本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种用于白头翁花药诱导培养再生植株的基础培养基、诱导培养基、增殖培养基和生根培养基，以及白头翁花药诱导培养再生植株的方法。
背景技术：
白头翁花(pulsatillachinensis(bunge)regel)又名羊胡子花、老冠花、将军草、大碗花、老公花、老姑子花和毛姑朵花，毛莨科白头翁属植物。植株高15-35厘米，根状茎粗0.8-1.5厘米，基生叶4-5，叶片宽卵形，三全裂，中全裂片有柄或近无柄，花葶1(-2)，有柔毛，花直立，萼片蓝紫色，长圆状卵形，聚合果直径9-12厘米，瘦果纺锤形，扁，4月至5月开花。白头翁多生长在阳光充足，排水良好，土层深厚的砂质壤土或粘质壤土的地区，以山岗、荒坡及田野间比较多见。
白头翁在园林中可作自然栽植，用于布置花坛、道路两旁，或点缀于林间空地。花期早，植株矮小，是理想的地被植物品种，果期羽毛状花柱宿存，形如头状，极为别致。
近年来，随着城市园林需求的不断增加，需要大量的野生花卉新品种。白头翁是良好的植被品种，若能选育新品种，则能可以丰富城市色彩。目前白头翁主要是采用种子繁殖种苗，严重阻碍这一优良品种的推广应用及新品种选育。
关于白头翁离体培育的报道很少，主要集中在以种子、叶片等部位为外植体进行离体培养，对于如何利用白头翁花粉为外植体成功离体培养白头翁再生植株未见报道。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种使白头翁花药为外植体成功诱导培养为再生植株的基础培养基。
本发明的目的还在于提供一种白头翁花药诱导培养再生植株的方法，缩短白头翁育种周期、提高育种效率。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种用于白头翁花药诱导培养再生植株的基础培养基，为ms改良培养基，包括大量元素、微量元素、铁盐和有机质；
所述大量元素为硝酸铵1100～1400mg/l、硝酸钾1300～1600mg/l、磷酸二氢钾200～240mg/l、硫酸镁450～500mg/l和氯化钙520～580mg/l；
所述微量元素中，碘化钾0.85～0.90mg/l；
其余组分及其含量与ms培养基相同。
本发明还提供了一种用于白头翁花药诱导培养再生植株的诱导培养基，以上述技术方案所述基础培养基为基准，每升基础培养基中还包括6-ba0.5～2.5mg、2,4-d0.1～1.5mg、质量分数2～6％的聚蔗糖和水解乳蛋白lh260～350mg，所述诱导培养基的ph值为5.5～6.5。
本发明还提供了一种用于白头翁花药诱导培养再生植株的增殖培养基，以前述技术方案所述基础培养基为基准，每升基础培养基中还包括zt0.5～2.0mg、naa0.05～0.3mg、ga0.1～1.5mg、质量分数1.5～3.0％的聚蔗糖和琼脂5.0～7.0g，所述增殖培养基的ph值为5.5～6.5。
本发明还提供了一种用于白头翁花药诱导培养再生植株的生根培养基，以1/5～1/2前述技术方案所述基础培养基为基准，每升基础培养基中还包括naa0.1～1.0mg、iba0.1～0.4mg、ga0.5～2.0mg、质量分数1.5～3.0％的聚蔗糖和琼脂5.0～7.0g，所述生根培养基的ph值为5.5～6.5。
本发明的目的还在于提供一种白头翁花药诱导培养再生植株的方法，包括以下步骤：
(1)将处于单核期的白头翁花药接种于诱导培养基中暗培养至愈伤组织出现绿色光亮的芽点；
(2)将所述步骤(1)含有绿色光亮芽点的愈伤组织转接于增殖培养基中光照培养，诱导形成丛生苗；
(3)将所述步骤(2)得到的丛生苗转入生根培养基中光照培养，得到白头翁再生植株；
所述诱导培养基或增殖培养基包括权利要求1所述的基础培养基，所述生根培养基包括1/5～1/2权利要求1所述的基础培养基。
优选的，所述步骤(1)中，白头翁花药处于单核居中期。
优选的，所述步骤(1)的诱导培养基以前述技术方案所述基础培养基为基准，每升基础培养基中还包括6-ba0.5～2.5mg、2,4-d0.1～1.5mg、质量分数2～6％的聚蔗糖和水解乳蛋白lh260～350mg，所述诱导培养基的ph值为5.5～6.5。
优选的，所述步骤(2)的增殖培养基以前述技术方案所述基础培养基为基准，每升基础培养基中还包括zt0.5～2.0mg、naa0.05～0.3mg、ga0.1～1.5mg、质量分数1.5～3.0％的聚蔗糖和琼脂5.0～7.0g，所述增殖培养基的ph值为5.5～6.5。
