一种底栖动物标本的保存方法与流程

本发明属于标本保存技术领域，具体涉及一种底栖动物标本的保存方法。

背景技术：

底栖动物是指生活在水体底部的无脊椎动物，包括水体、沉积物中和附着在沉积物表面的所有动物，种类繁多，超过100万种。底栖动物因具有数量多、分布广泛、对环境变化敏感、生活周期长、迁徙能力较弱等特点常作为环境监测指标。底栖动物处于第三营养级，对于生态系统物质循环和能量流动有着重要的作用。随着底栖动物方面的研究日益增加和深入，底栖动物标本的收集和保存对于此方面的研究显得意义重大。并且，底栖动物标本是生物学科的重要素材，是学校教学的重要模型，也是科学传播的重要载体。因此，将底栖动物制作成标本具有重要的教学和科研意义。

目前，固定和保存底栖动物标本最为普遍的是利用甲醛溶液(即福尔马林)和乙醇溶液，但是甲醛溶液存在诸多缺陷，主要有：(1)甲醛易使标本机体发硬、变形、褪色、不保鲜；(2)在福尔马林中浸泡时间长之后，底栖动物容易被氧化，导致其分解或腐败，失去了保存意义；(3)软体动物的钙质壳，会被酸性甲醛腐蚀，在用甲醛固定时，务必加入少量苏打或硼砂中和酸性甲醛；(4)甲醛溶液中因含有甲醇易聚合产生沉淀，需经常更换；(3)甲醇毒性大，具有强烈的刺激性气味，挥发性较强，其不仅污染环境，致畸致癌效果明显，还会不同程度的伤害操作者的眼睛和呼吸系统，当其在空气中浓度达到30mg/m³时，会立即致人死亡，长时间接触，对健康影响较大；(5)而含乙醇的保存液长期使用后也会使样本机体发硬，其褪色现象比甲醛更明显；并且这两种溶液保存的样本存在不易造型，运输麻烦的缺陷。

为解决上述问题，也有人选择研究新的标本液对标本进行保存，并取得了良好的效果。专利98108129.0公开了一种保存液，该保存液至少由一种钠盐或钾盐类的防腐剂、至少一种多羟基类保色剂和水组成；中国专利CN88105221A公开了一种生物标本保色防腐剂配制方法，该方法配制的防腐剂采用复合配方，将乙醇、乙酸钾等物质按比例制成混合液，该防腐剂能够保持原色不变、机体柔软新鲜、不萎缩、不变形等特点。但上述两个专利中的保存液或防腐剂都是液体，不方便标本造型，并且保存的样本易变形并且运输麻烦。发明专利CN 103601844 B公开了一种动物标本保存凝胶的制备方法，此凝胶由质量比为1％-10％的丙烯酰胺化合物、15％-30％的Tris-HCl、0.1％-0.5％的N，N-亚甲基双丙烯酰胺、5％-20％的十二烷基硫酸钠、0.5％-1.0％的过硫酸铵以及38.5％-78.5％的水所组成的PH为3.5-5.0的溶液制作而成。PH为3.5-5.0有效的抑制了动植物细菌和霉菌的滋生。该发明的动物标本保存凝胶具有良好的保存、固定、杀菌、防腐作用，制作动植物标本很好的产品且便于运输。但是，该发明在制备过程中加入了多种对人体有害的化学试剂，并且由该发明制备的凝胶有较强的酸性，对具有矿物质外壳的底栖动物的保存不利。因此，仍需寻求一种更适于保存底栖动物标本的保存方法。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种底栖动物标本的保存方法，该方法能够使底栖动物标本长期保色保鲜、形态不变，且本发明的生物标本的保存方法为非液体保存，运输方便。

