本发明涉及生物防治技术领域，具体涉及法尼醇在防治黑粉病中的应用。
背景技术：
黑粉病主要是由黑粉菌所引起的植物病害，据不完全统计，黑粉菌大约有1200种，可侵染4000多种植物，它们的寄主包括草科植物和世界上重要作物如：玉米、甘蔗、大麦、小麦、燕麦、高粱等。黑粉菌的特征是在侵染寄主的组织上形成成堆黑色粉状的冬孢子。
玉米和甘蔗是世界上主要的粮食作物，也是重要的生物质能源材料和饲料作物。由玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)引起的玉米黑粉病和甘蔗黑粉菌(Sporisorium scitamineum)引起的甘蔗黑粉病分别是影响两种作物产量和品质的主要病害。目前，防治甘蔗黑粉病和玉米黑粉病采用的措施包括选育和推广抗病品种和化学防治，但目前的防治措施并不能有效的防治病害。
法尼醇(Farnesol)分子式为C15H26O是一种倍半萜化合物，3,7,11-三甲基-2,6,10-十二烷三烯-1-醇，其同分异构体分为反-反式、反-顺式、顺-反式或顺-顺式，结构如下：
其天然存在于合金欢、巴西檀木、黄葵子、玫瑰香、茉莉及橙花的香精中，主要用于香料或者调配水果的食用香精。也具有保幼激素活性，可抑制昆虫的变态和成熟，使幼虫不能成蛹，蛹不能变为成虫，成虫不产卵，所以它也是一种杀虫剂。其低毒，安全，天然存在于环境中也可以被土壤微生物降解，具有很大应用前景。
法尼醇(Farnesol)也是真菌产生的一种小分子物质(QSM)，能调节细胞形态、生长、生物膜形成、抗氧化应激和菌体生活的其他过程。相关研究发现法尼醇(Farnesol)可以对白色念珠菌的菌丝形成、细胞壁维持、铁转运和热休克蛋白以及抗药性等相关基因有着明显的影响。据Machida报道，25μmol/L的法尼醇可以使酿酒酵母G1细胞周期停滞和细胞内二酰基甘油(DAG)水平显著降低，从而抑制其生长而不损害细胞活力；Lorek等发现法尼醇对黑曲霉的形态有影响，在浓度高于10mmol/L可以完全抑制分生孢子生长并导致环腺苷酸(cAMP)的水平10倍的下降；Dichtl等研究表明法尼醇抑制人类病原体烟曲霉(Aspergillus fumigatus)野生型细胞生长,作为细胞壁应激剂,抑制细胞壁完整性信号通路,导致tiplocalized Rho蛋白错误定位,引发菌丝形态问题；法尼醇对禾谷镰刀菌(Candida dubliniensis)具有诱导细胞凋亡和影响大分生孢子产生、发育、萌发、存活的作用，另外法尼醇能抑制耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)多药物外排泵,降低溴化乙锭和利福平对耻垢分枝杆菌的最小抑制浓度。因此法尼醇可作为潜在的新型杀菌剂。
技术实现要素：
本发明的目的在于发明法尼醇在防治黑粉菌中的一个新用途。
本发明提供的技术方案是：法尼醇在对甘蔗黑粉菌和玉米黑粉菌的萌发、生长和有性配合的抑制中的应用。
所述的法尼醇有着广泛的生产来源，可以从罗汉果等植物中提取、微生物中提取或人工化学合成。将所述法尼醇溶于乙醇后制成水分子分散剂，然后分别处理在甘蔗黑粉病菌和玉米黑粉菌上，观察其抑菌效果。
本发明中，法尼醇抑制甘蔗黑粉菌冬孢子萌发的最低有效浓度为1.0μm；法尼醇抑制甘蔗黑粉菌生长的最低有效浓度为0.325μm；法尼醇有效抑制甘蔗黑粉菌有性配合菌丝生长的最低浓度为0.04μm。
基于以后生产应用成本控制，本发明提供所述法尼醇应用浓度为0.01～5μm应用于防治甘蔗黑粉病和玉米黑粉病。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本试验首次将真菌产生的信号小分子法尼醇作为杀菌剂，探索其本身的最佳使用浓度以及，为开发防治甘蔗黑粉病药剂提供理论依据，从而实现甘蔗产业的绿色可持续发展，为国民经济的蓬勃发展贡献力量。同时也响应减施农药的政府理念，达到农药零增长的目标，走环境友好型的生态文明道路。
2.法尼醇(Farnesol)作为真菌产生的一种信号小分子，它可以影响菌丝形成、生物膜形成以及一些氧化应激反应，调控细胞形态，在真菌致病有着重要作用。本试验首次将法尼醇作为一种杀菌剂来防治甘蔗黑粉病进行研究，与传统的杀菌剂相比，法尼醇作为杀菌剂具有绿色，安全，天然存在于环境中也可以被土壤微生物降解等优点。其应用研究还处于起步阶段，研究具有新颖性。
