一种甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系的选育方法及在甘蓝型油菜育种上的应用与流程

文档序号：12927225阅读：1132来源：国知局

本发明属于油菜育种技术领域，具体涉及一种基于杂交、姊妹交、自交常规育种技术和分子标记辅助选择技术选育甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系的方法。

背景技术：

油菜具有明显的杂种优势，是国内外应对食用植物油短缺、开拓可再生生物能源最具潜力油料作物。萝卜细胞质雄性不育ogucms是日本小仓于1968年在萝卜中发现的不育源而建立的细胞质雄性不育系统，由于该不育系统不育性非常稳定、彻底，在十字花科作物杂种优势利用中具有非常重要的价值，目前已经是甘蓝型油菜杂种优势利用的一条理想途径。但是由于其恢复基因仅存在于萝卜中，在整个芸薹属作物没有可利用的恢复源，油菜ogucms恢复基因必须从萝卜进行转育。

heyn于1976年通过属间杂交成功将萝卜的恢复基因导入到甘蓝型油菜(heyn.1976)。随后，法国的pelletier等人通过原生质体融合技术，也将欧洲萝卜中的恢复基因导入到甘蓝型油菜中。但由于恢复基因从萝卜转移至甘蓝型油菜时，冗余的萝卜片段也渗入到油菜基因组，导致恢复材料存在恢复能力不理想，部分雌性不育以及较高硫甙与恢复基因连锁等问题。由于渗入到油菜基因组的外源萝卜片段很难从外观进行鉴定，因此恢复系转育与改良必须借助分子标记技术。但目前国外的ogucms恢复基因相关标记技术大都实施了专利保护，限制了其应用范围。随着油菜分子生物学研究的不断深入，基因组测序技术得以完善，测序成本也进一步下降，分子标记的开发和辅助选择技术应用日益成熟和实用化，这为我国自主研发甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复材料提供了技术支撑。我国于上世纪80年代引入ogura-cms，全国各油菜育种单位随后开展了大量研究。如李旭峰曾报道将恢复基因从萝卜变种蓝花子导入油菜，但获得材料的恢复基因均处于附加体上，不能稳定遗传；刘绚霞2012年利用已有甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系为母本与已审定冬油菜品种进行杂交，筛选出农艺性状改善的新型恢复系，但是其研究只是常规杂交和纯合选育，不能确定其恢复源的来源。由于转育恢复系非常困难，我国一直缺乏可利用的恢复源。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种将基因组重测序技术和比较基因组学技术开发的目标基因特异标记，与常规杂交、回交、混合选择、自交育种技术相结合应用的甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系培育方法以及该恢复系在后续的应用，以解决目前我国甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系选育过程存在的远缘杂交外源目标基因遗传力严重偏低、性状难以纯合稳定等问题，为甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系的选育提供一种快速、有效的选育方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系的选育方法，其步骤包括，外源目标片段特异分子标记的开发，利用杂交、回交、姊妹交、自交常规育种技术与分子标记辅助选择技术结合应用培育新的甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系，具体步骤包括：

1)利用甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复材料clr650为母本与甘蓝型油菜常规品系a进行杂交，获得f1群体；选择多株f1代植株与甘蓝型油菜常规品系a作为轮回亲本进行回交，构建bc1分离群体；

2)在幼苗期，利用至少1个外源萝卜片段特异标记对bc1分离群体进行分子标记辅助选择，拔除标记分析结果呈阴性的单株；在花期选择多株bc1分离群体中表型接近(即性状相似)甘蓝型油菜常规品系a的单株作为母本，继续用甘蓝型油菜常规品系a进行回交；重复上述步骤直至获得甘蓝型油菜clr650的bc4育性分离群体；

3)拔除bc4育性分离群体中的不育单株，将保留的可育单株全部在隔离区进行混合授粉和收获，并在盛花期调查后代群体的育性表现，直至获得可育株所占比例超过75％的群体；

