本发明涉及生物防治
技术领域：
，特别是涉及防治根结线虫的复合生物制剂及其应用。
背景技术：
：根结线虫meloidogynespp.是一种土传性病原物，其为身体两侧对称、无色、透明的无脊椎动物。线虫虫体可分为体壁和体腔两部分，体壁从外至内由角质膜、下皮层和肌肉组成，体壁内是体腔，腔内充满用以湿润各种器官的体液，这种液体为线虫的原始血液，供给虫体所需的营养物质和氧气。线虫在植物根系危害、诱发植物根系畸变形成“肿瘤状”突起，引起植物的生理病变，影响植物的生长和发育，致使作物品质下降，产量减少20-40％，严重的减产70％，甚至死亡和绝产。其还能与真菌、细菌、病毒相互作用，并且能直接传染多种病毒，共同致病形成复合侵染，造成这三种病害的加重(例如儿菜菌核病等)，所以说，线虫具有双重性病源的作用，危害巨大！我国每年由于根结线虫危害所造成的经济损失多达上亿元。目前化学防治仍是主要措施，而化学防治所带来的环境及食品安全问题越发严重，开展安全有效的生物防治措施已经成为国内外研究的热点问题。目前防治的方法分为四类：一类是微生物资源如真菌、细菌和放线菌等，主要防治机理是寄生线虫取食线虫营养，分泌次生代谢产物抑制或者毒杀线虫，研究较多的生防菌为厚垣普奇尼亚菌pochoniachlamydosporia，淡紫拟青霉paecilomyceslilacinus，木霉trichoderma，苏云金芽孢杆菌bacillusthuringiensis等。单个生防菌株对环境因子要求高，不同生态环境对生防菌的定殖有不同的影响，使得单个生防菌株的防效降低。因此，运用不同生防机制的生防菌组成复配菌剂具有较好的环境适应性，可提高对根结线虫的防治效果。有研究通过平板亲和性试验，构建出一组以淡紫拟青霉、红灰链霉菌和苍白杆菌各1株的复合微生物菌群，以发酵活体为有效成份的功能性复合微生物菌剂，对黄瓜根结线虫病的防效达到50％。二类是植物源杀虫剂，植物可以被看作是生物活性物质的天然工厂。由于天然杀线物在贮存、应用、制剂的相容性和半衰期方面以及药效的环境因素要求方面相比于生物活体具有较大的优势。植物源农药的开发已成为国内外研究的热点。刘计权对13种孢子植物浸提制备提取物，室内进行线虫离体活性测定的试验表明不同植物提取物的杀线效果与时间有关，有的在24h以内表现强杀线活性如蛇苔，有的在72h后线虫的死亡率最高，如绵马贯众。而利用有机溶剂进行绵马贯众的提取中，提取率只有18.70％。如何高效提取植物源杀虫剂是摆在科研工作者面前的一道难题。第三类是基因工程，基因工程的思路就是在线虫的侵入、取食和繁殖等阶段进行相应的破坏，从而达到防治的效果。第四类是利用有机废弃物防治线虫。常用的有机废弃物是农业废弃物或动物排泄物和植物残体。最近有研究指出药用昆虫养殖产生的废弃物含有不同于其他有机废弃物的成分，如蜕和几丁质，对线虫具有一定的防效。技术实现要素：目前现有技术中存在的技术问题是，传统方法对根结线虫防治率低，防治效果不彻底，对根结线虫的防效均在50％左右。有的方法如植物源杀虫剂法对根结线虫的防治效果较好，但植物源有效成分提取率低，导致成本较高。线虫的体壁主要由蛋白质构成，包括一些胶原成分，几丁质微纤维与50％-60％的蛋白质基质构成几丁质层。蛋白酶可以有效破坏线虫体壁的完整性并降解线虫体壁，田宝玉等人关于胞外体壁降解蛋白酶的研究表明，纯化的蛋白酶表现出明显的降解线虫体壁的活性，但纯酶的效果没有粗酶明显，这可能是因为粗酶中还存在其他可以降解线虫体壁的成分。发明人通过大量研究与实验获知：将木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、蛋白酶及海藻多糖按一定比例混合后，溶于水中制成一定浓度的生物制剂溶液，能破坏线虫的体壁，逐渐酶解线虫身体的几丁质微纤维和蛋白质，最终分解线虫体壁，造成线虫内溶物的泄漏，杀死线虫，甚至将线虫溶解。