本发明涉及细胞冻存技术领域，具体涉及一种细胞冻存液。
背景技术：
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。
正常情况下，液体冻结时会造成细胞损伤，其中，一种情况是由于不适当的降温和复苏，导致细胞内形成冰晶和重结晶；另一种情况是由于冷冻使得电解质和溶质浓度升高所导致的溶质损伤。通常，免疫细胞在-70℃～-80℃冻存，细胞活性会随着冷冻时间的延长迅速下降，在-196℃时细胞生物学过程几乎停止，因此要长期保存免疫细胞，液氮温度是最佳的储存温度。
冻存保护剂可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。冻存保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成。同时冻存保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。冻存保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂多是一些小分子物质，可以透过细胞膜渗透到细胞内。该类保护剂主要包括DMSO、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤同时。细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定时间进行预冷，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。非渗透性冷冻保护剂一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内。该类保护剂主要包括聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉等。其保护机制的假设很多，其中一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中的水分子相结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。
目前现有的细胞冻存液不能有效保存大规模培养细胞，冻存后的细胞复苏后细胞数量以及细胞活力都无法满足临床应用的标准，导致免疫细胞体外大规模培养后，必须短时间内尽快应用，否则就只能废弃。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种细胞冻存液。
为实现上述目的，所采取的技术方案：
一种细胞冻存液，包括以下体积百分含量以及浓度的组分：二甲基亚砜2～8％、木瓜提取液0.5～1.5mg/ml、壳聚糖季铵盐2.0～5mg/ml、低分子右旋糖酐0.5～2％、人血清白蛋白8～15％、葡聚糖1.0～5mg/ml，余量为DMEM培养基。
优选地，包括以下体积百分含量以及浓度的组分：二甲基亚砜5～6％、木瓜提取液1～1.5mg/ml、壳聚糖季铵盐2.5～3.5mg/ml、低分子右旋糖酐1～1.5％、人血清白蛋白10～15％、葡聚糖2.5～4.5mg/ml，余量为DMEM培养基。
申请人发现各组分的浓度在该范围内，其细胞复苏后活力在91％以上。
优选地，包括以下体积百分含量以及浓度的组分：二甲基亚砜5％、木瓜提取液1mg/ml、壳聚糖季铵盐2.5mg/ml、低分子右旋糖酐1％、人血清白蛋白10％、葡聚糖2.5mg/ml，余量为DMEM培养基。
申请人经过大量实验意外发现，各成分含量在此配比情况下，其细胞复苏后活力在93％左右，其效果最佳。
优选地，包括以下体积百分含量以及浓度的组分：二甲基亚砜6％、木瓜提取液1.5mg/ml、壳聚糖季铵盐3mg/ml、低分子右旋糖酐1.5％、人血清白蛋白15％、葡聚糖4.5mg/ml，余量为DMEM培养基。