4)将可育株比例超过75％的分离群体中可育株全部隔离自交，自交后代中继续选择可育株全部隔离自交，直至获得育性不分离、表型一致的甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系clr095。

优选的，根据上述甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系的选育方法，所述步骤1)中甘蓝型油菜常规品系a为20b。该常规品系基因组是相对纯合的状态，杂交后代不会出现剧烈分离现象，最大程度上减少了后代性状分离给恢复系纯合稳定造成的影响。另外，常规品系不含有杂交种携带的其他类型的恢复基因，同时也没有其他不良的细胞质效应，更有利于后代群体分子标记筛选和目标株系的获得。

优选的，根据上述甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系的选育方法，所述步骤1)中选择多株f1代植株与甘蓝型油菜常规品系a作为轮回亲本进行回交是指选择2-4株f1代植株与甘蓝型油菜常规品系20b作为轮回亲本进行回交。

优选的，根据上述甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系的选育方法，所述步骤1)中构建bc1分离群体是指构建群体大小为200-250个单株的bc1分离群体。

优选的，根据上述甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系的选育方法，所述步骤2)中选择多株bc1分离群体中表型接近甘蓝型油菜常规品系a的单株作为母本是指选择bc1分离群体中8-10株表型接近20b的单株作为母本。

优选的，根据上述甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系的选育方法，所述步骤4)中，隔离自交的代数为2-3代。

如上任一项所述的甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系的选育方法中，所述外源萝卜片段特异标记的制备方法包括：

a)利用甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复材料clr650为母本与甘蓝型油菜常规品系a进行杂交，获得f1群体，选择多株f1群体植株进行套袋隔离自交，获得f2育性分离群体单株，并提取各单株的基因组总dna；在盛花期调查f2群体单株育性，分别建立可育株和不育株基因混合池；对甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复材料clr650进行全基因组重测序，将测序结果与萝卜基因组草图和萝卜细胞质不育恢复基因序列进行比对，获得clr650的恢复基因及其旁侧外源萝卜序列信息，根据目标区域设计特异引物；

b)将所获得的特异引物利用所述基因混合池筛选，保留可育株基因混合池pcr扩增呈阳性、不育株基因混合池扩增呈阴性的引物，并将筛选到的引物在f2育性分离群体单株上进行共分离验证，pcr扩增阳性表现与育性表现共分离的引物作为外源萝卜片段特异标记引物。

优选的，根据上述甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系的选育方法，所述步骤a)中选择多株f1群体植株进行套袋隔离自交是指选择6-8株f1群体植株进行套袋隔离自交。

我们对湖南省作物研究所自主培育的新型甘蓝型油菜ogucms恢复材料clr650进行了大量分子生物学和细胞遗传学分析，结果表明该恢复材料染色体组已趋于稳定，其育性恢复基因为rfo基因。基于clr650杂交后代育性偏分离严重、性状难以稳定的问题，我们通过基因组重测序和参考基因组序列比对自主开发了外源萝卜片段的特异分子标记。所述外源萝卜片段特异标记包括clr9-1～clr9-20中的一种或多种，所述clr9-1-clr9-20的核酸序列分别见seqidno：1～seqidno：20。

作为一个总的技术构思，本发明还提供如上所述选育方法获得的甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系clr095在甘蓝型油菜育种上的应用，采用甘蓝型油菜不育系及其保持系和恢复系clr095，通过三系配套方法进行杂交种生产。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1.利用本发明获得的新型甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系遗传稳定，在一定程度上剔除了clr650携带的远缘杂交不利性状，可为我国提供具有开创意义的甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复源；

2.本发明涉及的分子标记均为根据clr650基因组重测序结果自主开发的外源萝卜特异标记，可为我国甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复源转育提供新的分子标记技术支撑；