总体来说，本发明将法尼醇开发成一种新型高效的杀菌增效剂在防治植物病害中具有光明前景。
附图说明
图1是法尼醇对甘蔗黑粉菌冬孢子的抑制效果图。其中：图中箭头所指为未萌发的孢子。
图2是法尼醇对甘蔗黑粉菌两种担孢子增殖的毒力效果图。其中：图2A是法尼醇对WT17增殖毒力作用，图2B法尼醇对是WT18增殖毒力作用。
图3是法尼醇对甘蔗黑粉菌(WT17)的毒力作用菌落图，其中：3A:CK；3B:0.4μM Farnesol；3C:0.6μM Farnesol；3D:0.8μM Farnesol；3E:1.0μM Farnesol。
图4是法尼醇对甘蔗黑粉菌(WT18)的毒力作用菌落图，其中：4A:CK；4B:0.4μM Farnesol；4C:0.6μM Farnesol；4D:0.8μM Farnesol；4E:1.0μM Farnesol。
图5是法尼醇对玉米黑粉菌(U9)的毒力作用菌落图，其中：5A:CK；5B:乙醇；5C:0.4μM Farnesol；5D:1μM Farnesol。
图6是法尼醇对甘蔗黑粉菌菌丝生长的抑制作用图，其中：6A:MM；6B:MM+1％Ethanol；6C:MM+0.1μM Farnesol；6D:MM+0.5μM Farnesol。
图7是不同浓度法尼醇对甘蔗黑粉菌有性配合的作用效果图，其中：Eth为乙醇溶剂对照。
图8是法尼醇对甘蔗黑粉菌(WT17)单菌落生长抑制图，其中：8A:CK；7B:1％Ethanol；8C:0.1μM Farnesol；8D:0.5μM Farnesol。
图9是法尼醇对甘蔗黑粉菌(WT18)单菌落生长抑制图，其中：9A:CK；9B:1％Ethanol；9C:0.1μM Farnesol；9D:0.5μM Farnesol。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
1.1供试材料
法尼醇从sigma公司购买所得，CAS Number:4602-84-0。并将所述法尼醇用无水乙醇稀释成浓度为3.98mm母液备用。供试甘蔗黑粉病菌冬孢子采自广西田间自然发病的甘蔗黑粉病植株，供试的一对甘蔗黑粉病菌担孢子WT17、WT18为该甘蔗黑粉病病株上冬孢子分离所得，并经鉴定二者分别为“+”和-”的单倍体，能相互识别，进行有性配合产生双倍体菌丝，而U9、U10是玉米黑粉菌为实验室保存。本实验室所用培养液为YEPSA+0.05％甘油。
1.2供试培养基
YEPSA培养基：酵母浸出物10g、蛋白胨20g、蔗糖20g、琼脂18g，加去离子水定容至1000m L后常规灭菌。YEPS液体培养基：不加琼脂的YEPSA培养基。培养基在使用时均添加0.5％甘油助溶。
实施例1
在预备试验的基础上，先将法尼醇用YEPS液体培养基配置成一定浓度梯度(0μM、2.5μM、5μM、10μM)的母液备用。再从采集新鲜甘蔗黑粉病标样中刮下冬孢子，用YEPS液体培养基制成冬孢子悬浮液(5×104个/ml)。分别吸取不同浓度的母液200μl到2ml灭菌离心管中，加入等量体积的冬孢子悬浮液混匀，以不加药剂的YEPS作为对照。各药剂浓度设置三个重复，将各处理放于28℃，200rpm/min摇床中培养6h后，镜检各冬孢子萌发情况，记录100个冬孢子中萌发的数量，计算抑制率。
实验结果(参见图1)，在摇床中培养6h后，对照组的萌发率达到85％以上，添加法尼醇的处理中萌发率均有所下降，当其浓度为0.5um时萌发率为51％，1.0um时萌发率为7.9％。
实施例2
在预备试验的基础上，先将法尼醇用YEPS液体培养基配置成一定浓度梯度(0μM、0.5μM、0.8μM、1μM、2μM、4μM、6μM、8μM、9μM、10μM、20μM)的母液备用。从平板上挑取少许甘蔗黑粉菌担孢子于6mlYEPS培养液中过夜培养作为种子液，次日离心收集菌体，用YEPS液体培养基重悬菌体(OD600为0.2)待用。分别吸取200μl不同浓度母液到2ml灭菌离心管中，加入等量的担孢子悬浮液混匀，以不加药剂YEPS液体培养基为对照，各浓度处理设置三个重复。然后用分光光度计测量各处理起始OD600后，置于28℃，200rpm/min摇床中培养20h，在测得各处理的最终OD600，通过计算OD600净增长量，求出抑制率、毒力回归方程、相关系数和EC50。