为实现上述目的，本发明的技术方案为一种底栖动物标本的保存方法，包括以下步骤：

(1)将采集的含有底栖动物的泥样通过分样筛过筛，用海水反复冲洗干净，分检后进行分装；

(2)将经步骤(1)处理分装的底栖动物先用甲醛溶液浸泡杀菌，然后在双蒸水中浸泡，用酒精溶液洗涤后再用双蒸水进行洗涤；

(3)将经步骤(2)处理的底栖动物加入标本固定剂进行固定；

(4)向步骤(3)的标本固定剂上方加入保护剂即制得底栖动物标本。

优选的，步骤(1)中，分检用工具为毛笔、小镊子、解剖针中的一种或多种。

进一步，步骤(2)中，在用甲醛溶液浸泡杀菌前，将底栖动物先放置在培养皿内，加入3-5ml海水，然后每隔10min滴加95％酒精，直至底栖动物身体伸展麻醉。

优选的，步骤(2)中，所述甲醛溶液的浓度为50-55wt％，浸泡时间为30-40s。

优选的，步骤(2)中，在双蒸水中的浸泡时间为5-6min。

优选的，步骤(2)中，所述酒精的体积浓度75％，酒精洗涤次数为2-3次，每次5-8s。

优选的，步骤(2)中，用双蒸水进行洗涤的次数为2-3次，每次时间为10-15s。

进一步，步骤(3)中，所述的标本固定剂中含有0.1mol/L的磷酸缓冲液、0.001％的冰醋酸、10-15％的明胶、3-5％的壳聚糖，余量为水；所述标本固定剂的pH为6-6.5。

优选的，步骤(3)中，所述壳聚糖的N-脱乙酰度为70-75％。

优选的，步骤(3)中，底栖动物的固定过程包括以下步骤：

A、将经步骤(2)处理的底栖动物置入标本固定杯中，用固定物固定底栖动物的标本位置和标本形态；

B、将准备好的壳聚糖、冰醋酸和部分水倒入干净的容器中，充分搅拌使壳聚糖完全溶解；向容器中加入明胶和部分水，边加热边搅拌，直至溶液沸腾停止加热，待明胶完全溶解后继续搅拌1min；

C、向容器中加入磷酸缓冲液，加水配平后充分搅拌得所述标本固定剂；

D、待步骤C容器内的标本固定剂温度降至65℃，将标本固定剂向步骤A的标本固定杯中缓慢倒入，并排除气泡；

E、将待步骤D的标本固定杯置于0-4℃环境下至标本固定剂凝固；

F、取出固定物。

优选的，步骤(4)中，所述保护剂由以下重量百分比的各组分组成：35％明胶、4％大蒜素、10％冰醋酸、余量为水；所述保护剂的高度为0.5-2cm。

优选的，步骤(4)中，所述保护剂的制备过程为：按配比称取明胶加入水中，90℃下充分溶解，然后加入冰醋酸混合均匀，降温至60℃再加入大蒜素混合均匀；将仍处于液态状态的保护剂缓慢倒入已凝固的标本固定剂的上方，0-4℃环境下至保护剂完全凝固。

与现有技术先比，本发明的有益技术效果：

(1)本发明通过选择适当的组分配比可制得一种透明的凝胶，对底栖动物进行封存，不仅克服了甲醛以及醇类标本保存液的所造成的上述缺点，而且具有更好的保存效果，并且该成份最终状态是固体凝胶，很好的保存了标本的水分及状态。

(2)本发明形成的凝胶对动物具有固定形状的作用，相较于液体防腐液，凝胶清澈透明，无刺激性气味，相较于液体固定的标本运输也很方便。

(3)本发明配置过程中加入的壳聚糖不仅具有较好的抗菌活性，抑制一些真菌、细菌、和病毒的生长繁殖，延长标本的保存期限，还能够与明胶进行交联，形成稳定的凝胶，其缓冲作用与固定效果良好，除非遭受剧烈的撞击，不易破裂或破碎。

