抑制罗汉果CAS基因表达的方法与流程

文档序号:12020337阅读:268来源:国知局

本发明涉及植物生物领域。更具体地说,本发明涉及一种抑制罗汉果cas基因表达的方法。



背景技术:

罗汉果甜苷v萃取于广西特产经济植物——罗汉果,其甜度为蔗糖的300倍,其热量为零,具有清热润肺镇咳、润肠通便之功效,对肥胖、便秘、糖尿病等具有防治作用,目前市场对罗汉果甜苷v的需求量较大,因此需要提高种植效率来提高罗汉果甜苷v的产量以满足市场的需要。罗汉果甜苷v属于葫芦烷型四环三萜类物质,本课题组前期根据罗汉果转录组数据,已推导出甜苷v可能的生物合成途径。罗汉果甜苷v生物合成的前体物质是异戊烯二磷酸(ipp)和3,3-二甲基烯内基焦磷酸(dmapp),二者是通过甲羟戊酸(mva)和甲基赤藓糖醇磷酸化(mep)两条途径形成,mva途径发生在胞质中,mep途径发生在质体中。来源于上述两途径的ipp或dmapp经牻牛儿基焦磷酸合酶(gps)催化形成牻牛儿基焦磷酸(gpp),ipp与gpp在法呢基焦磷酸合酶(fps)的催化作用下进而形成法呢基焦磷酸(fpp),然后经角鲨烯合酶(ss)、角鲨烯环氧化酶(se)的催化形成2,3-氧化角鲨烯,2,3-氧化角鲨烯经葫芦二烯醇合酶(cs)进一步催化形成葫芦二烯醇,最后在cyp450酶和葡萄糖基转移酶的作用下,形成罗汉果甜苷v。2,3-氧化角鲨烯还可以经环阿乔醇合酶(cas)形成环阿乔醇,这是形成不同甾醇的前体物质。

异戊二烯类物质的产生受到限速酶活性的严格调控,一直被认为在其生物合成途径中起着重要的调控作用。cas竞争cs的底物(2,3-氧化角鲨烯),争夺其碳骨架,朝着植物甾醇的方向发展,间接影响了罗汉果甜苷v的合成。抑制cas基因的表达,可以间接促进罗汉果甜苷v的积累;相反,如果过表达cas基因,将促进植物甾醇的积累,而降低罗汉果甜苷v的产量。现有技术中未见有抑制罗汉果cas基因表达的报道。



技术实现要素:

本发明的一个目的是解决传统种植的罗汉果甜苷v的产量不高的问题,并提供至少后面将说明的优点。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点,提供了一种抑制罗汉果cas基因表达的方法,将罗汉果组培苗接种在茉莉酸甲酯浓度为325-400μmol/l的诱导培养基中培养28-30d。

优选的是,上述步骤中用体积分数为2%的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯配制成茉莉酸甲酯母液,并用微孔滤膜灭菌,灭菌后冷却至24-26℃,再将冷却后的茉莉酸甲酯母液添加到固体培养基中,至茉莉酸甲酯最终浓度为325-400μmol/l,得到诱导培养基。

优选的是,所述固体培养基组分为:ms+6-ba1.5mg/l+吲哚丁酸0.3mg/l+琼脂3.5g/l+蔗糖30g/l+活性炭1.0g/l。

优选的是,将罗汉果组培苗置于湿度60-66%、光照强度1400lux,光照时间8h/d,温度23±2℃条件下培养。

优选的是,用体积分数为2%的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯,将茉莉酸甲酯配成325-400μmol/l的茉莉酸甲酯溶液,喷洒于授粉后20-30d的罗汉果表面,每次喷洒至罗汉果表面滴水为止,每天喷洒三次,每隔4-6h喷洒一次,连续喷施4-6d。

优选的是,配制脱落酸和氯化钙的混合溶液,其中脱落酸的浓度为10-20mg/l,氯化钙的浓度为350-540mg/l,将脱落酸和氯化钙的混合溶液进行磁化处理,磁场强度为150-200mt,磁化处理时间为8-12min,将培养好的组培苗的根部放于磁化处理后的脱落酸和氯化钙的混合溶液中进行浸泡培养,浸泡时间为8-12h;在罗汉果幼苗定植后的第20天,再用磁化处理后的脱落酸和氯化钙的混合溶液滴施于罗汉果幼苗根部,每次滴施量为300-500ml/株,每隔3天滴施一次,共滴施5次。