优选的，所述步骤(3)的生根培养基以1/5～1/2前述技术方案所述基础培养基为基准，每升基础培养基中还包括naa0.1～1.0mg、iba0.1～0.4mg、ga0.5～2.0mg、质量分数1.5～3.0％的聚蔗糖和琼脂5.0～7.0g，所述生根培养基的ph值为5.5～6.5。
优选的，所述步骤(2)中增殖培养条件为：光照周期12～14h/d，光照强度15～20μmol·m-2·s-1，培养温度24～28℃，培养湿度50～60％；
所述步骤(3)中生根培养条件为：光照周期12～14h/d，光照强度15～20μmol·m-2·s-1，培养温度24～28℃，培养湿度50～60％。
本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种用于白头翁花药诱导培养再生植株的基础培养基，为ms改良培养基，包括大量元素、微量元素、铁盐和有机质，所述大量元素为硝酸铵1100～1400mg/l、硝酸钾1300～1600mg/l、磷酸二氢钾200～240mg/l、硫酸镁450～500mg/l和氯化钙520～580mg/l；所述微量元素中，碘化钾0.85～0.90mg/l。本发明在ms培养基的基础上进行改良，得到了适宜白头翁花药诱导培养的基础培养基，采用本发明提供的基础培养基对白头翁花药进行培养，能够成功诱导得到以花粉为外植体的再生植株。以本发明提供的基础培养基组成的诱导培养基诱导率高。
本发明还提供了一种用于白头翁花药诱导培养再生植株的诱导培养基，以前述技术方案所述基础培养基为基准，每升基础培养基中还包括6-ba0.5～2.5mg、2,4-d0.1～1.5mg、质量分数2～6％的聚蔗糖和水解乳蛋白lh260～350mg，所述诱导培养基的ph值为5.5～6.5。本发明提供的诱导培养基包括0.1～1.5mg/l的2,4-d，2,4-d的浓度对花粉诱导为愈伤组织的诱导率影响较大，但是高浓度的2,4-d反而不利于愈伤组织的形成，本发明在上述技术方案所述基础培养基的基础上选择了适宜浓度的2,4-d对白头翁花药进行诱导，诱导率可达到63％。本发明提供的诱导培养基为液体培养基，能够显著缩短以花药为外植体时的愈伤组织诱导时间，仅需要诱导25±5天即可观察到大量的小愈伤组织，而一般固体的诱导培养基至少需要诱导培养45d才能够观察到大量的小愈伤组织。
本发明还提供了一种用于白头翁花药诱导培养再生植株的增殖培养基，以前述技术方案所述基础培养基为基准，每升基础培养基中还包括zt0.5～2.0mg、naa0.05～0.3mg、ga0.1～1.5mg、质量分数1.5～3.0％的聚蔗糖和琼脂5.0～7.0g，所述增殖培养基的ph值为5.5～6.5。本发明提供的增殖培养基在前述技术方案所述基础培养基的基础上添加了适宜浓度的zt、naa和ga，使增殖培养的增殖率达到68.12％。
本发明还提供了一种用于白头翁花药诱导培养再生植株的生根培养基，以1/5～1/2前述技术方案所述基础培养基为基准，每升基础培养基中还包括naa0.1～1.0mg、iba0.1～0.4mg、ga0.5～2.0mg、质量分数1.5～3.0％的聚蔗糖和琼脂5.0～7.0g，所述生根培养基的ph值为5.5～6.5。本发明提供的生根培养基采用了1/5～1/2前述技术方案所述基础培养基，与正常浓度的所述基础培养基相比，本发明通过降低所述基础培养基的浓度显著提高了增殖苗的生根率，从21％左右提高到了67.3％。
本发明的目的还在于提供一种白头翁花药诱导培养再生植株的方法，首先将处于单核期的白头翁花药接种于诱导培养基中，暗培养得到愈伤组织；当愈伤组织表面形成绿色光亮的芽点时，转接于增殖培养基中增殖培养，诱导形成丛生苗；将丛生苗转入生根培养基中培养，得到白头翁再生植株。本发明所述的方法以白头翁花药为外植体，成功的通过对培养基和培养方式的调整得到白头翁再生植株。花粉所处的发育期是花粉离体培养成败的关键，本发明所述方法选择单核期的白头翁花药进行诱导培养，单核期的白头翁花药为外植体时愈伤组织诱导率高，结合培养基和培养方式的选择，最终得到了完整的再生植株。
本发明提供的诱导培养方法在愈伤组织诱导时采用了完全的暗培养，增殖培养和生根培养阶段则采用光照培养的方式，通过合理设置光培养和暗培养实现了白头翁花药的离体培养，最终获得白头翁花药诱导的再生植株。
