本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种保存脂肪样本的保存液。
背景技术：
间充质干细胞（mscs）是一种具有多向分化潜能的干细胞，具有分化为多种中胚层细胞系的潜能，包括成骨细胞，脂肪细胞，软骨细胞等。在机体正常的损伤修复过程中，mscs可以在趋化因子的诱导下，招募至损伤部位，在局部增殖、分化，并通过旁分泌作用参与损伤修复与组织再生。脂肪组织来源的mscs易于分离和体外扩增，在经过多次分裂传代后仍保持多向分化潜能，是一种非常理想的细胞治疗和再生医学的种子细胞。脂肪组织分布广泛，采集容易，无伦理问题，采集基本无痛苦，且可以多次采集。
脂肪mscs制备过程包括组织样本的采集、运输、交接、检测、分离、冻存、复苏、原代培养和传代培养等诸多步骤，在脂肪样本采集后到分离前需要运输、交接和检测三个步骤，实际操作中需要存放较长的时间。脂肪组织样本一旦采集，脱离了原有的体内环境，其中的mscs的活性会受很多因素的影响，诸如时间、温度、渗透压等。目前脂肪组织样本很多情况下需要异地采集，运输、交接和检测三个步骤所用的时间就更长，组织样本需存放的时间较长，影响因素就更加的复杂。国内生物学领域对脂肪组织样本的保存多采用直接装瓶或者补加基础培养基的方法。直接装瓶脂肪组织样本的保存时间一般少于24小时，给脂肪组织样本的运输、交接和检测带来了不小的时间压力，迫切需要改进其保存方法。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术中脂肪样本保存时间短、干细胞获得率和活性受影响的问题，提供了一种脂肪保存液，该脂肪保存液配比简单，成本低廉，使用方便。利用本发明脂肪保存液可以保存脂肪组织样本内干细胞的活性，在0~8℃的情况下有效保存至少120小时，分离出的干细胞活性受时间的影响很小，大大减少了组织样本从采集到制备的时间限制，并能有效降低污染概率。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种脂肪保存液，每升脂肪保存液由如下成分按重量组成：高糖dmem干粉培养基13.4g、碳酸氢钠2.438g、胰岛素2～10mg、青霉素100～200mg、链霉素100～200mg、两性霉素2.5～5mg、阿司匹林200~400mg、维生素c300～700mg、白藜芦醇7～12mg、淫羊藿苷2～10mg、氢化可的松20～40ug、vegf10～20μg、igf-i5～10μg、epo5～10μg，余量为注射用水。
上述一种脂肪保存液，其制备方法包括以下步骤：
(1)将高糖dmem干粉培养基13.4g倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器。加注射用水至950ml，轻微搅拌溶解；
(2)加入2.438g碳酸氢钠；
(3)轻微搅拌溶解，加注射用水至1l；
(4)用1mol/l氢氧化钠溶液或者1mol/l盐酸溶液调节ph值至中性；
(5)依次分别加入胰岛素2～10mg、青霉素100～200mg、链霉素100～200mg、两性霉素2.5～5mg、阿司匹林200~400mg、维生素c300～700mg、白藜芦醇7～12mg、淫羊藿苷2～10mg、氢化可的松20～40ug、vegf10～20μg、igf-i5～10μg、epo5～10μg，充分混匀；
(6)0.22um滤膜过滤除菌制得本发明脂肪保存液，分装，冷冻保存；使用时提前置于0~8℃解冻即可。
本发明脂肪保存液，其中高糖dmem和碳酸氢钠是维持组织内外细胞的渗透平衡、维持ph值，保持脂肪组织湿润状态和提供营养成分；青霉素、链霉素、两性霉素可防止细菌、霉菌等污染，并可消除已发生的污染；维生素c、白藜芦醇、淫羊藿苷是抗氧化剂，可保持脂肪活性；氢化可的松抑制免疫，保护脂肪组织样本中干细胞活性；胰岛素促进脂肪对糖的吸收和利用；细胞因子如vegf、igf-i、epo，可保持增加脂肪组织中干细胞活性。
本发明脂肪保存液制备简便，成本低廉、使用方便，使采集后的组织样本在运输、交接、分离前检测等过程中，能够在较长时间内有效保持其中干细胞的活性，并能防止和去除污染，提高效率。
具体实施方式
下面对本发明作进一步详细说明。
实施例一
本发明提供的一种脂肪保存液，每升脂肪保存液由如下成分按重量组成：高糖dmem干粉培养基13.4g、碳酸氢钠2.438g、胰岛素10mg、青霉素200mg、链霉素200mg、两性霉素5mg、阿司匹林400mg、维生素c700mg、白藜芦醇12mg、淫羊藿苷10mg、氢化可的松40ug、vegf20μg、igf-i10μg、epo10μg，余量为注射用水。
该脂肪保存液的制备方法如下：
(1)将高糖dmem干粉培养基（品牌：gibco，货号12100-046）13.4g倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器。加注射用水至950ml，轻微搅拌溶解；