生物制剂中的海藻多糖具有很高的生物活性，能促进植物根系发育，增进其对土壤养分、水分与气体的吸收利用，同时可增大茎秆维管束细胞，加快水分、养分与光合有机产物的运输，对于被线虫侵染过的植物自我修复起到很好的作用。本发明提供了防治线虫的组合物，所述组合物含有木聚糖酶，纤维素酶，和蛋白酶。优选的是，上述组合物还含有β-葡萄糖苷酶和/或海藻多糖，优选组合物还含有1-2份β-葡萄糖苷酶和1-2份海藻多糖，其中β-葡萄糖苷酶含量不包括纤维素酶中自身所包含的β-葡萄糖苷酶。优选的是，上述所述组合物含有2-5份木聚糖酶，1-2份纤维素酶和1-2份蛋白酶；优选组合物含有3-4份木聚糖酶，1-2份纤维素酶和1-2份蛋白酶。优选的是，所述组合物含有2-5质量份木聚糖酶，1-2质量份纤维素酶和1-2质量份蛋白酶以及1-2质量份β-葡萄糖苷酶，其中β-葡萄糖苷酶含量不包括纤维素酶中自身所包含的β-葡萄糖苷酶；或者所述组合物含有2-5质量份木聚糖酶，1-2质量份纤维素酶和1-2质量份蛋白酶以及1-2质量份海藻多糖。优选的是，上述组合物，其中，所述木聚糖酶活力为5000-8000u/mg，纤维素酶活力为10-400u/mg，蛋白酶活力为10-800u/mg。优选的是，上述组合物，其中，所述蛋白酶选自丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶中的一种或两种以上。优选的是，上述组合物，其中，所述蛋白酶选自木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、米曲霉蛋白酶、黑曲霉蛋白酶、根霉蛋白酶中的一种或两种以上。优选的是，上述组合物，其中，所述组合物还含有几丁质酶。另一方面，本发明提供复合生物制剂，含有上述任一组合物。另一方面，本发明还提供上述组合物或上述复合生物制剂在防治线虫和/或保护植物中的应用。优选的是，上述应用，通过在植物播种前或播种后将所述组合物或复合生物制剂施用到土壤中，进行防治线虫。本发明的有益效果包括：利用本
发明内容制作的生物制剂，成本低，对根结线虫防治率高，通过对重茬山药地块反复实验，发现线虫防治率可超过90％，远远优于现有方法。本制剂可添加到灌溉液中，在灌溉的同时渗入土壤中，达到对根结线虫防治的效果，也可在植物播种前对土壤进行灌溉处理，使用方法简单有效。本发明的产品无色且易溶于水，对动植物无毒无害，且成本低廉，适于大批量生产及推广。下面结合具体实施方式，对本发明及其有益技术效果进行详细说明，其中：具体实施方式如上所述，本发明的目的在于：提供新型复合生物制剂，为根结线虫的防治提供一种更有效的新方法。本发明的复合生物制剂的主要活性成分是本发明的防治线虫组合物，本发明优选的组合物含有2-5份木聚糖酶，1-2份纤维素酶和1-2份蛋白酶，1-2份β-葡萄糖苷酶和1-2份海藻多糖。其中所述β-葡萄糖苷酶不包括纤维素酶中原本含有的β-葡萄糖苷酶。通过将上述组分按重量混合后，溶于水得到复合生物制剂。本发明所述木聚糖酶理解为任何具有木聚糖酶活性的蛋白质、多肽或多肽的复合物或多肽的片段。所述蛋白酶理解为任何具有蛋白酶活性的蛋白质、多肽或多肽的复合物或多肽的片段。所述纤维素酶理解为任何具有纤维素酶活性的蛋白质、多肽或多肽的复合物或多肽的片段。所述的β-葡萄糖苷酶理解为任何具有β-葡萄糖苷酶的蛋白质、多肽或多肽的复合物或多肽的片段。将本发明的防治线虫组合物溶于水中配制成质量浓度为1％或1‰的复合生物制剂溶液，对土壤取样进行浸泡实验，通过观察土壤中线虫数量及存活情况来确定复合生物制剂抑制线虫的效果。将本发明的防治线虫组合物溶于水中，配制成质量浓度为1％或1‰的复合生物制剂溶液，对重茬山药土壤进行灌溉，通过观察各深度线虫数量确定复合生物制剂抑制线虫的效果。