3.本发明的采用常规育种手段与分子标记辅助选择的方法进行选育，可以在苗期进行初步选择，一方面，可以提早拔除非目标单株，减少了试验用地和后期表型鉴定的工作量；另一方面，可大大提高选择效率与准确性，及时排除选育过程中出现机械混杂和生物学混杂的影响；

4.本发明采用先回交定向转育，再通过混合选择，最大程度增加目标基因纯合的几率，最后通过自交纯合稳定的育种策略，可克服远缘杂交带来的恢复基因遗传力严重偏低、性状难以稳定等的障碍，又能避免连续多代自交导致的自交衰退现象，而且实践证明该策略更容易获得纯合稳定的萝卜细胞质不育恢复系。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例中甘蓝型油菜ogucms恢复系clr095的转育流程示意图。

图2是本发明开发的萝卜特异标记在甘蓝型油菜萝卜质不育恢复材料clr650的f2育性分离群体基因混合池间的pcr扩增

图3是本发明开发的萝卜特异标记在甘蓝型油菜萝卜质不育恢复材料clr650的f2分离群体单株pcr扩增结果，图中f代表可育株，s代表不育株。

图4是本发明中获得的甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系clr095与clr650的对比，图4中：a：苗期叶片对比；b：花器官对比；c角果对比。图4是以clr650作为比较对象，由图4可见clr095的叶片、花和角果长度均发生明显改变。

图5是本发明中获得的甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系clr095与clr650的对比。图5是以clr650作为比较对象，由图5可见clr095的叶片、花和角果长度均发生明显改变。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

本发明实施例的甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系clr095的选育方法如附图1所示，具体包括以下步骤。

1.萝卜细胞质雄性不育恢复基因特异分子标记和连锁标记开发

1.1实施材料

甘蓝型油菜萝卜质不育恢复材料clr650(为萝卜雄性不育细胞质，叶缘为锯齿形，叶尖为较尖，叶色深绿，角果粗短，见文献：陈卫江等，甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复材料的创制，中国农业科学，2012，45(8)：1465-1474)，该材料是由萝-蓝(raphanobrassica)(aaccrr，2n＝56)与甘蓝型油菜通过嫁接技术杂交选育而来，染色体数目在38-40之间。其细胞质为萝卜雄性不育细胞质，细胞核含有clr650的萝卜细胞质恢复基因rfo，因此表现为正常可育；甘蓝型油菜常规品系20b(为常规甘蓝型油菜细胞质，叶缘为缺刻，叶尖为中等，叶色浅绿，角果细长，见文献：李莓等，甘蓝型杂交油菜新品种丰油730的选育，湖南农业科学，2008，(6)：19-20)，是半冬性甘蓝型油菜双低常规品系。

1.2萝卜细胞质雄性不育恢复基因f2分离群体的构建

2011年春，在clr650进入初花期时，将clr650植株上尚未开放的花蕾摘除雄蕊后与20b进行杂交，得到f1种子；2011年5月中旬将获得的f1种子播种在气候室营养钵，获得20个f1植株，并在初花期选择长势健壮的8个单株，用羊皮纸袋子进行套袋隔离自交，获得f2分离群体种子；2011年10月份选择1份上述f2种子在长沙水旱轮作后的油菜试验田进行播种，获得f2育性分离群体植株，在3-5叶期分单株进行吊牌，并从每个单株上选取2-3cm²大小的幼嫩叶片进行总dna提取，提取方法参照李佳等(李佳等，一种有效提取油菜叶片总dna的方法，华中农业大学学报，1994，13(5)：521-523)报道的方法进行，采用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测dna质量，用紫外分光光度计(pharmaciabiotech,genequantii)检测dna浓度。在次年油菜进入盛花期时，调查、记录f2群体中各个单株的育性表现。本发明获得的f2分离群体共有210个单株，其中可育单株为74株，不育单株为136株。根据育性调查结果从f2分离群体中，分别选取10个可育单株和10个不育单株的总dna进行等量混合，分别获得1个可育株混合池和1个不育株混合池，为目标片段分子标记开发备用。