优选的是,在罗汉果授粉期,每天用波长为400-420nm的ne-he激光对罗汉果花蕊进行照射,每次照射时间为2-4min,每天照射一次,连续照射三天;从授粉开始,第一天用浓度为0.02-0.04mm的硼酸钠喷施罗汉果植株,喷施50-100ml,第二天用浓度为0.02-0.05mm的钼酸铵喷施罗汉果植株,喷施50-100ml,第三天用质量浓度为0.01-0.02%的甜菜碱喷施罗汉果植株,喷施50-100ml,每5天重复循环喷施一次该三种溶液,共循环喷施6次。

优选的是,在罗汉果果实的中后期用牛皮纸袋将罗汉果果实包裹住,并向袋中通入浓度为2-3%的二氧化碳气体,其余为氮气,每次套袋3-5h,共套袋5-6次。

本发明至少包括以下有益效果:

(1)在罗汉果组培苗的培养基中添加茉莉酸甲脂,这样在罗汉果组培苗生长过程中,茉莉酸甲脂一直作用于组培苗,从而抑制罗汉果组培苗中cas基因的表达,进而促进罗汉果甜苷v的合成,且本申请人经过大量试验发现茉莉酸甲酯浓度为325-400μmol/l最适宜抑制罗汉果组培苗中的cas基因表达;(2)在授粉后20-30d的罗汉果表面喷施茉莉酸甲脂溶液,在罗汉果果实膨大期用茉莉酸甲脂去刺激罗汉果进而抑制罗汉果cas基因的表达,提高罗汉果甜苷v的含量;

(2)对脱落酸和氯化钙的混合溶液进行磁化处理,磁化处理后,有助于该混合溶液在生物体内有序运动,提高其作用效果,用磁化处理后的脱落酸和氯化钙的混合溶液喷施罗汉果幼苗植株和滴施罗汉果的根部,使得罗汉果幼苗充分吸收脱落酸和氯化钙,脱落酸和氯化钙的工作于罗汉果幼苗,能够协调罗汉果植株内的代谢,促进代谢平衡,且能调控植物甾醇的合成量,从而抑制cas基因的表达,促进罗汉果甜苷v的合成;

(3)在花期对罗汉果进行激光处理,授粉后的罗汉果植株吸收了光子,分子内发生能级跃迁,进而影响dna分子的总量,对罗汉果cas基因的表达起抑制作用,再在一个较长的时间内对罗汉果分别喷施硼酸钠、钼酸铵和甜菜碱,这三者共同作用对罗汉果有氧呼吸和能量代谢过程有良好的保护作用,同时能维持细胞渗透平衡,调控限速酶的活性,限制植物甾醇的产生,抑制罗汉果cas基因的表达,提高罗汉果甜苷v的含量;将硼酸钠、钼酸铵和甜菜碱分开每天喷施,这样可以让罗汉果能更好地吸收所喷施的物质,并逐渐发挥作用;

(4)在罗汉果中后期进行套袋处理,可以提高罗汉果甜苷v积累量。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现,部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是,下述实施方案中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。

实施例1:

一种抑制罗汉果cas基因表达的方法,将罗汉果组培苗接种在茉莉酸甲酯浓度为325μmol/l的诱导培养基中,置于湿度60%、光照强度1200lux,光照时间8h/d,温度23±2℃条件下培养30d。其中固体培养基组分为:ms+6-ba1.5mg/l+吲哚丁酸0.3mg/l+琼脂3.5g/l+蔗糖30g/l+活性炭1.0g/l;加入茉莉酸甲酯的方法为:用体积分数为2%的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯配制成茉莉酸甲酯母液,并用0.22μm的微孔滤膜灭菌,灭菌后冷却至24-26℃,再将冷却后的茉莉酸甲酯母液添加到上述固体培养基中,至茉莉酸甲酯最终浓度为325μmol/l,得到诱导培养基。

实施例2:

一种抑制罗汉果cas基因表达的方法,将罗汉果组培苗接种在茉莉酸甲酯浓度为375μmol/l的诱导培养基中,置于湿度65%、光照强度1400lux,光照时间8h/d,温度23±2℃条件下培养30d。其中固体培养基组分为:ms+6-ba1.5mg/l+吲哚丁酸0.3mg/l+琼脂3.5g/l+蔗糖30g/l+活性炭1.0g/l;加入茉莉酸甲酯的方法为:用体积分数为2%的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯配制成茉莉酸甲酯母液,并用0.22μm的微孔滤膜灭菌,灭菌后冷却至24-26℃,再将冷却后的茉莉酸甲酯母液添加到上述固体培养基中,至茉莉酸甲酯最终浓度为375μmol/l,得到诱导培养基。

实施例3:

