本申请涉及防腐剂技术领域，特别是涉及一种复合防腐剂及其制备方法。
背景技术：
防腐剂是体外诊断试剂必不可缺少的成份，它能防止试剂因微生物的生长引起的腐败变质，使试剂在规定的环境中具有一定的有效性。在体外诊断试剂相关产品研发过程中，除了需要关注其准确性和重复性外，研发人员同样需要保证产品在保质期内的品质及产品的适用性、低毒高效、环境友好性，因此防腐剂的选择至关重要。
目前国内外体外诊断试剂大多数采用化学防腐剂，其中大部分都具有毒性，部分具有腐蚀性，对使用者及环境都存在潜在危险性及污染。因此，如何提供一种适用性广、低毒高效的防腐剂是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明的第一个目的为提供一种复合防腐剂；本发明的第二个目的为提供一种上述复合防腐剂的制备方法；本发明提供的复合防腐剂，经济实用、毒性小、对使用者及环境潜在危险小，且能够提升体外诊断试剂盒性能指标。
一种复合防腐剂，包括：相对于100体积份的复合防腐剂来说，
异噻唑啉酮1-50体积份
山梨酸钾1-30重量份
聚氧乙烯蓖麻油1-70体积份
抗氧化剂0.5-40重量份
余量为水。
优选地，上述复合防腐剂，包括：相对于100体积份的复合防腐剂来说，
异噻唑啉酮5-30体积份
山梨酸钾3-20重量份
聚氧乙烯蓖麻油1-50体积份
抗氧化剂1-30重量份
余量为水。
优选地，上述复合防腐剂，包括：相对于100体积份的复合防腐剂来说，
异噻唑啉酮10-30体积份
山梨酸钾5-10重量份
聚氧乙烯蓖麻油2-40体积份
抗氧化剂5-20重量份
余量为水。
优选地，所述抗氧化剂具体为edta-2na、抗坏血酸类抗氧化剂、氨基酸类抗氧化剂中的一种或多种。
优选地，所述抗坏血酸类抗氧化剂具体为抗坏血酸、抗坏血酸钠、抗坏血酸棕榈酯、异抗坏血酸、异抗坏血酸钠中的一种或多种。
优选地，所述氨基酸类抗氧化剂具体为蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、组氨酸中的一种或多种。
本发明还提供上述复合防腐剂的制备方法，包括以下步骤：
a、取山梨酸钾、抗氧化剂，加水溶解，混合均匀；
b、加入聚氧乙烯蓖麻油，混合混匀，再加入异噻唑啉酮，混合均匀；
c、加入水定容至所需的体积，即得。
防腐剂是一类能够杀灭或抑制微生物生长的化学物质，在液体试剂中发挥着重要的防腐作用，且只有在足够浓度并与微生物直接接触的情况下才能发挥作用。
常用防腐剂有硫柳汞、叠氮钠、抗生素等。硫柳汞在elisa(酶联免疫反应)试剂中曾普遍使用，但因其有毒，现较少或几乎不使用。抗生素根据其化学结构有着不同的抗菌谱，抗菌谱最广的也限于原核微生物。叠氮钠是目前体外诊断试剂盒最常用的防腐剂，但其对过氧化物酶、抗体的活性有一定的抑制作用。此外，叠氮钠和氰化物相似，有剧毒，且受热、摩擦等可能发生爆炸，在使用过程中对人体、环境潜在着较大的危险性。proclin系列防腐剂是supelco公司推出新一代高效生物防腐剂，具有广谱抗菌活性，同时能保持体系中酶的活性。但因其价格昂贵，现在只少量用于临床研究。因此，目前寻找一种价格合适、有效且无毒害作用的试剂防腐剂是非常必要的。
本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供一种复合防腐剂，经济实用、毒性小、对使用者及环境潜在危险小，且能够提升体外诊断试剂盒性能指标(如加速老化稳定性偏差减小，说明试剂盒防腐性能以及稳定性越好)。本发明提供的复合防腐剂，使用异噻唑啉酮、山梨酸钾、聚氧乙烯蓖麻油、抗氧化剂与水复配而成，各成分具有协同作用，其结果和单独使用有效成分时所需要的浓度相比，能够以更低的浓度使用。因此可以削减成本，且适用范围更广，可以长期维持杀菌、防腐效果，能普遍应用于各种体外诊断试剂。该防腐剂组合物使用方便简单，经济实用，可替代传统的叠氮钠、硫柳汞等对人体及环境毒害大的产品。本发明所述的防腐剂组合物ph适应范围在5.0-9.0。