在本发明的一些实施例中，本发明选择处于单核居中期的白头翁花药进行诱导培养。现有技术一般认为，花粉处于单核靠边期时诱导率最高，这是因为单核靠边期的花粉接近双核期最容易诱导为花粉胚，本发明创造性的发现选择处于单核居中期的白头翁花药进行诱导，在本发明所述诱导培养基上的诱导率显著高于单核靠边期。
本发明采用白头翁的花药为外植体诱导培养为再生植株，通过离体培养的方式显著提高了白头翁植株培养效率。本发明提供的白头翁花药诱导培养再生植株的方法能够获得白头翁的单倍体植株，为获得白头翁的纯系育种材料和单倍体育种提供基础，以利用杂种优势，缩短育种年限、提高育种效率。采用本发明提供的诱导培养方法，能够为获得野生白头翁的纯合二倍体植株提供基础，为研究野生白头翁的遗传变异规律研究提供有力的保障，减少育种的盲目性。本发明提供的诱导培养方法还能够克服白头翁远缘杂种的不育性，从而可以获得具有双亲优良特性的可育远缘杂种。
具体实施方式
本发明提供了一种用于白头翁花药诱导培养再生植株的基础培养基，为ms改良培养基，包括大量元素、微量元素、铁盐和有机质，
所述大量元素为硝酸铵1100～1400mg/l、硝酸钾1300～1600mg/l、磷酸二氢钾200～240mg/l、硫酸镁450～500mg/l和氯化钙520～580mg/l；
所述微量元素中，碘化钾0.85～0.90mg/l；其余组分及其含量与ms培养基相同。
本发明所述基础培养基具体的组成为：
大量元素：硝酸铵1100～1400mg/l、硝酸钾1300～1600mg/l、磷酸二氢钾200～240mg/l、硫酸镁450～500mg/l和氯化钙520～580mg/l；
微量元素：碘化钾0.85～0.90mg/l、硼酸6.2mg/l、硫酸锰(mnso4·4h2o)22.3mg/l、硫酸锌(znso4·7h2o)8.6mg/l、钼酸钠(na2moo4·2h2o)0.25mg/l、硫酸铜(cuso4·5h2o)0.025mg/l和氯化钴(cocl2·6h2o)0.025mg/l；
铁盐：乙二胺四乙酸二钠(na2·edta)37.3mg/l和硫酸亚铁(feso4·7h2o)27.8mg/l；
有机质：肌醇(c6h12o6·2h20)100mg/l、烟酸(nc5h4cooh)0.5mg/l、盐酸硫胺素(c12h17cln4os·hcl)0.1mg/l、盐酸呲哆醇(c8h11o3n·hcl)0.5mg/l和甘氨酸(nh2·cn2·cooh)2mg/l。
优选的，本发明所述基础培养基中，大量元素为：硝酸铵1300mg/l、硝酸钾1500mg/l、磷酸二氢钾210mg/l、硫酸镁370mg/l和氯化钙400mg/l。本发明通过降低基础培养基中的硝酸铵、硝酸钾含量，提高磷酸二氢钾、硫酸镁和氯化钙的含量，使得基础培养基更适宜白头翁花药的诱导，相对于ms培养基或wpm培养基而言，显著提高了愈伤组织的诱导效率、增殖培养的增值率。
在本发明所述基础培养基中，微量元素碘化钾的含量优选为0.86mg/l。本发明对微量元素的含量进行调节，使其适宜白头翁花药诱导培养的需求。
本发明还提供了一种用于白头翁花药诱导培养再生植株的诱导培养基，以上述技术方案所述基础培养基为基准，每升基础培养基中还包括6-ba0.5～2.5mg、2,4-d0.1～1.5mg、质量分数2～6％的聚蔗糖和水解乳蛋白lh260～350mg，所述诱导培养基的ph值为5.5～6.5。优选的，所述诱导培养基以上述技术方案所述基础培养基为基准，每升基础培养基中还包括6-ba2.0mg、2,4-d0.5mg、质量分数4％的聚蔗糖和水解乳蛋白lh300mg，ph值为6.0。
在本发明中，所述聚蔗糖的商品名为ficoll；更优选的，所述聚蔗糖优选为ficoll-400。
本发明在所述基础培养基的基础上，对2,4-d的浓度进行了优化，2,4-d添加量越高愈伤组织的诱导率越高，但是当2,4-d浓度过高时反而会抑制愈伤组织的形成，采用本发明限定的2,4-d添加浓度，能够显著提高白头翁花粉的愈伤组织诱导率，达到63％。
本发明所述诱导培养基为液体培养基，对处于单核期的白头翁花药进行诱导培养，25±5天即可观察到大量的小愈伤组织，相对于固体培养基有效的缩短了诱导时间。
本发明还提供了一种用于白头翁花药诱导培养再生植株的增殖培养基，包括前述技术方案所述基础培养基、zt0.5～2.0mg/l、naa0.05～0.3mg/l、ga0.1～1.5mg/l、质量分数1.5～3.0％的聚蔗糖和琼脂5.0～7.0g/l，所述增殖培养基的ph值为5.5～6.5。优选的，所述增殖培养基包括前述技术方案所述基础培养基、zt1.5mg/l、naa0.1mg/l、ga0.5mg/l、质量分数2.0％的聚蔗糖和琼脂6.5g/l，ph值为6.0。本发明所述增殖培养基为固体培养基。