一种抑制罗汉果cas基因表达的方法,将罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯浓度为400μmol/l的固体培养基中,置于湿度66%、光照强度1400lux,光照时间8h/d,温度23±2℃条件下培养30d。其中固体培养基组分为:ms+6-ba1.5mg/l+吲哚丁酸0.3mg/l+琼脂3.5g/l+蔗糖30g/l+活性炭1.0g/l;加入茉莉酸甲酯的方法为:用体积分数为2%的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯配制成茉莉酸甲酯母液,并用0.22μm的微孔滤膜灭菌,灭菌后冷却至24-26℃,再将冷却后的茉莉酸甲酯母液添加到上述固体培养基中,至茉莉酸甲酯最终浓度为400μmol/l,得到诱导培养基。

实施例4:

在实施例3的基础上,用体积分数为2%的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯,将茉莉酸甲酯配成浓度为365μmol/l的茉莉酸甲酯溶液,喷洒于授粉后30d的罗汉果表面,每次喷洒至罗汉果表面滴水为止,每天喷洒三次,每隔4h喷洒一次,连续喷施6d。

实施例5:

在实施例3的基础上,用体积分数为2%的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯,将茉莉酸甲酯配成浓度为325μmol/l的茉莉酸甲酯溶液,喷洒于授粉后25d的罗汉果表面,每次喷洒至罗汉果表面滴水为止,每天喷洒三次,每隔6h喷洒一次,连续喷施5d。

实施例6:

在实施例3的基础上,用体积分数为2%的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯,将茉莉酸甲酯配成浓度为400μmol/l的茉莉酸甲酯溶液,喷洒于授粉后20d的罗汉果表面,每次喷洒至罗汉果表面滴水为止,每天喷洒三次,每隔5h喷洒一次,连续喷施4d。

实施例7:

在实施例3的基础上,配制脱落酸和氯化钙的混合溶液,其中脱落酸的浓度为10mg/l,氯化钙的浓度为350mg/l,将脱落酸和氯化钙的混合溶液进行磁化处理,磁场强度为150mt,磁化处理时间为12min,将培养好的组培苗的根部放于磁化处理后的脱落酸和氯化钙的混合溶液中进行浸泡培养,浸泡时间为12h;在罗汉果幼苗定植后的第20天,再用磁化处理后的脱落酸和氯化钙的混合溶液滴施于罗汉果幼苗根部,每次滴施量为500ml/株,每隔3天滴施一次,共滴施5次。

实施例8:

在实施例3的基础上,配制脱落酸和氯化钙的混合溶液,其中脱落酸的浓度为20mg/l,氯化钙的浓度为435mg/l,将脱落酸和氯化钙的混合溶液进行磁化处理,磁场强度为200mt,磁化处理时间为8min,将培养好的组培苗的根部放于磁化处理后的脱落酸和氯化钙的混合溶液中进行浸泡培养,浸泡时间为10h;在罗汉果幼苗定植后的第20天,再用磁化处理后的脱落酸和氯化钙的混合溶液滴施于罗汉果幼苗根部,每次滴施量为300ml/株,每隔3天滴施一次,共滴施5次。

实施例9:

在实施例3的基础上,配制脱落酸和氯化钙的混合溶液,其中脱落酸的浓度为15mg/l,氯化钙的浓度为540mg/l,将脱落酸和氯化钙的混合溶液进行磁化处理,磁场强度为180mt,磁化处理时间为10min,将培养好的组培苗的根部放于磁化处理后的脱落酸和氯化钙的混合溶液中进行浸泡培养,浸泡时间为8h;在罗汉果幼苗定植后的第20天,再用磁化处理后的脱落酸和氯化钙的混合溶液滴施于罗汉果幼苗根部,每次滴施量为410ml/株,每隔3天滴施一次,共滴施5次。

实施例10:

在实施例9的基础上,在罗汉果授粉期,每天用波长为400nm的ne-he激光对罗汉果花蕊进行照射,每次照射时间为2min,每天照射一次,连续照射三天;从授粉开始,第一天用浓度为0.02mm的硼酸钠喷施罗汉果植株,喷施100ml,第二天用浓度为0.05mm的钼酸铵喷施罗汉果植株,喷施50ml,第三天用质量浓度为0.02%的甜菜碱喷施罗汉果植株,喷施50ml,每5天重复循环喷施一次该三种溶液,共循环喷施6次。在罗汉果果实的中后期用牛皮纸袋将罗汉果果实包裹住,并向袋中通入浓度为3%的二氧化碳气体,其余为氮气,每次套袋3h,共套袋5次。

实施例11:

在实施例9的基础上,在罗汉果授粉期,每天用波长为420nm的ne-he激光对罗汉果花蕊进行照射,每次照射时间为4min,每天照射一次,连续照射三天;从授粉开始,第一天用浓度为0.04mm的硼酸钠喷施罗汉果植株,喷施50ml,第二天用浓度为0.02mm的钼酸铵喷施罗汉果植株,喷施100ml,第三天用质量浓度为0.01%的甜菜碱喷施罗汉果植株,喷施100ml,每5天重复循环喷施一次该三种溶液,共循环喷施6次。在罗汉果果实的中后期用牛皮纸袋将罗汉果果实包裹住,并向袋中通入浓度为2%的二氧化碳气体,其余为氮气,每次套袋5h,共套袋6次。