本发明提供的复合防腐剂，克服了单一防腐剂对多种类的微生物杀菌、防腐效果不充分、缺乏效果的持续性的缺点，采用多种成分复合，并加入聚氧乙烯蓖麻油。聚氧乙烯蓖麻油易溶于水，能够乳化和溶解水不溶性的物质，增大其他抗氧化物质在水中的溶解度，使得异噻唑啉酮、山梨酸钾和抗氧化剂能够在水中稳定存在，并协同发挥抗氧化作用。具体而言，异噻唑啉酮为亲电活性杀菌剂，依靠其杂环上的活性部分与细菌体内蛋白质中dna分子上的碱基形成氢键，并在细菌的细胞上吸附，起到攻击细胞亲核的作用，从而破坏细胞内dna的结构起到杀菌的作用。当异噻唑啉酮与非离子型表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油合用时，具有较好的配伍作用，能大大增大其水溶性，使异噻唑啉酮杂环上的活性部分与细菌接触面增加，促进氢键形成速度。此外，山梨酸钾对ph值较敏感，聚氧乙烯蓖麻油在一定程度上能稳定试剂体系的的ph值。山梨酸钾具有较高的抗菌性能，抑制霉菌的生长繁殖，其主要是通过抑制微生物体内的脱氢酶系统，从而达到抑制微生物的生长和起防腐作用，因此异噻唑啉酮，山梨酸钾，聚氧乙烯蓖麻油配合使用能提高防腐剂的抗菌谱，稳定其抗菌活性。本发明提供的复合防腐剂为液体，使用更方便，可以用于体外诊断试剂，例如肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、谷丙转氨酶、谷草转氨酶等项目试剂体系。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中总胆固醇测定试剂37℃不同存放时间试剂测试结果与第0天测试结果间偏差的示意图；
图2为本发明实施例中甘油三酯测定试剂37℃不同存放时间试剂测试结果与第0天测试结果间偏差的示意图；
图3为本发明实施例中肌酐测定试剂37℃不同存放时间试剂测试结果与第0天测试结果间偏差的示意图；
图4为本发明实施例中尿酸测定试剂37℃不同存放时间试剂测试结果与第0天测试结果间偏差的示意图；
图5为本发明实施例中丙氨酸氨基转移酶测定试剂37℃不同存放时间试剂测试结果与第0天测试结果间偏差的示意图；
图6为本发明实施例中天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂37℃不同存放时间试剂测试结果与第0天测试结果间偏差的示意图；
图7为本发明实施例中总胆固醇测定试剂37℃不同存放时间不加防腐剂、加入复合防腐剂或对比防腐剂试剂测试结果与第0天测试结果间偏差的示意图；
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
请如图1至图7所示，本发明实施例提供一种复合防腐剂，包括：相对于100体积份的复合防腐剂来说，
异噻唑啉酮1-50体积份
山梨酸钾1-30重量份
聚氧乙烯蓖麻油1-70体积份
抗氧化剂0.5-40重量份
余量为水。
防腐剂是一类能够杀灭或抑制微生物生长的化学物质，在液体试剂中发挥着重要的防腐作用，且只有在足够浓度并与微生物直接接触的情况下才能发挥作用。
常用防腐剂有硫柳汞、叠氮钠、抗生素等。硫柳汞在elisa(酶联免疫反应)试剂中曾普遍使用，但因其有毒，现较少或几乎不使用。抗生素根据其化学结构有着不同的抗菌谱，抗菌谱最广的也限于原核微生物。叠氮钠是目前体外诊断试剂盒最常用的防腐剂，但其对过氧化物酶、抗体的活性有一定的抑制作用。此外，叠氮钠和氰化物相似，有剧毒，且受热、摩擦等可能发生爆炸，在使用过程中对人体、环境潜在着较大的危险性。proclin系列防腐剂是supelco公司推出新一代高效生物防腐剂，具有广谱抗菌活性，同时能保持体系中酶的活性。但因其价格昂贵，现在只少量用于临床研究。因此，目前寻找一种价格合适、有效且无毒害作用的试剂防腐剂是非常必要的。