(2)加入2.438g碳酸氢钠；
(3)轻微搅拌溶解，加注射用水至1l；
(4)用1mol/l氢氧化钠溶液或者1mol/l盐酸溶液调节ph值至中性；
(5)依次分别加入胰岛素10mg（品牌sigma,货号i0908）、青霉素200mg（品牌amresco，货号0242）、链霉素200mg（品牌amresco，货号0382）、两性霉素5mg（品牌amresco，货号e437）、阿司匹林400mg（sigma，a2093-100g）、维生素c700mg（sigma，a5960-10mg）、白藜芦醇12mg（sigma，r5010-100mg）、淫羊藿苷10mg（上海微晶生物,489-32-7,20mg）、氢化可的松40ug（sigma,h3160）、vegf20μg（peprotech，96-100-20-2）、igf-i10μg（peprotech，96-100-11-20）、epo10μg（peprotech，cyt-201），充分混匀；
(6)0.22um滤膜过滤除菌，制得脂肪保存液，分装，冷冻保存；使用时提前置于0~8℃解冻即可。
实施例二
本发明提供的一种脂肪保存液，每升脂肪保存液由如下成分按重量组成：高糖dmem干粉培养基13.4g、碳酸氢钠2.438g、胰岛素2mg、青霉素100mg、链霉素100mg、两性霉素2.5mg、阿司匹林200mg、维生素c300mg、白藜芦醇7mg、淫羊藿苷2mg、氢化可的松20ug、vegf10μg、igf-i5μg、epo5μg，余量为注射用水。
该脂肪保存液的制备方法如下：
(1)将高糖dmem干粉培养基13.4g倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器。加注射用水至950ml，轻微搅拌溶解；
(2)加入2.438g碳酸氢钠；
(3)轻微搅拌溶解，加注射用水至1l；
(4)用1mol/l氢氧化钠溶液或者1mol/l盐酸溶液调节ph值至中性；
(5)依次分别加入胰岛素2mg、青霉素100mg、链霉素100mg、两性霉素2.5mg、阿司匹林200mg、维生素c300mg、白藜芦醇7mg、淫羊藿苷2mg、氢化可的松20ug、vegf10μg、igf-i5μg、epo5μg，充分混匀；
(6)0.22um滤膜过滤除菌，分装，冷冻保存，制得脂肪保存液；使用时提前置于0~8℃解冻即可。
实施例三
本发明提供的一种脂肪保存液，每升脂肪保存液由如下成分按重量组成：高糖dmem干粉培养基13.4g、碳酸氢钠2.438g、胰岛素5mg、青霉素150mg、链霉素150mg、两性霉素4mg、阿司匹林300mg、维生素c400mg、白藜芦醇8mg、淫羊藿苷3mg、氢化可的松30ug、vegf15μg、igf-i6μg、epo6μg，余量为注射用水。
该脂肪保存液的制备方法如下：
(1)将高糖dmem干粉培养基13.4g倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器。加注射用水至950ml，轻微搅拌溶解；
(2)加入2.438g碳酸氢钠；
(3)轻微搅拌溶解，加注射用水至1l；
(4)用1mol/l氢氧化钠溶液或者1mol/l盐酸溶液调节ph值至中性；
(5)依次分别加入胰岛素5mg、青霉素150mg、链霉素150mg、两性霉素4mg、阿司匹林300mg、维生素c400mg、白藜芦醇8mg、淫羊藿苷3mg、氢化可的松30ug、vegf15μg、igf-i6μg、epo6μg，充分混匀；
(6)0.22um滤膜过滤除菌制得脂肪保存液，分装，冷冻保存；使用时提前置于0~8℃解冻即可。
实施例四
脂肪组织的采集及保存：用本发明的脂肪保存液保存吸脂后到分离前的人脂肪组织，即无菌采集脂肪后，吸弃膨胀液，将采集的脂肪组织放入装有本发明的脂肪保存液的脂肪采集瓶中，拧紧瓶盖并密封，放入恒温箱中0~8℃恒温保存至分离。
保存液的保存效果对比：将采集的脂肪组织均分为5份，分别保存在本发明的脂肪保存液、磷酸盐缓冲液pbs、生理盐水和高糖dmem培养基（液体）中，最后一份直接将脂肪组织单独放置，在0~8℃恒温保存24小时、48小时、72小时、120小时后胶原酶消化分离，取相同克数脂肪组织块分离获得的有核细胞常规培养9天后，消化计数。同时留一份新鲜脂肪组织不保存作为对照，直接胶原酶消化分离后取相同克数脂肪组织块获得的有核细胞常规培养9天，消化后计数为6.20×107。
保存结果显示如下：
对过去一年脂肪采集运输进行污染率统计，不加任何溶液保存的脂肪组织64份中有2份污染，污染率为3.1%；经本发明脂肪保存液保存的371份脂肪组织中没有一份污染，污染率为0。
可以看出，本发明的脂肪保存液，可以使采集后的组织样本在运输、交接、分离前检测等过程中，能够在较长时间内（超过5天）有效保持其中干细胞的活性，提高干细胞得率，并能防止和去除污染，扩大了组织样本库干细胞存储的业务范围。