实施例12:

在实施例9的基础上,在罗汉果授粉期,每天用波长为420nm的ne-he激光对罗汉果花蕊进行照射,每次照射时间为3min,每天照射一次,连续照射三天;从授粉开始,第一天用浓度为0.03mm的硼酸钠喷施罗汉果植株,喷施70ml,第二天用浓度为0.04mm的钼酸铵喷施罗汉果植株,喷施60ml,第三天用质量浓度为0.02%的甜菜碱喷施罗汉果植株,喷施80ml,每5天重复循环喷施一次该三种溶液,共循环喷施6次。在罗汉果果实的中后期用牛皮纸袋将罗汉果果实包裹住,并向袋中通入浓度为3%的二氧化碳气体,其余为氮气,每次套袋4h,共套袋6次。

为了说明本发明的有益效果,本发明的申请人针对不同方法或实施例得到的罗汉果果实,针对cas基因表达量以及甜苷v含量进行测定,具体方法以及结果如下:

1、cas基因表达量测定方法:利用abi7500实时荧光定量pcr仪,采用qrt-pcr检测cas基因的表达。

步骤一、样品前处理:采集罗汉果果实,挑取果肉,切成2-4mm小块并分别用锡箔纸包好,立即置于液氮中速冻,保存于-80℃备用。

步骤二、先采用改良trizol法提取罗汉果果实总rna;

步骤三、将rna反转录为cdna的反应体系为rna10.0μl,primescriptrtenzymemixi1.0μl,rtprimermix1.0μl,5×primescriptbuffer24.0μl,rnasefreedh2o4.0μl;反应条件为37℃(15min)→85℃(5s)→4℃;

步骤四、所述步骤三采用primerpremier5.0软件设计引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其中,cas引物序列为:

fp:tgctgttgggtggaggat,rp:gcttagttgacatgatggcttg;

内参基因用ubq5,序列为:

fp:ataaaagacccagcaccacattc,rp:cccttgccgactacaacatcc;

步骤五、qrt-pcr反应体系(20μl)为sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)10.0μl,pcrforwardprimer(10μm)0.8μl,pcrreverseprimer(10μm)0.8μl,roxreferencedyeofdyeii(50×)0.4μl,template2.0μl,dh2o6.0μl。反应条件为95℃(30s),接着进行40个cycles[95℃(5s),95℃(34s)]。

2、罗汉果甜苷v含量:采用高效液相色谱法,具体方法参考《广西中医学院学报》第2007年04期上发表的“hplc测定罗汉果中罗汉果甜苷v的含量”一文。

用常规方法、实施例3、实施例5、实施例9以及实施例12的方法种植罗汉果,常规方法种植作为对照组,在每种方法种植的不同罗汉果植株上共摘取30枚罗汉果,进行试验求平均值得到的cas基因表达量和罗汉果甜苷v含量如表1所示:

表1

由表1可以看出,实施例3的罗汉果cas基因表达量和罗汉果甜苷v含量明显高于对照组,由此可见在罗汉果组培面的固体培养基中增加茉莉酸甲脂能明显抑制罗汉果cas基因的表达,从而显著提高罗汉果甜苷v的含量。

实施例5是在实施例3的基础上在授粉后的罗汉果上喷施茉莉酸甲脂溶液,从表1中可以看出,实施例5的罗汉果cas基因表达量和罗汉果甜苷v含量明显低于实施例3,因此可以说明在授粉后对罗汉果喷施茉莉酸甲脂溶液也能有效地抑制罗汉果cas基因表达,进而提高罗汉果甜苷v含量。

实施例9是在实施例3的基础上,用磁化处理后的脱落酸和氯化钙对罗汉果幼苗进行喷施和滴施,表1可以看出,实施例9的罗汉果cas基因表达量低于实施例3,而罗汉果甜苷v含量明显高于实施例3,这说明实施例9的方法可以抑制罗汉果cas基因的表达和提高罗汉果甜苷v含量。

实施例12是在实施例9的基础上,对罗汉果进行激光照射处理,同时喷施硼酸钠、钼酸铵以及甜菜碱,且对罗汉果进行了套袋处理,由表1可以看出,实施例12的罗汉果cas基因表达量低于实施例9,而罗汉果甜苷v含量明显高于实施例3,这说明实施例9的方法对抑制罗汉果cas基因的表达和提高罗汉果甜苷v含量有明显效果。

尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

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