本发明涉及植物细胞工程技术领域，具体地，涉及一种诱导蓖麻花药外植体形成愈伤组织的方法。
背景技术：
自从guhas首次报道毛蔓陀罗花药培养获得单倍体植株以来，关于花药培养的研究迅速发展，包括中国在内的很多国家相继进行这方面的研究工作，至今已有约200多种作物通过花药培育获得了单倍体植株。
在育种领域，花药培养育种与常规杂交育种、远缘杂交育种、诱变育种以及转基因技术相结合，已经成为生物技术在作物育种中较为广泛和有效的方法之一，是作物改良和遗传学及生理、生化研究的重要方法。到目前为止，我国已有40多种植物用花药培养方法获得了花粉植株，主要有小麦、玉米、水稻、葡萄、柑桔、苹果、龙眼、橡胶、杨树及人参等一些药用植物。已经培养出80多个水稻花粉新品系和新品种，20多个小麦花粉新品种和新品系。
蓖麻是大戟科蓖麻属一年生或多年生草本植物，是世界上十大油料作物之一，具有用途广泛，经济价值高等特点，是具有特殊工业用途的重要工业油，其籽粒、叶片、茎杆、果壳综合利用价值高。目前，还缺乏有竞争性的优良品种。
长期以来由于蓖麻主要以杂交、选择、引种等传统的方式进行育种，在很大程度上限制了其发展。利用花药培养可以获得单倍体植株，再对其进行染色体加倍后，可快速获得蓖麻育种上广泛应用的纯系品种；并且从中选出的优良纯合系的后代不会发生性状分离，表现整齐一致，可显著缩短育种年限。但是目前，蓖麻花药培养还处于起步阶段，有关蓖麻花药培养的报道还很少，还存在蓖麻花药愈伤组织的诱导率低和愈伤组织质量较差等问题，严重制约了蓖麻花药离体培养的研究进展。因此，建立高效的诱导蓖麻花药外植体形成愈伤组织的组培体系，对加速蓖麻的单倍体育种及进一步发展我国的蓖麻产业都具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种诱导蓖麻花药外植体形成愈伤组织的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种诱导蓖麻花药外植体形成愈伤组织的方法，包括如下步骤：
s1.将蓖麻花药外植体置于15～30mg/l的ba溶液中浸泡10～20min；
s2.将经过s1处理的蓖麻花药外植体接种到愈伤组织诱导培养基上进行培养，获得愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基为添加了4～16mg/l的snp的ms培养基，或添加了1～2mg/l铜离子的ms培养基，或添加了3～6mg/l谷氨酰胺的ms培养基。
传统诱导蓖麻花药外植体形成愈伤组织的方法都是选择将花药外植体接种在含有各种激素的培养基上进行直接诱导，本发明的创造性在于先对花药外植体进行一个前期的浸泡处理，然后再将外植体接种在含铜离子、snp或谷氨酰胺的培养基上进行诱导愈伤组织。对花药外植体进行前期浸泡处理的好处在于高浓度的ba可以促使花药外植体以更高的效率脱分化形成更多的愈伤组织，同时提高了所获得愈伤组织的质量。
优选地，将蓖麻花药外植体置于15mg/l的ba溶液中浸泡10min。
虽然相同的外植体在不同的培养基上诱导愈伤组织的发生过程基本都是一致的，但其愈伤组织质量和诱导率则因培养基配方的不同而各异；另外，不同的外植体类型在相同的培养基上诱导的愈伤组织的质量和诱导率也是各不相同。
优选地，所述愈伤组织诱导培养基为添加了8mg/l的snp的ms培养基。
优选地，所述愈伤组织诱导培养基为添加了2mg/l铜离子的ms培养基。
优选地，所述愈伤组织诱导培养基为添加了6mg/l谷氨酰胺的ms培养基。
优选地，所述蓖麻花药外植体的获取方法为：获取无昆虫食取、饱满的且花被尚未打开的雄花，利用2%次氯酸钠对蓖麻雄花进行表面灭菌，并剥离雄花表面的花被，小心获取其中的蓖麻花药外植体。
