该病害发生在育苗期，病害表现为：子叶展开时，从生长点开始沿下胚轴纵向开裂，同时，沿着子叶边缘进行侵染，据观察，幼苗出土10天左右时，发病苗数达到30％；嫁接时剔除病苗、使用尚未发病的幼苗进行嫁接，待盖膜保湿的薄膜揭开后，仍可发现嫁接苗成片发病，病株成为发病中心使得病情不断向周围植株扩展，接穗发病最终导致嫁接苗的接穗死亡。期间从苗出齐开始一直在用药防治，试用多种药剂效果甚微，至移栽之前病死苗率高达80％。造成整批的苗子不能使用。二、发病材料的采集与病原菌的分离纯化按常规方法对采集具有典型发病叶片的发病幼苗进行病原菌分离纯化，共得到1个分离物，并将该分离物命名为xg1601。具体步骤如下：采集典型发病幼苗，切取长5mm左右的病健交接处的组织，用70％的酒精浸几秒钟，用灭菌水换洗3次，用灭菌滤纸吸干水分，然后放在pda平板上25℃条件下培养；2-3天后，从形成的菌落边缘挑取菌丝体移植到新的pda平板上培养；再过2-3天后，用显微镜观察分生孢子产生情况，将菌种上产生的孢子用灭菌水洗下，稀释成几个浓度梯度，分别取1ml不同浓度的孢子悬浮液涂在1％水琼脂培养基(1％水琼脂培养基是将10g琼脂和1l水混匀得到的培养基)表面，在显微镜下从水琼脂平板正面检视孢子，挑取单孢子移植到pda平板上培养，得到分离物xg1601。三、病原菌的致病性测定及形态学和分子鉴定1、病原菌的致病性测定(1)菌株准备将分离纯化的分离物xg1601接种在pda培养基上，在28℃条件下培养5d。向xg1601的pda平板培养物中加适量水搅拌成菌泥，并将其与供试西瓜种子混合在一起，每1/2个平板的菌泥接种30粒种子。(2)种苗准备供试西瓜品种为“京颖”。取小育苗盒，在最底层铺2/3育苗盒高度的灭菌蛭石，第2层放30粒接种分离物xg1601的西瓜种子，第3层覆盖1/3育苗盒高度的灭菌蛭石，以不接种病原菌的种子作为对照。育苗盒置于25℃光照培养箱中恒温培养，每天光照12h，每天检查出苗及幼苗发病情况。结果表明：播种后第9天开始，接种分离物的幼苗陆续发病，而对照的幼苗没有发病，从接种发病的幼苗分离纯化的病原菌，分离得到的病原菌与分离物xg1601在形态上相同，因此确定该分离物xg1601是病原菌。2、病原菌的形态学鉴定将分离纯化的分离物xg1601接种到pda平板上，25℃黑暗培养，观察菌落形态；在cla培养基上培养，观察大型分生孢子、小型分生孢子和厚垣孢子，并在100倍倒置显微镜下直接观察小型分生孢子的产生方式，依据相关分类资料鉴定。病原菌的大型分生孢子和分生孢子梗的形态如图2所示。病原菌在pda培养基上呈粉白色，菌落圆形，菌丝绒毛状，25℃条件下在pda上黑暗培养，7d菌落直径达到77mm左右；大型分生孢子镰刀型，以3个隔膜为主；小型分生孢子长椭圆形，通常无隔；分生孢子梗短、生于菌丝侧面，单生，无分枝；厚垣孢子顶生或间生，圆形，多为单独生长，偶尔也对生或串生。依据《thefusariumlaboratorymanual》(leslie等，2006)，鉴定该病原菌为尖孢镰刀菌fusariumoxysporum。3、病原菌的分子鉴定(1)dna的提取将分离纯化的分离物xg1601接种于pl培养基中，在25℃、125rpm·min-1条件下振荡培养3～4d，过滤收集菌丝体，采用改良的ctab法提取菌株dna。(2)pcr扩增以上述步骤(1)获得的dna为模板，利用真菌核糖体基因转录间隔区(its)通用引物its1/its4对病原菌的rdna-its区进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。pcr扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最终72℃延伸10min。(3)序列分析获得的pcr扩增产物由北京三博远志生物技术有限公司进行测序，并将得到的序列在genbank中进行比对，通过blast搜索和同源性分析对病原菌进行鉴定。测序结果表明：pcr扩增获得大小为504bp的dna片段，其核苷酸序列如序列1所示。通过blast进行序列比对同源性分析，与genbank中kc201696等尖孢镰刀菌的序列同源性达到99％。综合以上鉴定结果，将该病原菌鉴定为尖孢镰刀菌fusariumoxysporum。因此，步骤一中西瓜幼苗病害的病原菌为尖孢镰刀菌fusariumoxysporum。实施例2、尖孢镰刀菌引起的西瓜种传枯萎病病害的防治方法2016年年初发生的西瓜幼苗病害，在嫁接之后，仍然陆续发病，病株还成为发病中心使得病情不断向周围植株扩展，因此，嫁接方法对防治这种西瓜病害是无济于事的；另据对发病苗场的调查，在育苗时使用的基质和用具均是消过毒的。因此初步判断该病病原菌应该来源于种子，即种子携带病原菌，因此有必要开展种子内部带菌情况检测，并开展种子处理方法研究。