本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供一种复合防腐剂，经济实用、毒性小、对使用者及环境潜在危险小，且能够提升体外诊断试剂盒性能指标(如加速老化稳定性偏差减小，说明试剂盒防腐性能以及稳定性越好)。本发明提供的复合防腐剂，使用异噻唑啉酮、山梨酸钾、聚氧乙烯蓖麻油、抗氧化剂与水复配而成，各成分具有协同作用，其结果和单独使用有效成分时所需要的浓度相比，能够以更低的浓度使用。因此可以削减成本，且适用范围更广，可以长期维持杀菌、防腐效果，能普遍应用于各种体外诊断试剂。该防腐剂组合物使用方便简单，经济实用，可替代传统的叠氮钠、硫柳汞等对人体及环境毒害大的产品。本发明所述的防腐剂组合物ph适应范围在5.0-9.0。
本发明提供的复合防腐剂，克服了单一防腐剂对多种类的微生物杀菌、防腐效果不充分、缺乏效果的持续性的缺点，采用多种成分复合，并加入聚氧乙烯蓖麻油。聚氧乙烯蓖麻油易溶于水，能够乳化和溶解水不溶性的物质，增大其他抗氧化物质在水中的溶解度，使得异噻唑啉酮、山梨酸钾和抗氧化剂能够在水中稳定存在，并协同发挥抗氧化作用。具体而言，异噻唑啉酮为亲电活性杀菌剂，依靠其杂环上的活性部分与细菌体内蛋白质中dna分子上的碱基形成氢键，并在细菌的细胞上吸附，起到攻击细胞亲核的作用，从而破坏细胞内dna的结构起到杀菌的作用。当异噻唑啉酮与非离子型表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油合用时，具有较好的配伍作用，能大大增大其水溶性，使异噻唑啉酮杂环上的活性部分与细菌接触面增加，促进氢键形成速度。此外，山梨酸钾对ph值较敏感，聚氧乙烯蓖麻油在一定程度上能稳定试剂体系的的ph值。山梨酸钾具有较高的抗菌性能，抑制霉菌的生长繁殖，其主要是通过抑制微生物体内的脱氢酶系统，从而达到抑制微生物的生长和起防腐作用，因此异噻唑啉酮，山梨酸钾，聚氧乙烯蓖麻油配合使用能提高防腐剂的抗菌谱，稳定其抗菌活性。本发明提供的复合防腐剂为液体，使用更方便，可以用于体外诊断试剂，例如肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、谷丙转氨酶、谷草转氨酶等项目试剂体系。
优选地，上述复合防腐剂，包括：相对于100体积份的复合防腐剂来说，
异噻唑啉酮5-30体积份
山梨酸钾3-20重量份
聚氧乙烯蓖麻油1-50体积份
抗氧化剂1-30重量份
余量为水。
优选地，上述复合防腐剂，包括：相对于100体积份的复合防腐剂来说，
异噻唑啉酮10-30体积份
山梨酸钾5-10重量份
聚氧乙烯蓖麻油2-40体积份
抗氧化剂5-20重量份
余量为水。
优选地，所述抗氧化剂具体为edta-2na、抗坏血酸类抗氧化剂、氨基酸类抗氧化剂中的一种或多种。
优选地，所述抗坏血酸类抗氧化剂具体为抗坏血酸、抗坏血酸钠、抗坏血酸棕榈酯、异抗坏血酸、异抗坏血酸钠中的一种或多种。
优选地，所述氨基酸类抗氧化剂具体为蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、组氨酸中的一种或多种。
本发明还提供上述复合防腐剂的制备方法，包括以下步骤：
a、取山梨酸钾、抗氧化剂，加水溶解，混合均匀；
b、加入聚氧乙烯蓖麻油，混合混匀，再加入异噻唑啉酮，混合均匀；
c、加入水定容至所需的体积，即得。
实施例1
防腐剂组合物，所述组分比例如下：
实施例2
防腐剂组合物，所述组分比例如下：
实施例3
防腐剂组合物，所述组分比例如下：
实施例4
防腐剂组合物，所述组分比例如下：
实施例5
防腐剂组合物，所述组分比例如下：
实施例6
防腐剂组合物，所述组分比例如下：
实施例7
将实施例1-6制得的体外诊断试剂的复合防腐剂，分别加入到总胆固醇测定试剂、甘油三酯测定试剂、肌酐测定试剂、尿酸测定试剂、丙氨酸氨基转移酶测定试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂中，进行具体实验。所述复合防腐剂按2.5％(v/v)的量加入各体外诊断试剂中。同时取未加入复合防腐剂的各体外诊断试剂加2.5％(v/v)的水作为对照。