(4)本发明利用保护剂与标本固定剂凝胶紧密贴合，其能够隔绝空气的氧化作用；并且，由保护剂形成的胶体坚韧透明，机械强度高，能够进一步降低物理或者化学作用对标本固定剂凝胶的影响；而且利用了大蒜素的抑菌作用和冰醋酸的抑菌和穿透力极强的功效，结合标本固定剂凝胶的双重保护，保存2年后，底栖动物标本的色泽、形状等均未发生改变。

(5)本发明用于固定底栖动物标本的凝胶pH偏中性，对具有矿物质外壳的底栖动物的保存没有任何不良影响，且用于制备标本固定剂凝胶的组分多为温和的化学试剂或天然物质，不会对标本造成化学侵蚀，有助于保证标本的完成性和外观保持不变。

(6)本发明利用壳聚糖和大蒜素进行杀菌、防腐，并且保护剂与标本固定剂中选用的均为无毒化学品和天然物质，对人体及环境无毒副作用，是制作底栖动物标本很好选择，可广泛应用于博物馆、学校等科学普及场所的标本制作工作中。

综合上述，本发明制作的底栖动物标本能够长期保色保鲜，两年之内颜色和形态保持不变，并且制作的标本整体呈现为固态，具备无毒，易造型，运输方便的特点，具有较大的推广应用价值。

附图说明

图1为本发明的实施例1的示意图；

图2为本发明的实施例2的示意图；

图3为本发明的实施例3的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

一种底栖动物标本的保存方法，包括以下步骤：

(1)将采得的样品当场或带回室内进行分检。将抓泥斗内的泥样倒入分样筛内过筛，在海水中冲洗(或在海边水中筛洗)，直至污泥完全洗净，然后将渣滓倒入白色解剖盘内，加入清澈的海水，反复冲洗几次，放入之密封塑料瓶中固定保存。样品筛及解剖盘中剩余的标本用毛笔将渤海格鳞虫进行分拣，以避免伤害柔软的虫体。将分拣后的渤海格鳞虫进行分装并用标签标记。将渤海格鳞虫在进行下一步操作前应先进行麻醉，使其舒展再固定。具体做法为将底栖生物放在培养皿中，加少量海水，3ml海水即可，然后每隔10分钟滴加95％酒精，直至虫体全部伸直彻底麻醉。

(2)将经步骤(1)处理分装的渤海格鳞虫先用50wt％的甲醛溶液浸泡30s进行杀菌，高浓度的甲醛使得渤海格鳞虫迅速死亡，甚至僵直性死亡，便于后续观察，同时也能够完成对标本的杀菌工作。然后在双蒸水中浸泡5min，用75％(v/v)酒精溶液洗涤2次，每次5s，再用双蒸水进行洗涤2次，每次时间为10s。

(3)将经步骤(2)处理的渤海格鳞虫加入标本固定剂进行固定。

所述的标本固定剂中含有0.1mol/L的磷酸缓冲液、0.001％的冰醋酸、10％的明胶、3％的壳聚糖，余量为水；所述标本固定剂的pH为6。所述壳聚糖的N-脱乙酰度为70％。

渤海格鳞虫的固定过程包括以下步骤：

A、将经步骤(2)处理的渤海格鳞虫置入标本固定杯中，用固定物固定渤海格鳞虫的标本位置和标本形态；

B、将准备好的壳聚糖、冰醋酸和部分水倒入干净的容器中，充分搅拌使壳聚糖完全溶解；向容器中加入明胶和部分水，边加热边搅拌，直至溶液沸腾停止加热，待明胶完全溶解后继续搅拌1min；

C、向容器中加入磷酸缓冲液，加水配平后充分搅拌得所述标本固定剂；

D、待步骤C容器内的标本固定剂温度降至65℃，将标本固定剂向步骤A的标本固定杯中缓慢倒入，并排除气泡；

E、将待步骤D的标本固定杯置于0℃环境下至标本固定剂凝固；

F、取出固定物。

(4)向步骤(3)中加入保护剂即制得底栖动物标本。

所述保护剂由以下重量百分比的各组分组成：35％明胶、4％大蒜素、10％冰醋酸、余量为水；所述保护剂的高度为0.5cm。所述保护剂的制备过程为：按配比称取明胶加入水中，90℃下充分溶解，然后加入冰醋酸混合均匀，降温至60℃再加入大蒜素混合均匀。将仍处于液态状态的保护剂缓慢倒入已凝固的标本固定剂的上方，0℃环境下至保护剂完全凝固即获得渤海格鳞虫标本成品。