本发明提供的增殖培养基以前述技术方案所述基础培养基为基础，相对于ms、wpm等作为基础培养基，增殖率能够显著提高20％以上，显著提高继代增殖的数量，缩短增殖培养时间。
本发明还提供了一种用于白头翁花药诱导培养再生植株的生根培养基，包括1/5～1/2前述技术方案所述基础培养基、naa0.1～1.0mg/l、iba0.1～0.4mg/l、ga0.5～2.0mg/l、质量分数1.5～3.0％的聚蔗糖和琼脂5.0～7.0g/l，所述生根培养基的ph值为5.5～6.5。优选的，所述生根培养基包括1/3前述技术方案所述基础培养基、naa0.5mg/l、iba0.2mg/l、ga1.5mg/l、质量分数2.0％的聚蔗糖和琼脂6.5g/l，ph值为6.0。
在本发明中，所述1/5～1/2前述技术方案所述基础培养基是指将所述基础培养基中的大量元素浓度降低至原浓度的1/5～1/2。
本发明提供的生根培养基在前述方案所述基础培养基的基础上对物质浓度进行了缩减，基础培养基中的物质浓度过高对丛生苗生根有抑制作用，本发明通过降低基础培养基中的物质浓度能够显著提高丛生苗的生根率，生根率可达到67.3％，更适宜白头翁花药诱导培养的丛生苗生根。
在本发明中，所述基础培养基、诱导培养基、增殖培养基和生根培养基所用原料采用市售商品即可，本发明对此无特殊限定。
在本发明中，所述基础培养基、诱导培养基、增殖培养基或生根培养基的制备方法采用本领域的常规配制方式即可。
本发明的目的还在于提供一种白头翁花药诱导培养再生植株的方法，包括以下步骤：
(1)将处于单核期的白头翁花药接种于诱导培养基中暗培养至愈伤组织出现绿色光亮的芽点；
(2)将所述步骤(1)含有绿色光亮芽点的愈伤组织转接于增殖培养基中光照培养，诱导形成丛生苗；
(3)将所述步骤(2)得到的丛生苗转入生根培养基中光照培养，得到白头翁再生植株；
所述诱导培养基或增殖培养基包括权利要求1所述的基础培养基，所述生根培养基包括1/5～1/2前述技术方案所述的基础培养基。
本发明将处于单核期的白头翁花药接种于诱导培养基中，暗培养至愈伤组织出现绿色光亮的芽点。花粉所处的发育时期，是白头翁花药诱导培养成败的关键因素，本发明优选的采用处于单核居中期的白头翁花药为外植体，选择单核居中期的白头翁花药其愈伤组织诱导率最高。本发明优选的通过镜检进行花粉发育时期的鉴定。
被子植物的花粉发育是由花粉母细胞(即小孢子母细胞)先经减数分裂形成四个相连的小孢子，这一时期称为四分体时期；其后四个小孢子分开，每个小孢子内的细胞核又由中间逐渐移向一侧，这一时期称为单核期，单核期包括单核居中期和单核靠边期，花粉发育依次由单核居中期至单核靠边期；单核期后细胞核经过一次有丝分裂，产生一个营养细胞核、一个生殖细胞核，称为双核期，最后发育成成熟的花粉粒。
本发明优选的在接种花药前，对花药的来源进行预处理和消毒，再将花药分离进行接种。所述花药的来源优选为含有单核期花药的花蕾。本发明所述对花蕾的预处理方法优选为低温预处理，所述低温预处理具体为0～6℃下放置40～50d，优选为4℃下放置48h。
本发明对花蕾进行预处理后的消毒方法优选为：将低温预处理后的花蕾用洗涤剂进行表面清洗，水冲洗后用75％乙醇灭菌20～60s，用水冲洗3～5次后吸干表面水分即可。优选的，所述洗涤剂为洗洁精；所述75％乙醇的灭菌时间优选为30s。
在本发明中，所述暗培养条件优选为：温度24～28℃、湿度为50～60％避光培养；所述暗培养温度优选为25～26℃；湿度优选为52～55％
本发明所述暗培养过程中，优选的每隔4～6d更换一次诱导培养基；更优选为每隔5d更换一次。
本发明所述诱导培养基以前述技术方案所述基础培养基为基准，每升基础培养基中还包括6-ba0.5～2.5mg、2,4-d0.1～1.5mg、质量分数2～6％的聚蔗糖和水解乳蛋白lh260～350mg，所述诱导培养基的ph值为5.5～6.5。本发明所述诱导培养基与前述技术方案所述诱导培养基的限定相同，此处不再赘述。
当本发明诱导得到的愈伤组织表面形成绿色光亮的芽点时，转接于增殖培养基中增殖培养，诱导形成丛生苗。在本发明所述增殖培养过程中，愈伤组织的芽点逐渐长大，生长出嫩茎和小叶，形成无根的丛生苗。