本发明不同浓度的ba溶液的配置方法为：准确称取一定量的6-苄氨基嘌呤（6-ba，简称ba）（sigma，usa）粉末，用1mol/l的naoh溶液充分溶解，再用去离子水定容，配制成浓度分别为0、7.5、15、30、60、120mg/l的ba处理溶液。然后用1mol/l的hcl溶液调整ba处理溶液的ph至5.8～6.0，使用前用0.22微米的水系滤膜（millipore，usa）对已配制好的ba处理溶液进行过滤灭菌。
所述ms培养基：ms培养基配方的无机成分（16.5g/l硝酸铵、19g/l硝酸钾、1.7g/l磷酸二氢钾、3.7g/l七水硫酸镁、4.4g/l二水氯化钙、16.9mg/l一水硫酸锰、8.6mg/l七水硫酸锌、6.2mg/l硼酸、0.83mg/l碘化钾、0.25mg/l二水硫酸钼二钠、0.025mg/l五水硫酸铜、0.025mg/l六水氯化钴、37.3mg/l二水乙二胺四乙酸钠、27.8mg/l七水硫酸亚铁）+ms培养基配方的有机成分（2mg/l甘氨酸、0.1mg/l盐酸硫胺素、0.5mg/l盐酸吡哆醇、0.5mg/l烟酸）+100mg/l肌醇+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，用1mg/lnaoh溶液调整ph至5.8～6.0。培养基在121℃，0.1mpa的条件下灭菌15分钟。
步骤s2所述的培养条件为：室温为25℃、光照强度为2000lx、光照时间为每天12小时。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的创新性在于改变了传统诱导蓖麻花药外植体形成愈伤组织的方法，即利用高浓度ba溶液对花药外植体进行短期浸泡处理，由此促使花药外植体以更高的效率脱分化形成更多的愈伤组织。同时提高了所获得愈伤组织的质量，为蓖麻相关生物技术育种工作奠定了良好的基础。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
一种诱导蓖麻花药外植体形成愈伤组织的方法，包括如下步骤：
(1)获取花药外植体：选取无昆虫食取、饱满且花被尚未打开呈球状的蓖麻雄花。采取时间应选在温度低，光照弱的晴天上午10时左右，此时蓖麻上的花蕾无雾水可减少污染，光照较弱又可防止花药水分的丧失。将采集的雄花花蕾用纸巾包裹住，先用蒸馏水润湿，再轻轻挤掉多余的水分，然后装进玻璃瓶中，在4℃的冰箱中处理3天。在超净工作台上先用75%乙醇溶液对蓖麻雄花先消毒1min，再用2%的naclo溶液消毒20min，无菌水漂洗蓖麻雄花5次。之后用灭过菌的解剖针小心将雄花外层的花被去除，再将其中的花药小心分离，即可获得蓖麻花药外植体。
(2)将蓖麻花药外植体接种在添加不同浓度ba的ms基本培养基上，在室温为25℃、光照强度为2000lx、光照时间为每天12小时的条件下诱导愈伤组织。结果如表1所示，添加适量的ba对蓖麻花药愈伤组织的形成具有促进作用，当ba的浓度为1mg/l时，蓖麻花药愈伤组织的诱导率达最大值，为10.67%；而随着ba的浓度的继续增加，蓖麻花药愈伤组织的诱导率逐渐降低。同时，实验结果还表明，采用传统方法诱导蓖麻花药外植体形成愈伤组织的过程中，所获得愈伤组织的诱导效率较低且质量较差，体积较小。
表1为ba对蓖麻花药愈伤组织诱导效率的影响
注：数据采用spssstatistics17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较（p≦0.05），数据后字母不同表示处理间差异显著。
实施例2
一种诱导蓖麻花药外植体形成愈伤组织的方法，包括如下步骤：
(1)获取花药外植体：同实施例1。
(2)将蓖麻花药外植体置于15mg/l的ba溶液中浸泡不同时间（0～80min）；
(3)然后将蓖麻花药外植体放置在无菌吸水纸上吸去多余液体后，小心的接种至无激素ms培养基上培养30天。