分别在渤海格鳞虫标本制备后的1个月、3个月、6个月、12个月、24个月、48个月对标本进行观察，发现渤海格鳞虫的状态、色泽、形状均无明显改变。在标本制备后第48个月，将渤海格鳞虫取出冲洗后取出观察，发现渤海格鳞虫的状态、色泽、形状均无任何改变，之后将其置于正常室内环境中，2天后观察发现渤海格鳞虫就已开始腐烂变质。

实施例2

一种底栖动物标本的保存方法，包括以下步骤：

(1)将采得的样品当场或带回室内进行分检。将抓泥斗内的泥样倒入分样筛内过筛，在海水中冲洗(或在海边水中筛洗)，直至污泥完全洗净，然后将渣滓倒入白色解剖盘内，加入清澈的海水，反复冲洗几次，放入之密封塑料瓶中固定保存。样品筛及解剖盘中剩余的标本用小镊子或解剖针对竹节虫检选，将分检后的竹节虫进行分装并用标签标记。将竹节虫在进行下一步操作前应先进行麻醉，使其舒展再固定。具体做法为将竹节虫放在培养皿中，加少量海水，5ml海水即可，然后每隔10分钟滴加95％酒精，直至虫体全部伸直彻底麻醉。

(2)将经步骤(1)处理分装的竹节虫先用55wt％的甲醛溶液浸泡40s进行杀菌，高浓度的甲醛使得竹节虫迅速死亡，甚至僵直性死亡，便于后续观察，同时也能够完成对标本的杀菌工作。然后在双蒸水中浸泡6min，用75％(v/v)酒精溶液洗涤3次，每次8s，再用双蒸水进行洗涤3次，每次时间为15s。

(3)将经步骤(2)处理的竹节虫加入标本固定剂进行固定。

所述的标本固定剂中含有0.1mol/L的磷酸缓冲液、0.001％的冰醋酸、10-15％的明胶、3-5％的壳聚糖，余量为水；所述标本固定剂的pH为6.5。所述壳聚糖的N-脱乙酰度为75％。

竹节虫的固定过程包括以下步骤：

A、将经步骤(2)处理的竹节虫置入标本固定杯中，用固定物固定竹节虫的标本位置和标本形态；

B、将准备好的壳聚糖、冰醋酸和部分水倒入干净的容器中，充分搅拌使壳聚糖完全溶解；向容器中加入明胶和部分水，边加热边搅拌，直至溶液沸腾停止加热，待明胶完全溶解后继续搅拌1min；

C、向容器中加入磷酸缓冲液，加水配平后充分搅拌得所述标本固定剂；

D、待步骤C容器内的标本固定剂温度降至65℃，将标本固定剂向步骤A的标本固定杯中缓慢倒入，并排除气泡；

E、将待步骤D的标本固定杯置于4℃环境下至标本固定剂凝固；

F、取出固定物。

(4)向步骤(3)中加入保护剂即制得底栖动物标本。

所述保护剂由以下重量百分比的各组分组成：35％明胶、4％大蒜素、10％冰醋酸、余量为水；所述保护剂的高度为2cm。所述保护剂的制备过程为：按配比称取明胶加入水中，90℃下充分溶解，然后加入冰醋酸混合均匀，降温至60℃再加入大蒜素混合均匀。将仍处于液态状态的保护剂缓慢倒入已凝固的标本固定剂的上方，4℃环境下至保护剂完全凝固即获得竹节虫标本成品。