在本发明中，所述增殖培养基以前述技术方案所述基础培养基为基准，每升基础培养基中还包括zt0.5～2.0mg、naa0.05～0.3mg、ga0.1～1.5mg、质量分数1.5～3.0％的聚蔗糖和琼脂5.0～7.0g，所述增殖培养基的ph值为5.5～6.5。本发明所述增殖培养基与前述技术方案所述增殖培养基的限定相同，此处不再赘述。
本发明所述增殖培养的条件优选为：光照周期12～14h/d，光照强度15～20μmol·m-2·s-1，培养温度24～28℃，培养湿度50～60％。
本发明所述增殖培养中，优选的当愈伤组织培养至长出茎和叶后，培养30～40d后即得丛生苗；更优选为35d。
得到所述丛生苗后，本发明将丛生苗转入生根培养基中进行生根培养，得到白头翁再生植株。
在本发明中，所述生根培养基以1/5～1/2前述技术方案所述基础培养基为基准，每升基础培养基中还包括naa0.1～1.0mg、iba0.1～0.4mg、ga0.5～2.0mg、质量分数1.5～3.0％的聚蔗糖和琼脂5.0～7.0g，所述生根培养基的ph值为5.5～6.5。所述生根培养基与前述技术方案所述生根培养基的限定相同，在此不再赘述。
本发明所述生根培养的条件优选为：光照周期12～14h/d，光照强度15～20μmol·m-2·s-1，培养温度24～28℃，培养湿度50～60％。
本发明提供的白头翁花药诱导培养再生植株的方法中，采用完全的暗培养进行愈伤组织诱导，结合增殖培养和生根培养的光培养，通过暗培养与光培养的合理交替实现了白头翁花药再生植株的成功诱导。
下面结合实施例对本发明提供的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
用于白头翁花药诱导再生植株的基础培养基为ms改良培养基，其组成为：
大量元素：硝酸铵1300mg/l、硝酸钾1500mg/l、磷酸二氢钾210mg/l、硫酸镁370mg/l和氯化钙400mg/l；
微量元素：碘化钾0.86mg/l、硼酸6.2mg/l、硫酸锰(mnso4·4h2o)22.3mg/l、硫酸锌(znso4·7h2o)8.6mg/l、钼酸钠(na2moo4·2h2o)0.25mg/l、硫酸铜(cuso4·5h2o)0.025mg/l和氯化钴(cocl2·6h2o)0.025mg/l；
铁盐：乙二胺四乙酸二钠(na2·edta)37.3mg/l和硫酸亚铁(feso4·7h2o)27.8mg/l；
有机质：肌醇(c6h12o6·2h20)100mg/l、烟酸(nc5h4cooh)0.5mg/l、盐酸硫胺素(c12h17cln4os·hcl)0.1mg/l、盐酸呲哆醇(c8h11o3n·hcl)0.5mg/l和甘氨酸(nh2·cn2·cooh)2mg/l。
实施例2白头翁花粉诱导培养再生植株
1、材料采集与处理
4～5月份，选择黑龙江省哈尔滨市帽儿山野生优良品种的白头翁，此时花粉处于生长旺盛期，采集时间选择晴朗天气、上午9～10点进行。从现蕾(出现花蕾)到开花期间，每隔2d采集一次花蕾。将采集到的花蕾置于4℃的冰箱内低温处理48h，备用。
接种前，通过镜检对花粉发育时期进行鉴定，选取处于单核居中期的白头翁花粉。
所述镜检确定花粉发育时期方法为：用镊子撕去花冠取出花药，将花药置于醋酸洋红溶液中固定2h，取出花药用水冲洗3～4次；将洗净的花药置于载玻片上切开，滴一滴醋酸洋红溶液对花药染色1～2分钟，并弃去花药壁碎片，盖上盖玻片，制成临时压片，在酒精灯上轻烤后，用显微镜观察花粉所处的发育时期，同时拍照。
2、诱导愈伤组织
取鉴定为单核居中期发育期同期采集的花蕾(低温处理后的)，先用洗涤剂进行表面清洗，去除表面尘土；清水冲洗后置于超净工作台上用75％的乙醇灭菌30s，无菌水冲洗3～5次后用滤纸吸干花蕾表面水分。
用镊子剖开花蕾取出花药，直接接种于诱导培养基上，在25℃、52～55％湿度条件下避光培养，每隔4d更换一次新的诱导培养基，得到愈伤组织。所述诱导培养基为：实施例1得到的基础培养基+6-ba2.0mg/l+2,4-d0.5mg/l+质量分数4％聚蔗糖+水解乳蛋白lh300mg/l，所述诱导培养基的ph值为6.0。
诱导培养25±5天即可在液体状态的诱导培养基中观察到大量的小愈伤组织。
实施例3
除选择花药的发育时期为单核靠边期外，诱导愈伤组织的培养基和步骤均与实施例2相同，白头翁花粉愈伤组织。
统计实施例2～3中白头翁花粉诱导愈伤组织的诱导率，比较选择不同的花药发育期对白头翁花药诱导率的影响，结果表明，单核居中期的花粉诱导为愈伤组织的诱导率为61％(实施例2)，单核靠边期的花粉诱导为愈伤组织的诱导率为22.1％(实施例4)。