下面通过具体实施例来说明本发明的防治线虫组合物，利用本发明复合生物制剂在抑制根结线虫中的应用。下面实施例中所用到各试剂和仪器来源如下：表1实施例所用试剂和仪器一土壤浸泡实验设置两个区组，分别为a组(深度10-20cm)和b组(深度20-30cm)重茬山药地土样，每个区组3个处理，分别为a1、a2、a3和b1、b2、b3。每个处理取土壤15g，用四层医用纱布包裹土壤并系紧，放在加水或相应浓度生物制剂的漏斗中，每个区组的具体处理方式如表2所示，加水或相应浓度生物制剂的量以漫过土壤表面即可，漏斗下接有10cm长的胶管，胶管下端接有止水夹。静置6h。打开止水夹接漏斗下端液体10ml，放入离心机中以2000r/min离心2min，用吸管将上清液去掉至剩下2ml液体，放入培养皿内用显微镜进行观察，统计活虫和死虫的数量。表2具体处理方式a1/b1a2/b2a3/b3清水浸泡6h1％制剂溶液浸泡6h1‰制剂溶液浸泡6h实施例1复合生物制剂活性成分组成为：木聚糖酶0.5g，纤维素酶0.1g，蛋白酶0.1g。按表2中处理方式对山药重茬地土壤进行处理后的结果如表3所示。表3处理后山药重茬地线虫数量实施例2复合生物制剂活性成分组成为：木聚糖酶0.2g，纤维素酶0.2g，蛋白酶0.1g。按表2中处理方式对山药重茬地土壤进行处理后的结果如表4所示。表4处理后山药重茬地线虫数量实施例3复合生物制剂活性成分组成为：木聚糖酶0.3g，纤维素酶0.1g，蛋白酶0.2g。按表2中处理方式对山药重茬地土壤进行处理后的结果如表5所示。表5处理后山药重茬地线虫数量实施例4复合生物制剂活性成分组成为：木聚糖酶0.4g，纤维素酶0.2g，蛋白酶1.1g，β-葡萄糖苷酶0.2g，海藻多糖0.1g。按表2中处理方式对山药重茬地土壤进行处理后的结果如表6所示。表6处理后山药重茬地线虫数量实施例5复合生物制剂活性成分组成为：木聚糖酶0.2g，纤维素酶0.1g，蛋白酶0.2g，β-葡萄糖苷酶0.2g。按表2中处理方式对山药重茬地土壤进行处理后的结果如表7所示。表7处理后山药重茬地线虫数量实施例6复合生物制剂活性成分组成为：木聚糖酶0.5g，纤维素酶0.15g，蛋白酶0.2g，海藻多糖0.2g。按表2中处理方式对山药重茬地土壤进行处理后的结果如表8所示。表8处理后山药重茬地线虫数量实施例7复合生物制剂活性成分组成为：木聚糖酶0.1g，纤维素酶0.3g，蛋白酶0.5g。按表2中处理方式对山药重茬地土壤进行处理后的结果如表9所示。表9处理后山药重茬地线虫数量实施例8复合生物制剂活性成分组成为：木聚糖酶0.6g，纤维素酶0.05g，蛋白酶0.2g。按表2中处理方式对山药重茬地土壤进行处理后的结果如表10所示。表10处理后山药重茬地线虫数量通过实施例1-实施例8制备的复合生物制剂，对山药重茬地土壤进行处理，与清水浸泡土壤相比，1％或者1‰浓度的复合生物制剂浸泡土壤后，线虫死亡率大大提高，多组实验中线虫死亡率达到90％，死亡率最高达到100％。二灌溉实验选取正常地块的土壤、重茬地块的土壤、对重茬地块进行过生物制剂(浓度为1％和1‰)灌溉的重茬地块的土壤，分别对土壤深度10-20cm、20-30cm、30-40cm、40-50cm、50-60cm及60-150cm的土壤取样15g，用四层医用纱布包裹土壤并系紧，放在加水的漏斗中，加水的量以漫过土壤表面即可，漏斗下接有10cm长的胶管，胶管下端接有止水夹。静置6h。打开止水夹接漏斗下端液体10ml，放入离心机中以2000r/min离心2min，用吸管将上清液去掉至剩下2ml液体，放入培养皿内用显微镜进行观察，统计活线虫数量。其结果如表11所示。通过表11可以看出，将制剂灌溉土壤后，土壤中活线虫数量大大降低，本发明的制剂能够有效抑制线虫，保护农作物。表11山药土壤中各深度土层活线虫数量统计表当前第1页12