具体方法如下：一、携带病菌种子的制备1、分离物xg1601的孢子悬浮液的制备先将实施例1中的分离物xg1601接种在pda平板上，25℃培养4天后，挑取3～4个0.5cm2菌片放入pl培养基中，于摇床中25℃、110r·min-1培养5～7d，再将菌液用灭菌的四层纱布过滤，6000r·min-1离心15min，去上清液，加适量灭菌水稀释孢子，用血球计数板记数，最后调整孢子浓度为1×104个·ml-1，即得到分离物xg1601的孢子悬浮液。2、携带病菌种子的制备用分离物xg1601的孢子悬浮液，浸泡西瓜种子(“京欣307”)，6h后捞出控水、播种于装有灭菌基质(草炭：蛭石＝2：1)的穴盘中，苗龄至三叶一心时移栽到试验大棚，常规管理，直至西瓜成熟期时收获西瓜种子。并将收获的整批种子混合均匀，常温储存，作为下述种子检测试验和防治方法试验中的供试西瓜种子。二、种子检测开展了种子内部带菌检测：随机选取供试西瓜种子250粒在1％的次氯酸钠溶液中浸泡1min，然后用无菌水冲洗3次，在培养皿底部铺两层灭菌滤纸，将种子倒入其中，用无菌滤纸吸干种子表面的无菌水；然后用无菌解剖刀将种子解剖为种皮和种胚，将种皮(内侧)和种胚分别均匀摆放在直径为15cm的pda平板上，每个平皿摆放20块种皮或种仁；25℃恒温箱中黑暗条件下培养，7d后观察记录。重复4次，结果取平均值。种子带尖孢镰刀菌率(％)＝(带尖孢镰刀菌种子数/检测种子总数)×100％。检测结果为：种皮内侧带尖孢镰刀菌率平均为5.4％，种胚带尖孢镰刀菌率平均为1.7％。对检测到的尖孢镰刀菌的致病性和形态进行鉴定。结果表明：致病性和形态鉴定结果均与实施例1中的分离物xg1601相同，据此判断该病害为种子传播的病害。因此，无菌种子是防治该病发生的主要措施，其防治应该从种子处理着手。三、尖孢镰刀菌引起的西瓜种传枯萎病病害的防治方法1、种子包衣处理选用目前市场上防治尖孢镰刀菌效果较好的两种包衣剂：6.25％精甲霜灵·咯菌腈悬浮种衣剂(亮盾)和2.5％咯菌腈悬浮种衣剂(适乐时)，按1:250的药种质量比对供试西瓜种子进行包衣处理。包衣处理的具体步骤如下：将种子放入一个完好的塑料袋或自封袋中，在烧杯中用自来水将种衣剂稀释5倍混匀后，再将稀释后的药液迅速倒入袋中，紧握袋口(让袋子中留下足够的空气)，快速上下摇晃种子，将药液充分包裹在种子表面。所有处理后的种子置于室内阴干，直接用于试验，以不包衣处理的种子作为对照。三个重复，每个重复30粒种子(30粒种子/盒)。处理后的种子先放在生长箱内，温度为25℃的恒温，12小时光照/12小时黑暗，出苗后移至温室。播种出苗后，每天调查发病情况，至播种后35天结束调查，并计算发病率和防效效果。防治效果(％)＝(对照发病率-处理发病率)/对照发病率×100；发病率(％)＝发病苗数/总苗数×100。结果如表1所示。从表1可以看出，对照发病率为56.6％，用亮盾、适乐时包衣的发病率分别为18.7％和17.8％。与对照相比，用亮盾、适乐时包衣有一定的防治效果，防治效果分别为66.97％和68.56％。表1、带菌种子包衣处理后的植株发病率(％)2、药剂浸种处理用50％咯菌腈可湿性粉剂4000倍液按如下两种方法对供试西瓜种子进行药剂浸种处理：一种处理是药液浸种4h之后，换清水催芽；另一种是先用清水浸种催芽，播种之前再用药液浸芽0.5h。药液用药量要保证完全淹没种子。并以不药剂浸种处理的种子作为对照。72孔穴盘，每个处理7盘，种子数量为504粒，栽培基质为灭菌蛭石。日光温室，夜晚用地热线加热，设定温度为25℃。播种后每天调查发病情况，记载发病株数并及时清理发病植株。播种后50天调查终止。结果如表2所示。从表中可以看出，未经药液处理的种子发病比较早，感病株率比较高，经过药液浸种4h和浸芽0.5h的发病时间较晚，感病株率都比对照低，但是，防治效果分别为17.5％和11.3％，防效很低。咯菌腈可湿性粉剂4000倍液处理种子，尽管使用的最高浓度，但仍然不能完全控制病情，可见，采用咯菌腈浸种和浸芽都不能达到防控该病的目的。表2、带菌种子药剂处理后的植株发病率(％)3、种子干热处理对供试西瓜种子进行干热处理，干热处理后，关闭电源，24h后取出种子，置于保存箱内，同时以未经干热处理的种子为对照。随机抽取1000粒干热处理后的种子72孔穴盘播种，从出苗开始每天调查记载发病情况，并及时清除发病植株，直到播种后50天。干热处理具体步骤如下：将种子置于干热处理机(韩国高丽器械株式会社生产的2100l)内，按照处理时间和温度的不同分别如下各组：处理组1(72℃处理96h)：将西瓜种子依次进行如下干热处理：35℃干热处理24h；50℃干热处理24h；72℃干热处理96h；处理组2(72℃处理120h)：将西瓜种子依次进行如下干热处理：35℃干热处理24h；50℃干热处理24h；72℃干热处理120h；处理组3(80℃处理72h)：将西瓜种子依次进行如下干热处理：35℃干热处理24h；50℃干热处理24h；80℃干热处理72h；处理组4(80℃处理96h)：将西瓜种子依次进行如下干热处理：35℃干热处理24h；50℃干热处理24h；80℃干热处理96h。