优选地，包括以下体积百分含量以及浓度的组分：二甲基亚砜5％、木瓜提取液1.5mg/ml、壳聚糖季铵盐3.5mg/ml、低分子右旋糖酐1％、人血清白蛋白10％、葡聚糖3.5mg/ml，余量为DMEM培养基。
一种细胞冻存液的制备方法，在DMEM培养基中加入二甲基亚砜、低分子右旋糖酐、木瓜提取液、壳聚糖季铵盐、人血清白蛋白、葡聚糖。
优选地，所述壳聚糖季铵盐与葡聚糖的体积含量比为1:1。
申请人发现，当壳聚糖季铵盐与葡聚糖的体积浓度比为1:1时，本发明的效果最佳。
本发明的有益效果：
本发明的葡聚糖可以提高细胞外的渗透压，减少细胞内的自由水，壳聚糖季铵盐可以进入细胞内，替代细胞内的自由水，减少因细胞冻存过程产生冰晶对细胞带来的损伤；且使用壳聚糖季铵盐可克服壳聚糖只能溶于弱酸溶液的局限性，且其效果更佳，右旋糖酐可以很好的维持了渗透压，在温度下降的过程中，仍能维持良好的渗透压环境，避免了细胞因温度下降、渗透压改变而出现细胞死亡的现象。低分子右旋糖酐是细胞外保护剂，保护细胞膜不在冻存过程中受到损伤；渗透性保护剂DMSO可以防止细胞破裂，降低细胞内水的熔点，防止形成晶体，其与非渗透性保护剂葡聚糖、以及壳聚糖季铵盐相辅相成，起到协同作用。人血白蛋白占血浆胶体渗透压的80％，主要调节组织与血管之间水分的动态平衡。在本发明中人血白蛋白可以维持细胞内外渗透压平衡；木瓜提取液是从木瓜中提取的一种人体内不能合成的新型高效天然抗氧化剂物质。它主要起抗氧化作用，可以提高细胞免疫功能，延长细胞活性，DMEM培养基可以为细胞提供营养，使其在复苏时更快的恢复生长。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明提供了一种细胞冻存液，包括以下体积百分含量以及浓度的组分：
二甲基亚砜2～8％、木瓜提取液0.5～1.5mg/ml、壳聚糖季铵盐2.0～5mg/ml、低分子右旋糖酐0.5～2％、人血清白蛋白8～15％、葡聚糖1.0～5mg/ml，余量为DMEM培养基。
本发明对所述二甲基亚砜、壳聚糖季铵盐、右旋糖酐、人血清白蛋白、葡聚糖的来源没有特殊的限制，采用常规的市售商品即可。
诱导培养基：NAA0.5mg/L+BA 2.0mg/L和水解酪蛋白1mg/L+MS固体培养基,pH值为6.0；增殖培养基：2,4-D 2.5mg/L+BA1.5mg/L+水解酪蛋白1mg/L和活性碳1mg/L+MS液体培养基；pH值为6.0。
本发明所述细胞冻存液优选按照以下方法制备得到：
在培养基中加入二甲基亚砜、低分子右旋糖酐、木瓜提取液、壳聚糖季铵盐、人血清白蛋白、葡聚糖，得到最终含有体积分数2～8％的二甲基亚砜、0.5～2％低分子右旋糖酐、8～15％的人血清白蛋白、体积浓度为0.5～1.5mg/ml木瓜提取液、2.0～5mg/ml的壳聚糖季铵盐、1.0～5mg/ml葡聚糖的DMEM培养基的细胞冻存液。
本发明的冻存液可以冻存多种类型的人体细胞，如人体免疫细胞、人体肿瘤细胞、巨噬细胞等。
实施例1
一种细胞冻存液，包括以下体积百分含量以及浓度的组分：
二甲基亚砜3％、木瓜提取液0.5mg/ml、壳聚糖季铵盐3.0mg/ml、低分子右旋糖酐0.5％、人血清白蛋白8％、葡聚糖1.5mg/ml，余量为DMEM培养基。
该冻存液的制备方法如上面所述，在此不做描述。
实施例2
一种细胞冻存液，包括以下体积百分含量以及浓度的组分：
二甲基亚砜2％、木瓜提取液1.5mg/ml、壳聚糖季铵盐2.0mg/ml、低分子右旋糖酐1.5％、人血清白蛋白10％、葡聚糖2mg/ml，余量为DMEM培养基。
实施例3
二甲基亚砜5％、木瓜提取液1mg/ml、壳聚糖季铵盐2.5mg/ml、低分子右旋糖酐1％、人血清白蛋白12％、葡聚糖2.5mg/ml，余量为DMEM培养基。
实施例4
二甲基亚砜6％、木瓜提取液1.5mg/ml、壳聚糖季铵盐3mg/ml、低分子右旋糖酐1.5％、人血清白蛋白15％、葡聚糖4.5mg/ml，余量为DMEM培养基。