1.3基于clr650基因组重测序的萝卜细胞质不育恢复基因特异引物设计

将clr650的种子播种于营养钵，但生长至3-4片真叶时，取3-4cm²幼嫩叶片，送由上海欧易生物医学科技有限公司利用illuminamiseq平台进行重测序分析，获得单向67.169g碱基数和447,797,399片段数的测序数据。其中，cleanreads比率达到96.09％，高质量碱基的比例达到99.21％，>71％的基因组达到50×以上的测序深度。然后将这些序列分别与ncbi上已公布的萝卜基因组和萝卜细胞质不育恢复基因rfo所在127kb的区域进行比对，获得萝卜胞质不育恢复基因所在萝卜基因组scaffold131的序列信息，并推断出clr650中外源萝卜质不育恢复基因位于萝卜基因组r9染色体上。

1.4萝卜细胞质雄性不育恢复基因特异分子标记筛选与验证

针对萝卜r9染色体已公布的scaffold131序列和rfo所在127kb的区域序列,用primer3引物设计工具共设计了80对萝卜特异引物。首先将该80对引物在步骤1.2中的可育株混合池和不育株混合池进行pcr扩增，筛选可育株混合池表现阳性、不育株混合池表现阴性的引物，然后将获得的引物在f2育性分离群体上进行共分离验证(参见附图2、3)，通过验证确定20个标记为外源萝卜片段的特异标记：clr9-1、clr9-2、clr9-3、clr9-4、clr9-5、clr9-6、clr9-7、clr9-8、clr9-9、clr9-10、clr9-11、clr9-12、clr9-13、clr9-14、clr9-15、clr9-16、clr9-17、clr9-18、clr9-19、clr9-20(每个特异标记的引物序列和产物如下表1，2所示)。

表1：本发明的萝卜特异标记的引物序列及产物片段的大小

表2本发明的萝卜特异标记的pcr产物序列

2.萝卜细胞质雄性不育恢复系的选育

2.1分子标记辅助选择回交选育

2011年春，将上述步骤1.2中获得的f1植株与20b进行回交，得到bc1种子；2011年10月份将获得的bc1种子在长沙油菜试验田播种后，获得clr650/20b的bc1分离群体植株。由于萝卜质不育恢复基因在clr650后代中存在严重的偏分离现象，本发明利用个步骤1.4中获得的外源萝卜片段特异标记clr9-3、clr9-12、clr9-18组合，对bc1分离群体中的3-5叶期便开始选择，拔除标记分析结果均呈阴性的单株。2012年春油菜盛花期，对上述保留的可育单株进行育性调查，将表型性状接近20b的可育植株主花序，用羊皮纸袋子进行套袋隔离自交，并将分枝上未开放的花蕾去掉雄蕊后与20b进行回交，获得bc2分离群体的种子。成熟期调查各回交单株在天然授粉条件下的角果形状、角果长度和每角粒数，并分单株收获其天然授粉的种子，并利用近红外分析仪进行含油量、芥酸含量和硫甙含量三个品质性状分析，保留表型和品质性状最接近20b的单株，继续用20b作为轮回亲本回交，直至获得表型与20b一致，品质性状得到改良的回交群体。

本发明从bc1分离群体中163个单株中，获得31个分子标记分析结果均呈阳性的可育单株，其中10个表型性状相对接近20b。利用近红外分析仪(matrix-1,bruker,germany,opus/quant5.5software)对获得的10个bc1可育单株的自交结实种子进行含油量、芥酸含量和硫甙含量三个品质性状分析(结果见表3)，保留硫甙含量最低、含油量在35％以上、芥酸含量小于5％回交单株的bc2分离群体种子。2012年5月上旬，将上述bc2分离群体种子，播种于青海西宁油菜试验田，获得bc2分离群体植株，并继续按照bc1的转育方法，进一步进行回交，直至获得表型一致的bc4分离群体植株。本发明2014年在青海获得了表型相对一致的bc4分离群体植株，该分离群体共191个单株，其中52个单株表现正常可育和139个单株表现为萝卜细胞质雄性不育。