实验结果表明，浸泡处理外植体的时间为10min时，外植体愈伤组织诱导效率效果最佳，达41.25%（表2）。继续延长处理时间，蓖麻花药外植愈伤组织诱导率将逐渐降低。
表2为处理时间对蓖麻花药愈伤组织诱导效率的影响
注：数据采用spssstatistics17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较（p≦0.05），数据后字母不同表示处理间差异显著。
实施例3
一种诱导蓖麻花药外植体形成愈伤组织的方法，包括如下步骤：
(1)获取花药外植体：同实施例1。
(2)将蓖麻花药外植体置于不同浓度(0～120mg/l)的ba溶液中浸泡10min。
(3)然后将蓖麻花药外植体放置在无菌吸水纸上吸去多余液体后，小心的接种至无激素ms培养基上培养30天。
实验结果表明，随着ba溶液浓度的增加，蓖麻花药外植体愈伤组织诱导效率将逐步提高，当浸泡处理外植体的浓度为15mg/l时，外植体愈伤组织诱导效果最佳，愈伤组织诱导率达最大值，为41.25%（表3）。而继续提高ba处理液浓度，蓖麻花药外植体愈伤组织诱导效率将逐步降低。同时，在采用短期高浓度ba溶液浸泡处理的方法来诱导蓖麻花药外植体形成愈伤组织的过程中，还发现所获得愈伤组织质量较好，体积较大。
表3为ba溶液浓度对蓖麻花药愈伤组织诱导效率的影响
注：数据采用spssstatistics17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较（p≦0.05），数据后字母不同表示处理间差异显著。
由上述实验结果可知，与采用传统方法诱导蓖麻花药外植体形成愈伤组织相比，采用高浓度ba溶液浸泡处理蓖麻花药外植体所诱导形成的愈伤组织诱导率显著提高（愈伤组织诱导率提高了30.58%），并且所获得的愈伤组织的质量更好，体积更大。因此，采用15mg/lba溶液对蓖麻花药外植体进行10min的浸泡处理，可以用来达到获得数量更多、质量更好的愈伤组织的目的。
实施例4
一种诱导蓖麻花药外植体形成愈伤组织的方法，包括如下步骤：
(1)获取花药外植体：同实施例1。
(2)将蓖麻花药外植体置于15mg/l的ba溶液中浸泡10min。
(3)然后将蓖麻花药外植体放置在无菌吸水纸上吸去多余液体后，小心的接种至添加了不同浓度的硝普钠（snp）（0、2、4、8、16和32mg/l）的ms培养基上培养30天。
实验结果表明，随着snp浓度的提高，蓖麻花药愈伤组织诱导率也随着提高，当snp浓度为8mg/l时，愈伤组织诱导率达最大值，为60.37%，比传统方法提高了49.70%，比经过高浓度ba溶液处理后接种至无激素ms培养基上提高了19.12%；但是继续提高snp的浓度时，愈伤组织诱导将会被抑制，诱导效率将逐步降低。
表4为snp对蓖麻花药愈伤组织诱导效率的影响
注：数据采用spssstatistics17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较（p≦0.05），数据后字母不同表示处理间差异显著。
实施例5
一种诱导蓖麻花药外植体形成愈伤组织的方法，包括如下步骤：
(1)获取花药外植体：同实施例1。
(2)将蓖麻花药外植体置于15mg/l的ba溶液中浸泡10min。
(3)然后将蓖麻花药外植体放置在无菌吸水纸上吸去多余液体后，小心的接种至添加了不同浓度的铜离子（无水硫酸铜）（0、0.5、1、2、4和8mg/l）的ms培养基上培养30天。
实验结果表明，随着铜离子浓度的提高，蓖麻花药愈伤组织诱导率也随着提高，当铜离子浓度为2mg/l时，愈伤组织诱导率达最大值，为68.36%，比传统方法提高了57.69%，比经过高浓度ba溶液处理后接种至无激素ms培养基上提高了27.11%；；但是继续提高铜离子的浓度时，愈伤组织诱导将会被抑制，诱导效率将逐步降低。
