本发明涉及分子生物学实验中植物组织培养技术，尤其涉及一种高效的山桐子组织培养快繁方法。
背景技术：
山桐子(idesiapolycarpamaxium.)是大风子科山桐子属多年生木本植物，广布于东亚地区。该植物株型优美，习性强健，生长迅速，可广泛用于行道绿化、木材加工、生物能源和新药研发等，尤其是其在粮油开发和新能源应用领域具有巨大潜力，对地方扶贫、环境资源开发利用和生态恢复保护有着重要意义。
本发明在前期对山桐子高产、高含油率优良株系选育的基础上，建立了高效山桐子组织培养再生体系，可为山桐子的规模化种植提供大量健壮脱毒种苗。与现有技术相比，本技术具有繁殖速度快，扩增系数高，培育体系稳定等优点。
经检索，目前关于山桐子无性繁殖方式的相关专利主要有以下几种：
中国发明专利cn103766128a公布了一种山桐子苗无性快繁方法。主要包括以下步骤：母株的筛选、采穗前处理、采穗与扦插、育苗、出圃和继代培养。该发明的山桐子苗无性快繁方法，比当时技术的组织培养的方法，步骤简单，技术以及设备要求低，成本低廉，同时山桐子苗的培养采用优良母株的枝条，能够实现大规模的快速繁殖。
中国发明专利cn105123282a公开了一种山桐子的嫁接方法，包括以下方面：(1)接穗的选择1～2年生健壮、芽饱满的木质化枝条作接穗；(2)砧木的选择：选择一年生小苗落叶进入休眠期～翌年三月中旬，此期间进行嫁接；(4)嫁接方式：劈接；(5)接穗处理；(6)砧木处理；(7)结合：将接穗直接插入砧木劈口，接穗削口上端留0.1～0.2cm；用塑料薄膜绑住，并将砧木上端切口包紧；同时，在接穗削口上端处涂上石蜡或蜂蜜。
中国发明专利cn1802903a公开了一种山桐子的组织培养方法，它基本上由下列步骤组成：1.将培养基高温高压消毒待用，2.采用优良种源优良单株的腋芽茎段为外植体，经酒精和升汞溶液消毒，用无菌水冲洗，3.将消毒的外植体接种培养基中，置于人工提供的日光灯下，分化长成芽苗，4.将芽苗剪切，接种于增殖培养基中，进行增殖培养，5.将试管芽苗，剪切，接种于壮苗培养基中，进行壮苗培养，6.将试管壮苗去掉基部愈伤组织和部分叶片，留3-5叶片，接种于生根培养基中，进行生根培养，7.将带有完整根的小苗，取出清洗，移栽到含有砻糠灰+黄心土的基质中，浇透水，前10天遮光70％，后逐渐见光，20天后生根成活，生根率达85％以上，35-45天后，全光照。
尽管扦插和嫁接两种无性繁殖技术也能较好的区分雌雄株，并保留母株的优良遗传性状，但这两种繁殖方式也存在很多缺点。首先，扦插和嫁接技术会引入母株所携带的病毒或病原菌，进而在大规模生产时容易导致品系退化；其次，扦插和嫁接技术均需要选用大量的母株枝条作为插穗或接穗,而新选育的优良株系却无法提供太多的穗源，只有通过多年的采穗圃构建，才能满足扦插和嫁接所需的大量穗源，这大大限制了选育新品系的品种审定和推广；第三，扦插和嫁接技术对枝条的生长年份、长度和生长周期等均有一定的要求，且受季节影响，难以全年持续化生产。
另外已有的组织培养技术方法目前仍存在繁育步骤复杂、繁育周期较长、扩增系数低和生根周期长等问题。因此需要开发一种新的高效组织培养快繁方式来解决上述这些问题。
技术实现要素：
本发明的目的就在于提供一种高效的山桐子组织培养快繁方法，即通过建立山桐子组织培养的快繁体系，获得山桐子优良株系的大量脱毒种苗，为下一步的该优良株系的新品种审定和规模化推广种植提供充足的种苗来源。
本发明的目的是这样实现的，具体地说：
1、本方法包括下列步骤：
①外植体消毒
用于新生芽诱导的外植体为扦插苗或含冬芽的成年树枝条的侧芽或顶芽部分；
外植体植株首先放置于洁净室内环境2～5天，然后剪取外植体用0.2％新洁尔灭浸泡1～3h，75％酒精消毒30～45秒2次，再用0.1％升汞溶液+几滴洗洁精消毒6～16分钟，再使用无菌水冲洗5次以上；
②新生芽诱导
新生芽诱导所用的培养基为：ms+0.5～1.0mg/l6ba+0.03～0.2mg/liaa+0.03～0.1mg/lga3，蔗糖浓度为3.5％；
③芽苗诱导
芽苗诱导所用的培养基为：芽分化所用培养基为：b5+0.2～1.0mg/l+0.01～0.05mg/liaa+0.01～0.05mg/ltdz，蔗糖浓度为3.5％；
④壮苗
壮苗所用培养基为：ms+0.2～0.8mg/l6ba+0.03～0.1mg/liaa+0.2～0.8mg/ltiba+200mg/lca，蔗糖浓度为3.5％，将诱导的芽苗切成小块，切面朝下接种于培养基上；