实施例5
二甲基亚砜8％、木瓜提取液0.8mg/ml、壳聚糖季铵盐5mg/ml、低分子右旋糖酐2％、人血清白蛋白10％、葡聚糖5mg/ml，余量为DMEM培养基。
实施例6
二甲基亚砜5％、木瓜提取液1.5mg/ml、壳聚糖季铵盐3.5mg/ml、低分子右旋糖酐1％、人血清白蛋白10％、葡聚糖3.5mg/ml，余量为DMEM培养基。
对比例1
二甲基亚砜5％、维生素C 1mg/ml、壳聚糖季铵盐2.5mg/ml、低分子右旋糖酐1％、人血清白蛋白12％、葡聚糖2.5mg/ml，余量为DMEM培养基。按常规方法配制，放入4℃冰箱保存备用。
对比例2
本对比例中细胞冻存液，含有下述重量体积百分数的下述组分：DMSO20％、维生素C 0.2％、甲基纤维素4000CP 5％、羟乙基淀粉5％、谷氨酰胺1％、丙酮酸钠0.2％，新生牛血清74.6％。按常规方法配制，放入4℃冰箱保存备用。
对比例3
二甲基亚砜5％、低分子右旋糖酐1％、人血清白蛋白12％、余量为DMEM培养基。按常规方法配制，放入4℃冰箱保存备用。
对比例4
二甲基亚砜1％、木瓜提取液2mg/ml、壳聚糖季铵盐2.5mg/ml、低分子右旋糖酐1％、人血清白蛋白12％、葡聚糖2.5mg/ml，余量为DMEM培养基。
对比例5
二甲基亚砜5％、木瓜提取液1mg/ml、壳聚糖季铵盐1.0mg/ml、低分子右旋糖酐1％、人血清白蛋白12％、葡聚糖6mg/ml，余量为DMEM培养基。
效果例1细胞冻存
步骤a.选取P2代脂肪源间充质干细胞，骨髓源间充质干细胞，脐带源间充质干细胞，分别按1.5×106个/T75分别接种于T75培养瓶中，加入无血清培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；
步骤b.当细胞融合度达到90％时，使用胰蛋白酶消化，继续传代培养至P5代；
步骤c.将消化后的P5代细胞按1×106个/ml，采用本发明实施例1-6及对比例1-5提供的细胞冻存液冻存，调整细胞密度至1×106个/ml后，放置于-80℃冰箱中，在-80℃冰箱放置24小时后移入液氮保存细胞
细胞活率：分别于1个月、6个月、12个月复苏脂肪源间充质干细胞，骨髓源间充质干细胞，脐带源间充质干细胞，每次复苏两管；具体步骤如下：从液氮中取出细胞，于37℃的水中迅速溶解，把细胞悬液分别转移至含有10mlDMEM基础培养基的50ml离心管中，200g离心5min，弃上清后用DMEM基础培养基重悬，并调整密度至1×106cells/ml。
本发明分别计算1、6和12个月细胞活率(重复3次计数)，结果如表1与表2所示，表1为本发明实施例1～6冻存的细胞复苏后的细胞活率。
表2为对比例1～5冻存的细胞复苏后的细胞活率
从表1中可看出，应用本发明实施例1～6提供的细胞冻存液，在复苏后，细胞活力平均在90％以上，最高能达到93％，其中以实施例3效果最佳，从表2中可看出，对比例1为使用维生素C代替本发明中的木瓜提取液，其余均与实施例3相同，可见其细胞活力与实施例3比较，其细胞活力平均在80％左右，而本发明的细胞活力在93％，维生素C具有抗氧化作用，能够保护结构组织不被自由基破坏，进而起到保护细胞的作用，从而延长细胞的存活期，而本发明的木瓜含木瓜酶、皂甙、黄酮类、齐墩果酸、苹果酸，酒石酸、柠檬酸、熊果酸、鞣酸，维生素C等成份。木瓜有较强的抗氧化作用，保护组织不被自由基破坏，从表2也可以看出，其比选用维生素C效果更明显，对比例2～3选用是现有技术中的冻存液，可看出，本发明的细胞复苏的活率高于对比例2，对比例4～5的组分部分的含量在本发明的范围之外，从结果可看出，其细胞复苏的活率大大降低，表明，只有在特定范围之内，其才能发挥最佳效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。