表5为铜离子对蓖麻花药愈伤组织诱导效率的影响
注：数据采用spssstatistics17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较（p≦0.05），数据后字母不同表示处理间差异显著。
实施例6
一种诱导蓖麻花药外植体形成愈伤组织的方法，包括如下步骤：
(1)获取花药外植体：同实施例1。
(2)将蓖麻花药外植体置于15mg/l的ba溶液中浸泡10min。
(3)然后将蓖麻花药外植体放置在无菌吸水纸上吸去多余液体后，小心的接种至添加了不同浓度的谷氨酰胺（0、1.5、3、6、12和24mg/l）的ms培养基上培养30天。
实验结果表明，随着gln浓度的提高，蓖麻花药愈伤组织诱导率也随着提高，当谷氨酰胺浓度为6mg/l时，愈伤组织诱导率达最大值，为54.63%，比传统方法提高了43.96%，比经过高浓度ba溶液处理后接种至无激素ms培养基上提高了13.38%；但是继续提高谷氨酰胺的浓度时，愈伤组织诱导将会被抑制，诱导效率将逐步降低。
表6为谷氨酰胺对蓖麻花药愈伤组织诱导效率的影响
注：数据采用spssstatistics17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较（p≦0.05），数据后字母不同表示处理间差异显著。
实施例7
一种诱导蓖麻花药外植体形成愈伤组织的方法，步骤(1)和(3)同实施例2，与实施例2唯一不同的地方在于步骤(2)采用不同的激素进行浸泡，本实施例包括如下4个不同的并列处理：处理1为使用15mg/l的tdz溶液浸泡花药外植体10min；处理2为使用15mg/l的naa溶液浸泡花药外植体10min；处理3为使用15mg/l的iba溶液浸泡花药外植体10min；处理4为使用15mg/l的iaa溶液浸泡花药外植体10min。四种不同处理后的愈伤组织诱导结果见表7。
表7为不同激素浸泡对蓖麻花药愈伤组织诱导效率的影响
实施例8
一种诱导蓖麻花药外植体形成愈伤组织的方法，包括如下步骤：
(1)获取花药外植体：同实施例1。
(2)将蓖麻花药外植体接种在添加不同激素的ms基本培养基上，在室温为25℃、光照强度为2000lx、光照时间为每天12小时的条件下诱导愈伤组织。本实施例包括如下2个不同的并列处理：处理1使用添加3mg/l的ba+0.2mg/l的naa的ms培养基作为愈伤组织诱导培养基；处理2使用添加2mg/l的ba+2mg/l的2,4-d的ms培养基作为愈伤组织诱导培养基；结果见表8。
表8为不同愈伤组织诱导培养基对蓖麻花药愈伤组织诱导效率的影响
实施例9
(1)获取花药外植体：同实施例1。
(2)将蓖麻花药外植体置于15mg/l的ba溶液中浸泡10min。
(3)然后将蓖麻花药外植体放置在无菌吸水纸上吸去多余液体后，小心的接种至添加不同激素的ms基本培养基上，在室温为25℃、光照强度为2000lx、光照时间为每天12小时的条件下诱导愈伤组织。本实施例包括如下4个不同的并列处理：处理1为使用添加8mg/l的snp+2mg/l铜离子的ms培养基作为愈伤组织诱导培养基；处理2为使用添加2mg/l铜离子+6mg/l谷氨酰胺的ms培养基作为愈伤组织诱导培养基；处理3为使用添加8mg/l的snp+6mg/l谷氨酰胺的ms培养基作为愈伤组织诱导培养基；处理4为使用添加8mg/l的snp+加2mg/l铜离子+6mg/l谷氨酰胺的ms培养基作为愈伤组织诱导培养基；结果见表9。
表9为不同愈伤组织诱导培养基对蓖麻花药愈伤组织诱导效率的影响
以上实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
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