可以看出，当采用处于单核靠边期的花药为外植体时，其愈伤组织诱导率较低；采用处于单核居中期的花药为外植体时，愈伤组织的诱导率最高。可见，本发明通过选择发育期为单核居中期的花粉作为外植体，能够显著提高愈伤组织的诱导率。
实施例4白头翁花粉诱导培养再生植株
1、材料采集与处理
4～5月份，选择黑龙江省哈尔滨市帽儿山野生优良品种的白头翁，此时花粉处于生长旺盛期，采集时间选择晴朗天气、上午9～10点进行。从现蕾(出现花蕾)到开花期间，每隔2d采集一次花蕾。将采集到的花蕾置于4℃的冰箱内低温处理48h，备用。
接种前，通过镜检对花粉发育时期进行鉴定，选取处于单核居中期的白头翁花粉。
所述镜检确定花粉发育时期方法为：用镊子撕去花冠取出花药，将花药置于醋酸洋红溶液中固定2h，取出花药用水冲洗3～4次；将洗净的花药置于载玻片上切开，滴一滴醋酸洋红溶液对花药染色1～2分钟，并弃去花药壁碎片，盖上盖玻片，制成临时压片，在酒精灯上轻烤后，用显微镜观察花粉所处的发育时期，同时拍照。
3、诱导愈伤组织
取鉴定为单核居中期发育期同期采集的花蕾(低温处理后的)，先用洗涤剂进行表面清洗，去除表面尘土；清水冲洗后置于超净工作台上用75％的乙醇灭菌30s，无菌水冲洗3～5次后用滤纸吸干花蕾表面水分。
用镊子剖开花蕾取出花药，直接接种于诱导培养基上，在24～26℃、50～60％湿度条件下避光培养，每隔5d更换一次新的诱导培养基，得到愈伤组织。所述诱导培养基为：实施例1得到的基础培养基+6-ba2.0mg/l+2,4-d0.5mg/l+质量分数4％聚蔗糖+水解乳蛋白lh300mg/l，所述诱导培养基的ph值为6.0。
诱导培养25±5天即可在液体状态的诱导培养基中观察到大量的小愈伤组织。
3、增殖培养
当步骤2培养的愈伤组织表面形成绿色光亮的芽点时，转入增殖培养基上进行增殖培养，当芽点逐渐长出茎和叶时，再继续培养35d，即得无根的丛生苗。
所述增殖培养基为：实施例1得到的基础培养基+zt1.5mg/l+naa0.1mg/l+ga0.5mg/l+质量分数2.0％的聚蔗糖+琼脂6.5g/l，ph值为6.0。
所述增殖培养条件为：光照周期12～14h/d，光照强度15～20μmol·m-2·s-1，培养温度24～28℃，培养湿度50～60％。
4、生根培养
将丛生苗转接至生根培养基中，光照培养30～40d后，即得白头翁花粉再生植株。
所述生根培养基为：1/3实施例1得到的所述基础培养基+naa0.5mg/l、iba0.2mg/l+ga1.5mg/l+质量分数2.0％的聚蔗糖+琼脂6.5g/l，ph值为6.0。
所述生根培养条件为：光照周期12～14h/d，光照强度15～20μmol·m-2·s-1，培养温度24～28℃，培养湿度50～60％。
实施例5
除诱导培养基为ms培养基+6-ba1.0mg/l+2,4-d1.0mg/l+质量分数4％聚蔗糖+水解乳蛋白lh300mg/l，ph值为6.0，其他培养基和步骤均与实施例4相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
实施例6
除诱导培养基为wpm培养基+6-ba0.5mg/l+2,4-d1.5mg/l+质量分数4％聚蔗糖+水解乳蛋白lh300mg/l，ph值为6.0，其他培养基和步骤均与实施例4相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
实施例7
除选择花药的发育时期为四分体时期外，其他培养基和步骤均与实施例4相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
实施例8
除诱导培养基为ms培养基+6-ba1.0mg/l+2,4-d1.0mg/l+质量分数4％聚蔗糖+水解乳蛋白lh300mg/l，ph值为6.0，其他培养基和步骤均与实施例7相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
实施例9
除诱导培养基为wpm培养基+6-ba0.5mg/l+2,4-d1.5mg/l+质量分数4％聚蔗糖+水解乳蛋白lh300mg/l，ph值为6.0，其他培养基和步骤均与实施例7相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
实施例10