所述各体外诊断试剂的质控品为：迈瑞常规生化复合定值合质控品：
总胆固醇(tc)：正常水平靶值：2.00mmol/l，病理水平靶值：5.04mmol/l；
甘油三酯(tg)：正常水平靶值：1.16mmol/l，病理水平靶值：2.54mmol/l；
肌酐(cre)：正常水平靶值：96.2μmol/l，病理水平靶值：369.0μmol/l；
尿酸(ua)：正常水平靶值：283μmol/l，病理水平靶值：653μmol/l；
丙氨酸氨基转移酶(alt)：正常水平靶值：59.2ul，病理水平靶值：148u/l；
天门冬氨酸氨基转移酶(ast)：正常水平靶值：46.7ul，病理水平靶值：157u/l；
实验条件：37℃、7天加速稳定性试验：
1)取4℃储存的体外诊断试剂对生化分析仪进行校准，并分别检测相应质控品，所得检测值为第0天的检测值；
2)将1)中体外诊断试剂分为两组，一组加入复合防腐剂，另一组不加复合防腐剂，并同时放入37℃恒温箱中；
3)从放入37℃恒温箱后1天开始，每天在生化分析仪上分别测定质控品，直到第7天。
(1)总胆固醇测定试剂的检测结果如表1、表2与附图1所示：
表1.总胆固醇测定试剂检测结果(单位：mmol/l)
表2.总胆固醇测定试剂性状
(2)甘油三酯测定试剂的检测结果如表3、表4与附图2所示：
表3.甘油三酯测定试剂检测结果(单位：mmol/l)
表4甘油三酯测定试剂性状
(3)肌酐测定试剂如表5、表6与附图3所示：
表5.肌酐测定试剂检测结果(单位：μmol/l)
表6.肌酐测定试剂性状
(4)尿酸测定试剂如表7、表8与附图4所示：
表7.尿酸测定试剂检测结果(单位：μmol/l)
表8.尿酸测定试剂性状
(5)丙氨酸氨基转移酶测定试剂如表9、表10与附图5所示：
表9.丙氨酸氨基转移酶测定试剂检测结果(单位：u/l)
表10.丙氨酸氨基转移酶测定试剂性状
(6)天门冬氨酸氨基转移酶试剂如表11、表12与附图6所示：
表11.天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂检测结果(单位：u/l)
表12.天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂性状
由实施例7的(1)至(2)中的试验结果可知，未加复合防腐剂的试剂随着37℃孵育时间的推移，试剂底部出现不溶性沉淀,且37℃放置时间越长沉淀越多，试剂测试值明显下降，而加入了实施例1、2中制得的复合防腐剂后的试剂随着37℃孵育时间的推移，试剂底部未见明显沉淀，且试剂的测试值下降趋势明显减缓，37℃、7天加速试验后，测试值与第0天间的偏差在10％以内。实施例7(3)至(6)(实验例3-6)结果与实验例1-2类似，加复合防腐剂后对试剂的加速稳定性均有提高。
实施例8
将本发明提供的复合防腐剂，与其他成分不同的对比防腐剂(具体为防腐剂1-3)，分别加入到总胆固醇测定试剂中，进行具体实验。所述复合防腐剂、防腐剂1-3分别按2.5％(v/v)的量加入各体外诊断试剂中。本实验实施例使用的复合防腐剂及防腐剂1-3，组分比例分别如下：
复合防腐剂
防腐剂1
防腐剂2
防腐剂3
总胆固醇测定试剂的检测结果如表13、表14与附图7所示：
表13.总胆固醇测定试剂检测结果(单位：mmol/l)
表14.总胆固醇测定试剂性状
本发明提供的复合防腐剂，具有优良防腐剂的特性，能有效抑制在试剂盒制备、保存和使用过程中最有可能污染的一种或多种微生物的生长；同时对大多数细菌、真菌及酵母有较强的抑制作用。且本发明提供的复合防腐剂为液体，在试剂中有足够的溶解度，可以保证其在两相或多相体系的试剂中具有足够浓度，且稳定、不受试剂影响，可以在长时间内起到防腐的作用，同时，制备和使用成本低，容易获得。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。