分别在竹节虫标本制备后的1个月、3个月、6个月、12个月、24个月、48个月对标本进行观察，发现竹节虫的状态、色泽、形状均无明显改变。在标本制备后第48个月，将竹节虫取出冲洗后取出观察，发现竹节虫的状态、色泽、形状均无任何改变，之后将其置于正常室内环境中，2.5天后观察发现竹节虫就已开始腐烂变质。

实施例3

一种底栖动物标本的保存方法，包括以下步骤：

(1)将采得的样品当场或带回室内进行分检。将抓泥斗内的泥样倒入分样筛内过筛，在海水中冲洗(或在海边水中筛洗)，直至污泥完全洗净，然后将渣滓倒入白色解剖盘内，加入清澈的海水，反复冲洗几次，放入之密封塑料瓶中固定保存。样品筛及解剖盘中剩余的标本用小镊子对脊腹褐虾进行检选，将分捡后的脊腹褐虾进行分装并用标签标记。

将脊腹褐虾在进行下一步操作前应先进行麻醉，使其舒展再固定。具体做法为将脊腹褐虾放在培养皿中，加少量海水，5ml海水即可，然后每隔10分钟滴加95％酒精，直至虫体全部伸直彻底麻醉。

(2)将经步骤(1)处理分装的脊腹褐虾先用50wt％的甲醛溶液浸泡35s进行杀菌，高浓度的甲醛使得脊腹褐虾迅速死亡，甚至僵直性死亡，便于后续观察，同时也能够完成对标本的杀菌工作。然后在双蒸水中浸泡5min，用75％(v/v)酒精溶液洗涤2次，每次5s，再用双蒸水进行洗涤2次，每次时间为10s。

(3)将经步骤(2)处理的脊腹褐虾加入标本固定剂进行固定。

所述的标本固定剂中含有0.1mol/L的磷酸缓冲液、0.001％的冰醋酸、12％的明胶、3-5％的壳聚糖，余量为水；所述标本固定剂的pH为6.5。所述壳聚糖的N-脱乙酰度为75％。

脊腹褐虾的固定过程包括以下步骤：

A、将经步骤(2)处理的脊腹褐虾置入标本固定杯中，用固定物固定脊腹褐虾的标本位置和标本形态；

B、将准备好的壳聚糖、冰醋酸和部分水倒入干净的容器中，充分搅拌使壳聚糖完全溶解；向容器中加入明胶和部分水，边加热边搅拌，直至溶液沸腾停止加热，待明胶完全溶解后继续搅拌1min；

C、向容器中加入磷酸缓冲液，加水配平后充分搅拌得所述标本固定剂；

D、待步骤C容器内的标本固定剂温度降至65℃，将标本固定剂向步骤A的标本固定杯中缓慢倒入，并排除气泡；

E、将待步骤D的标本固定杯置于4℃环境下至标本固定剂凝固；

F、取出固定物。

(4)向步骤(3)中加入保护剂即制得底栖动物标本。

所述保护剂由以下重量百分比的各组分组成：35％明胶、4％大蒜素、10％冰醋酸、余量为水；所述保护剂的高度为2cm。所述保护剂的制备过程为：按配比称取明胶加入水中，90℃下充分溶解，然后加入冰醋酸混合均匀，降温至60℃再加入大蒜素混合均匀。将仍处于液态状态的保护剂缓慢倒入已凝固的标本固定剂的上方，4℃环境下至保护剂完全凝固即获得脊腹褐虾标本成品。

分别在脊腹褐虾标本制备后的1个月、3个月、6个月、12个月、24个月、48个月对标本进行观察，发现脊腹褐虾的状态、色泽、形状均无明显改变。在标本制备后第48个月，将脊腹褐虾取出冲洗后取出观察，发现脊腹褐虾的状态、色泽、形状均无任何改变，之后将其置于正常室内环境中，2天后观察发现脊腹褐虾就已开始腐烂变质。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。