表3本发明获得的甘蓝型油菜萝卜质不育恢复材料bc1-bc4群体中当选可育单株品质分析结果

2.2甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系纯合、稳定

在盛花期，根据初花期育性调查结果，将步骤2.1中获得的bc4分离群体中的不育单株拔除，将保留的可育株全部进行隔离混合授粉，成熟后进行混合收获，下一代继续保留分离群体中可育株进行隔离混合授粉，直至获得可育株比例超过75％的分离群体。然后将获得的分离群体中的所有可育单株用羊皮纸套袋隔离自交，直至获得自交育性不分离的株系，即新的甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系。

本发明于2014年春将保留的54个可育株全部进行隔离混合授粉，成熟后进行混合收获。2014年10月份将混合收获的种子播种于长沙油菜试验田，获得155个单株的育性分离群体，2015年盛花期，群体单株育性调查表明可育株比例在30％左右，1个分离群体(田间编号14q017)可育株比例在50％左右；选择分离群体14q14中5个可育株继续进行成对兄妹交，获得10个兄妹交分离群体。2014年10月份将10个分离群体播种于湖南长沙油菜试验田，次年盛花期调查各群体的育性表现，有8个分离群体(田间编号14c041、14c043、14c044、14c045、14c046、14c047、14c048、14c050)可育株比例在30％左右，1个分离群体(田间编号14q042)可育株比例在50％左右；1个分离群体(田间编号14c049)可育株比例在70％左右；将分离群体14q049中的所有可育单株用羊皮纸袋子隔离自交，获得32个自交株系的种子。2015年5月份将上述32个自交株系的种子播种于青海西宁油菜试验田，盛花期时对各个自交株系进行育性调查，获得一个可育株比例在90％左右的自交株系(田间编号15q028)。将株系15q028的可育单株用羊皮纸袋子隔离自交，获得28个自交株系的种子。2015年10份，将上述28个自交株系的种子播种于湖南长沙油菜试验田。次年盛花期时，对各个自交株系进行育性调查，获得一个全可育的自交株系(田间编号15c048)，利用近红外分析仪(matrix-1,bruker,germany,opus/quant5.5software)对株系15q028单株自交结实种子进行含油量、芥酸含量和硫甙含量三个品质性状分析表明，其含油量为38.90％，硫苷含量为68.65μmol/g，芥酸含量为0.7％。

2016年10份将株系15c048的自交种子播种于湖南长沙油菜试验田，次年盛花期育性调查育性调查表明该株系单株育性全部正常(田间编号16c095)，该株系名称为甘蓝型油菜萝卜质不育恢复系clr095。

2.3甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复系的性状调查

将步骤2.2获得的恢复系clr095在自然条件下单行区播种，2次重复，行距为0.27m，株距为0.15m(每行10株)，并分别以clr650和20b为对照。苗期考察叶色、叶缘形状，花期自由授粉，并考察花瓣形状和着生状态、成熟期考察株高、一次分枝数、一次分枝角果数、角果长度、每角果粒数，并分析含油量、芥酸含量和硫甙含量三个品质性状，具体结果见表4。本发明获得的恢复系clr095在较大程度上了去除了基因组中外源冗余萝卜片段的不利影响，在品质、叶型、叶色和角果形状等表型农艺性状明显区别于原始的甘蓝型油菜萝卜质不育恢复材料clr650(参见附图4、图5和表4)，说明本发明的育种方法在选育甘蓝型油菜萝卜质恢复系上是行之有效的。

表4甘蓝型油菜萝卜质不育恢复系clr095的性状表现