(1)72℃干热处理的检测结果结果如表3所示。从表中可以看出，带菌种子经过72℃干热处理96h后，发病率从对照的35.71％降低到18.18％，防治效果为49％；防治效果不好。将72℃干热处理延长到120h后，发病率从对照的35.71％降低到15.86％，防治效果为55.5％。防治效果仍然偏低，因此，72℃干热处理条件下，延长处理时间不能提高防治效果。表3、带菌种子干热处理后的植株发病率(％)(2)80℃干热处理的检测结果结果如表4所示(每日调查结果，仅显示部分)。播种后第十一天ck开始出现发病植株，直到播种后50天发病植株不断出现，第15天时，发病率为31.9％，第20天时，发病率达到40.2％，第30天时，发病率达到51.5％，第40天时，发病率达到70.5％，第50天时，发病率达到80％；经过80℃72h处理的种子播种后50天之内发病率仅为0.4％；经过80℃96h处理的种子播种后50天之内始终没有发病植株，发病率为0。从上述结果可以看出，经过80℃72h处理的种子，发病率大大降低，防治效果99.5％；而经过80℃96h处理的种子，播种后50天内发病率均为零，防治效果100％。说明80℃干热处理对防治该种传病害是有效的，80℃处理72-96h的防效为99.5-100％。表4、带菌种子干热处理后的植株发病率(％)综上所述，72℃干热处理种子96-120h，防治效果为49.0-55.5％；80℃干热处理种子72-96h，防治效果为99.5-100％。综合比较以上结果，可以看出，以80℃干热处理种子的防治效果最好。实施例3、种子干热处理对种子活力和幼苗长势的影响对防治效果好的处理方法(80℃72h和80℃96h)处理西瓜京欣307种子后，分别进行发芽试验，测定干热处理对西瓜京欣307种子的活力和幼苗生长势的影响，以未干热处理的西瓜京欣307种子作为对照(ck)。具体步骤如下：将干热处理后的种子直接播种在灭菌的蛭石中，置于25℃恒温、l//d＝12h//12h的条件下培养，播种后自幼苗出土起，每天调查出苗情况，记录出苗时间。每处理100粒种子，重复4次。播种后5d计算种子的发芽势，14d计算种子的出苗率，14d测定幼苗的生长特性。测定幼苗生长特性时，连根拔出幼苗，用水洗净后放在滤纸上吸去多余水分，称量每个重复幼苗的总重量，计算平均每株苗鲜重。利用单向方差分析模型(one-wayanovamodel)分析数据结果，并利用snk(student-newman-keuls，p＝0.05)检验平均数差异的显著性(spssinc.2008)。结果如表5。从表5可以看出，与对照组(ck)相比，80℃处理种子72h-96h后，对种子的发芽势、出苗率和鲜重均没有影响。表5、种子质量和幼苗长势处理发芽势(％)出苗率(％)鲜重(g)/株ck100aa100aa0.385aa80℃72h96aa99aa0.3898aa80℃96h98aa99aa0.3884aa注：同列数据后相同大写字母、小写字母表示经student-newman-keuls法检验分别在p<0.01、p<0.05水平差异不显著。序列表<110>北京市农林科学院<120>一种西瓜病害的防控方法<160>1<210>1<211>504bp<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1actgatccgaggtcacattcagaagttggggtttaacggcgtggccgcgacgattaccag60taacgagggttttactactacgctatggaagctcgacgtgaccgccaatcaatttgagga120acgcgaattaacgcgagtcccaacaccaagctgtgcttgagggttgaaatgacgctcgaa180caggcatgcccgccagaatactggcgggcgcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcac240tgaattctgcaattcacattacttatcgcattttgctgcgttcttcatcgatgccagaac300caagagatccgttgttgaaagttttgatttatttatggttttactcagaagttacatata360gaaacagagttttaggggtcctctggcgggccgtcccgttttaccgggagcgggctgatc420cgccgaggcaacaagtggtatgttcacaggggtttgggagttgtaaactcggtaatgatc480cctccgcaggcccccctaacggaa504当前第1页12