⑤根的诱导
根的诱导所用培养基为：1/2ms+0.5～1.0mg/liba+0.1～0.2mg/liaa+200mg/lca，蔗糖浓度为3％；
⑥炼苗及移栽
炼苗用土：泥炭：椰砖：蛭石＝1：1：1，高温高压灭菌后混匀，分装，待晾干后使用；
组织培养苗开盖放置3天，将其移植入炼苗土中，根分化部位裸露在外，保持空气湿度80％，散射光，25±3℃培养至有新芽萌发后，移入大棚或温室。
工作原理：
植物细胞具有全能性，具有通过脱分化再分化生成完整植株的能力；通过在不同阶段施加不同配比的外源生长调节剂，例如细胞分裂素，使得植物细胞逐步分化成完整植株。
2、本方法的用途
山桐子是一种本土木本油料树种，其果实含油量高，且富含人体必需不饱和脂肪酸亚油酸；山桐子具有丰产性好、树形美观、适应性强、生长速度快和树木材质好等特征，因此可广泛应用于环保绿化以及生物柴油和优质食用油的制备，所以说山桐子是一种高碳汇高附加值的经济树种。
本方法可快速获得山桐子优良株系的大量种苗，并迅速规模化推广种植。
本发明具有下列优点和积极效果：
①能将经选育的高产、高含油率的山桐子株系通过组织培养快速繁殖获得大量种苗；
②本发明的优点在于整个培养周期时间短，仅需2～3个月，扩繁系数高且可重复利用每代切除的基部进行下一代增殖，生根繁密健壮易于成活，炼苗成活率高；
③可提供具有稳定优良遗传性状、且无病毒和病原菌积累的大量种苗，从而为山桐子规模化种植并推动山桐子整个产业链的发展奠定基础。
附图说明
图1是以侧枝为外植体诱导新生芽12天时的照片；
图2是芽苗诱导的照片；
图3是壮苗14天的照片；
图4是壮苗28天的照片；
图5是诱导生根12天的照片；
图6是诱导生根21天的照片；
图7是诱导生根35天的照片；
图8a是炼苗一周的照片之一，图8b是炼苗一周的照片之二；
图9是炼苗一个月，移栽温室一周的照片。
缩略语注释：
1、6ba：6-苄基氨基嘌呤；
2、iba：吲哚乙酸；
3、tdz：噻重氮苯基脲；
4、ga3：赤霉素3；
5、ca：水解酪氨酸；
6、tiba：三碘苯甲酸。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细说明：
一、方法
①外植体消毒
用于新生芽诱导的外植体为扦插苗或含冬芽的成年树枝条的侧芽或顶芽部分；
外植体植株首先放置于洁净室内环境2-5天，然后剪取外植体用0.2％新洁尔灭浸泡1-3h，75％酒精消毒30-45秒2次，再用0.1％升汞溶液+几滴洗洁精消毒6-16分钟，再使用无菌水冲洗5次以上；
②新生芽诱导
新生芽诱导所用的培养基为：ms+1.0mg/l6ba+0.03mg/liaa+0.03mg/lga3，蔗糖浓度为3.5％；
一般多选用茎段的侧芽作为外植体，顶芽易造成污染，可于消毒前用小刀切去；培养约10～15天新生侧芽长长，可进行下一步，如图1所示；
③芽苗诱导
芽苗诱导所用的培养基为：芽分化所用培养基为：b5+0.8mg/l6ba+0.03mg/liaa+0.02mg/ltdz，(蔗糖浓度为3.5％)；
芽苗诱导的材料可选用新生枝条或步骤⑤根的诱导后剩余的基部，诱导的芽苞数目与培养的时间相关，一般诱导14天左右即可，如图2所示；
④壮苗
壮苗所用培养基为：ms+0.5mg/l6ba+0.03mg/liaa+0.6mg/ltiba+200mg/lca，蔗糖浓度为3.5％，将诱导的芽苗切成小块，切面朝下接种于培养基上；14天左右芽苗从基部长出，如图3所示，28天新生嫩枝长度达5cm以上，如图4所示；
⑤根的诱导
根的诱导所用培养基为：1/2ms+0.8mg/liba+0.1mg/liaa+200mg/lca，蔗糖浓度为3％；
根的诱导切割的嫩枝长度在1.5～2.5cm，并保证枝条上有顶芽或侧芽，如图5所示为接种12天左右，在茎段下切口处开始萌生有根，图6所示为根的诱导21天时，新生的根上有侧根萌发，到第35天时，根系已完全适宜炼苗，如图7所示。在生根第21天至第35天开始炼苗，炼苗成活率在90％以上。
⑥炼苗及移栽
炼苗用土：泥炭：椰砖：蛭石＝1：1：1，高温高压灭菌后混匀，分装，待晾干后使用；
组织培养苗开盖放置3天，将其移植入炼苗土中，根分化部位裸露在外，保持空气湿度80％，散射光，25±3℃培养至有新芽萌发后，移入大棚或温室。如图8a图8b所示为炼苗一周后的组织培养苗，其中图8b中小苗已有新的根毛萌发。图9为组培苗炼苗一个月后移植温室一周的图片，小苗长势良好，叶片宽厚，且无病害迹象。