除选择花药的发育时期为单核靠边期外，其他培养基和步骤均与实施例4相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
实施例11
除诱导培养基为ms培养基+6-ba1.0mg/l+2,4-d1.0mg/l+质量分数4％聚蔗糖+水解乳蛋白lh300mg/l，ph值为6.0，其他培养基和步骤均与实施例10相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
实施例12
除诱导培养基为wpm培养基+6-ba0.5mg/l+2,4-d1.5mg/l+质量分数4％聚蔗糖+水解乳蛋白lh300mg/l，ph值为6.0，其他培养基和步骤均与实施例10相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
统计实施例4～12中白头翁花粉诱导愈伤组织的诱导率和诱导时间，比较不同愈伤组织诱导条件对白头翁花药诱导率的影响，结果表1所示，表1为实施例4～12中不同诱导条件对白头翁花药诱导愈伤组织的影响。
表1不同条件对花药愈伤组织诱导率的影响
由表1的数据可知，基本培养基的不同对愈伤组织诱导率有显著影响，采用本发明提供的改良ms基础培养基(实施例1)以及适宜的激素组成和浓度结合，能够显著提高诱导率。
同时，还可以看出，以处于单核靠边期的花粉为外植体时，采用本发明提供的基础培养基(实施例1)反而相对于ms培养基、wpm培养基的诱导率低，这表明在不同发育期的花粉为外植体时，适宜的基础培养基不同。本发明提供的用于白头翁花药诱导培养再生植株的基础培养基适宜以处于单核期的白头翁花药诱导愈伤组织。
实施例13
除诱导培养基为：实施例1得到的基础培养基+zt1.0mg/l+naa0.2mg/l+ga1.0mg/l+质量分数2.0％的聚蔗糖+琼脂6.5g/l，ph值为6.0，其他培养基和步骤均与实施例4相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
实施例14
除诱导培养基为：实施例1得到的基础培养基+zt0.5mg/l+naa0.3mg/l+ga1.5mg/l+质量分数2.0％的聚蔗糖+琼脂6.5g/l，ph值为6.0，其他培养基和步骤均与实施例4相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
实施例15
除诱导培养基为：ms培养基+6-ba2.0mg/l+2,4-d0.5mg/l+质量分数4％聚蔗糖+水解乳蛋白lh300mg/l，所述诱导培养基的ph值为6.0，其他培养基和步骤均与实施例4相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
实施例16
除诱导培养基为：ms培养基+zt1.0mg/l+naa0.2mg/l+ga1.0mg/l+质量分数2.0％的聚蔗糖+琼脂6.5g/l，ph值为6.0，其他培养基和步骤均与实施例4相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
实施例17
除诱导培养基为：ms培养基+zt0.5mg/l+naa0.3mg/l+ga1.5mg/l+质量分数2.0％的聚蔗糖+琼脂6.5g/l，ph值为6.0，其他培养基和步骤均与实施例4相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
实施例18
除诱导培养基为：wpm培养基+zt1.5.0mg/l+naa0.1mg/l+ga0.5mg/l+质量分数2.0％的聚蔗糖+琼脂6.5g/l，ph值为6.0，其他培养基和步骤均与实施例4相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
实施例19
除诱导培养基为：wpm培养基+zt1.0mg/l+naa0.2mg/l+ga1.0mg/l+质量分数2.0％的聚蔗糖+琼脂6.5g/l，ph值为6.0，其他培养基和步骤均与实施例5相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
实施例20
除诱导培养基为：wpm培养基+zt0.5mg/l+naa0.3mg/l+ga1.5mg/l+质量分数2.0％的聚蔗糖+琼脂6.5g/l，ph值为6.0，其他培养基和步骤均与实施例4相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