实验结果参见图2A、2B，表1。其中，表1是对两种担孢子的毒力水平统计。实验结果显示法尼醇对甘蔗黑粉菌的两种担孢子均有毒力作用，可以抑制其增殖生长。且抑制作用会随着浓度的降低而减弱，在面对高浓度法尼醇时WT18型担孢子更加敏感，几乎不生长。法尼醇对甘蔗黑粉菌两种担孢子都有明显抑制作用，其毒力方程见表1。
表1：法尼醇对甘蔗黑粉病菌担孢子增殖的毒力水平
实施例3
在预备试验的基础上，先将法尼醇用YEPS液体培养基配置成一定浓度梯度(0μM、8μM、12μM、16μM、20μM)的母液备用。从分别从平板上挑取少许甘蔗黑粉菌和玉米黑粉菌担孢子于6mlYEPS培养液中过夜培养作为种子液,次日转接500μl至50mlYEPS培养液中扩大培养(至OD600为0.2)，分别吸取不同浓度的母液500μl到5ml灭菌离心管中，加入等体积的菌液混匀，置于28℃，200rpm/min摇床中培养12h。随后用新鲜YEPS液体培养基将各浓度处理的菌液稀释104倍，吸取200μl涂布于YEPSA固体培养基上，置于28℃培养箱中静置培养48h。最后观察抑菌效果，统计菌落数量。
实验结果(参见图3、图4、图5)，通过统计菌落数量得到，甘蔗黑粉病菌担孢子在含Farnesol的平板上生长，当浓度达到0.4μM时菌落数量减少50％，在1μM减少98％以上；玉米黑粉菌担孢子在0.4μM菌落数量减少90％以上，其杀菌效果更显著。
实施例4
将法尼醇按不同浓度溶于MMA固体培养基中，倒入直径为9cm培养皿中制成含药平板。将WT17和WT18从平板上刮少许于6mlYEPS液体培养基中在28℃、200rpm/min培养24h作为种子液，随后收集菌体。用MM液体培养基重悬为OD600为1后，两种担孢子等体积混匀，分别取1.5μl菌悬浮液点在不同浓度(0μM、0.1μM、0.5μM、1μM)的含法尼醇平板上，待表面水分吸干后，置于28℃培养箱中静置培养，每个浓度处理设置三个重复。置于28℃培养箱中静置培养24h，用体视镜观察菌丝生长情况，其抑制效果参见图6。实验结果表明，黑粉菌菌丝生长对法尼醇十分敏感，在0.1μM的含药平板下就完全不长菌丝，而在0.5μM法尼醇影响下，其生长都受到严重抑制，菌落生长变得稀疏，缓慢。
实施例5
将法尼醇溶于无水乙醇，配置不同浓度梯度(0μM、1μM、2μM、4μM、6μM、8μM、10μM)溶液作为测试液。采用24孔聚苯乙烯板测定法尼醇抑菌效果，于每个孔中加入1mlYEPEA和10μl测试液，每个浓度设置3个重复，不加药的培养基作空白对照。将WT17和WT18从平板上刮少许于6mlYEPS液体培养基中在28℃、200rpm/min培养24h作为种子液，随后收集菌体。用MM液体培养基重悬为OD600为1后，两种担孢子等体积混匀，分别取1.5μl菌悬浮液点在不同浓度的含法尼醇平板上，待表面水分吸干后，置于28℃培养箱中静置培养，每个浓度处理设置三个重复。置于28℃培养箱中静置培养48h用体视镜观察菌丝生长情况，其抑制效果图如下。
实验结果(参见图7),图中结果显示，随法尼醇浓度降低，甘蔗黑粉菌两性配合体会逐渐形成白色菌丝，且当法尼醇0.01μM时就会抑制菌丝形成，而0.04μM时抑制菌丝形成的效果更明显。
实施例6
将法尼醇按不同浓度(0μM、0.1μM、0.5μM)溶于YEPSA固体培养基中，倒入直径为9cm培养皿中制成含药平板。将WT17和WT18从平板上刮少许于6mlYEPS液体培养基中在28℃、200rpm/min培养24h作为种子液，随后收集菌体。用MM液体培养基重悬为OD600为2后，分别取1.5μl菌悬浮液点在不同浓度的含法尼醇平板上，待表面水分吸干后，置于28℃培养箱中静置培养，每个浓度处理设置三个重复。置于28℃培养箱中静置培养24h，用体视镜观察菌体生长情况。其抑制效果参见图8，图9。由图中发现相比于空白对照，添加1％乙醇的培养基对两种担孢子有轻微影响，而添加法尼醇后其作用显著，造成大部分孢子死亡无法生长，并且法尼醇对两种担孢子生长均具有毒力作用。