统计实施例13～20中愈伤组织增殖培养时的增殖率，比较不同增殖培养基对愈伤组织增殖率的影响，结果表2所示，表2为实施例13～20中不同增殖培养基对愈伤组织的增殖率的影响。
表2不同增殖培养基对愈伤组织的增殖率的影响
由表2的数据可以看出，采用本发明提供的基础培养基组成的增殖培养基其愈伤组织的增殖率最高可达到68.12％，表明本发明提供的基础培养基(实施例1)适宜白头翁花药诱导培养，显著提高了增殖率。
相对于同激素水平的其他增殖培养基而言，本发明提供的增殖培养基对愈伤组织的增殖培养效率最高，有助于缩短增殖培养周期，降低成本。
实施例21
除生根培养基为：1/3实施例1得到的所述基础培养基+naa0.2mg/l、iba0.1mg/l+ga1.0mg/l+质量分数2.0％的聚蔗糖+琼脂6.5g/l，ph值为6.0，其他培养基和步骤均与实施例4相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
实施例22
除生根培养基为：1/3实施例1得到的所述基础培养基+naa0.1mg/l、iba0.3mg/l+ga0.5mg/l+质量分数2.0％的聚蔗糖+琼脂6.5g/l，ph值为6.0，其他培养基和步骤均与实施例4相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
实施例23
除生根培养基为：实施例1得到的所述基础培养基+naa0.5mg/l、iba0.2mg/l+ga1.5mg/l+质量分数2.0％的聚蔗糖+琼脂6.5g/l，ph值为6.0，其他培养基和步骤均与实施例4相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
实施例24
除生根培养基为：实施例1得到的所述基础培养基+naa0.2mg/l、iba0.1mg/l+ga1.0mg/l+质量分数2.0％的聚蔗糖+琼脂6.5g/l，ph值为6.0，其他培养基和步骤均与实施例4相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
实施例25
除生根培养基为：实施例1得到的所述基础培养基+naa0.1mg/l、iba0.3mg/l+ga0.5mg/l+质量分数2.0％的聚蔗糖+琼脂6.5g/l，ph值为6.0，其他培养基和步骤均与实施例4相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
实施例26
除生根培养基为：1/2实施例1得到的所述基础培养基+naa0.5mg/l、iba0.2mg/l+ga1.5mg/l+质量分数2.0％的聚蔗糖+琼脂6.5g/l，ph值为6.0，其他培养基和步骤均与实施例4相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
实施例27
除生根培养基为：1/2实施例1得到的所述基础培养基+naa0.2mg/l、iba0.1mg/l+ga1.0mg/l+质量分数2.0％的聚蔗糖+琼脂6.5g/l，ph值为6.0，其他培养基和步骤均与实施例4相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
实施例28
除生根培养基为：1/2实施例1得到的所述基础培养基+naa0.1mg/l、iba0.3mg/l+ga0.5mg/l+质量分数2.0％的聚蔗糖+琼脂6.5g/l，ph值为6.0，其他培养基和步骤均与实施例4相同，得到白头翁花粉诱导的再生植株。
统计实施例21～28中丛生苗生根培养时的生根率，比较不同生根培养基对丛生苗生根培养的生根率的影响，结果表3所示，表3为实施例21～28中不同生根培养基对丛生苗生根率的影响。
表3不同生根培养基对丛生苗生根培养的生根率的影响
由表3的数据可以看出，以1/3实施例1得到的基础培养基为基本培养基时，丛生苗的生根率最高，相对于未进行稀释的基础培养基(实施例1)而言能够显著提高丛生苗的生根率。可见，完整的基础培养基中营养物质浓度过高，对丛生苗的生根有抑制作用，本发明提供的生根培养基对所述基础培养基(实施例1)进行稀释后，能够适宜丛生苗的生长，促使其生根。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。