本发明涉及生物制剂领域，特别涉及一种通过独特的制备工艺利用乙酸反式-2-己烯酯增强诱虫效果并提高释放效果的暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂及其制备方法和效果验证实验。
背景技术：
暗黑鳃金龟甲是一种严重危害花生作物的害虫，尤其是其幼虫蛴螬，可使花生减产10-20％，严重者可减产50％甚至颗粒无收，对花生产业造成巨大经济损失。摒弃化学农药的污染环境杀虫方式以及诱虫灯的物理成本高方式，目前利用性信息素作为诱虫剂实施的生物农药方式成为无公害除害虫的主要研究方向，山东省花生研究所的相关研究表明，利用金龟甲昆虫性信息素已经研制出信息素速释棉花诱芯诱虫制剂、糊状诱虫缓释剂，但进一步研究发现加入适量乙酸反式-2-己烯酯可使得诱虫效果的增效率能达原诱虫量的 150％～200％[n]，但该成分的加入，不能沿用原有金龟甲昆虫性信息素糊状引诱剂[m]的制剂形式，因此寻找使信息素发挥更佳的诱虫效果的能进行工业化生产的缓释剂型及工艺，成为满足生物农药新型制剂的需要。本所在前申请的制剂专利中，以中国发明专利CN103828808A、CN106818838A为代表，虽然在长效环保和生产推广上取得了一定程度的进步，但在缓释效果和诱虫效果上优于诱导剂于辅料的比例配合及工艺上的瑕疵，长效均匀释放和提高诱虫数量两方面，仍未达到理想效果。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是如何克服现有技术的上述缺陷，旨在提高释放时效、释放均匀性、诱虫数量三方面，本发明
提供一种暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂，具体技术特征如下：
本凝胶剂由如下原料组分——性信息素、增效剂、缓释载体、缓释载体辅助剂、增溶剂和润湿剂制备而成，其中，
所述原料组分具体为——性信息素为L-异亮氨酸甲酯和(R)-(-)-芳樟醇、所述增效剂为乙酸反式-2-己烯酯、所述缓释载体为羧甲基纤维素钠、缓释载体辅助剂为羟丙基甲基纤维素、所述增溶剂为聚乙二醇、所述润湿剂为无水乙醇；其中所述性信息素和增效剂合称增效性信息素；
按重量份比例计，所述增效性信息素与增溶剂的重量份比例为1：13，所述增效性信息素与凝胶载体的重量份比例为1：0.5～20，所述凝胶载体、凝胶载体辅助剂的重量份比例为1：0.01～0.1；所述增效性信息素中，L-异亮氨酸甲酯、(R)-(-)-芳樟醇、乙酸反式-2-己烯酯三者的重量份比例为5～7：1：1.2～3.5。
作为具体配比优选方案，所述增效性信息素与增溶剂的重量份比例为1： 13，所述增效性信息素与凝胶载体的重量份比例为1：10，所述凝胶载体、凝胶载体辅助剂的重量份比例为1：0.05；所述增效性信息素中，L-异亮氨酸甲酯、(R)-(-)-芳樟醇、乙酸反式-2-己烯酯三者的重量份比例为6：1：1.4。
作为具体配方优化方案，所述缓释载体——羧甲基纤维素钠具体为 HPMC4000或HPMC6000，所述增溶剂——聚乙二醇具体为聚乙二醇400。
如此设计，所述性信息素成分中L-异亮氨酸甲酯呈固体状态、极易吸潮，而(R)-(-)-芳樟醇及增效剂乙酸反式-2-己烯酯均为液体状态，故形成的缓释制剂以半固体状态为佳。羧甲基纤维素钠高分子是纤维素羧甲基醚的钠盐，属阴离子型纤维素醚，无臭、无味，具吸湿性，易于分散在水中成骨架透明载体溶液，是一种安全的、易将小分子性信息素吸附于载体骨架上且不易于性信息素发生化学反应的释放载体材料，羧甲基纤维素钠结构如附图4所示，
由结构式可见，羧甲基纤维素钠具有羧酸钠盐结构，当遇到水时，钠离子易进入水中而使得小分子水进入其结构，形成饱和氢键，进而形成凝胶，但不同羧甲基纤维素钠浓度形成凝胶性质不同，故利用羟丙基甲基纤维素调节其粘度至生产分装工艺条件，达到易生产的目的。
本发明还提供一种暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂的制备方法，具体步骤如下：
步骤(1)——原料的称备：按上述的重量份配比，称得各原料组分备用，
步骤(2)——增效性诱素混合液的制备：将经步骤(1)称得的芳樟醇与乙酸反式-2-己烯酯用无水乙醇混匀为混合溶质、L-异亮氨酸甲酯与聚乙二醇混匀为混合溶剂，以等量递加法将混合溶质加入到混合溶剂中，得到增效性诱素混合液；
步骤(3)——凝胶缓释载体的制备：将经步骤(1)称得的羧甲基纤维素钠用去离子水浸泡24h，至形成透明溶液后，得凝胶缓释载体；
步骤(4)——凝胶粘度助剂的制备：将经步骤(1)称得的羟丙基甲基纤维素浸泡24小时，形成透明溶液后，得凝胶粘度助剂；
步骤(5)——增效性诱素缓释凝胶剂的制备：将经步骤(2)制得的增效性诱素混合液按等量递加法加入经步骤(3)制得的凝胶缓释载体，得到增效性诱素凝胶剂粗体，将增效性诱素凝胶剂粗体搅拌均匀后测试粘度，然后逐渐加入经步骤(4)制得的凝胶粘度助剂并实时监测粘度，至将增效性诱素凝胶剂粗体粘度调节为1500-3000Mpa.s之间，得增效性诱素缓释凝胶剂。
作为制备方法的条件限制，步骤(5)所述的增效性诱素混合液加入凝胶缓释载体过程在低于20℃条件下进行。
作为制剂的完整工艺补充，步骤(5)所述的增效性诱素缓释凝胶剂制得后，于凝胶灌装机中灌装后，密封包装，于25℃以下贮存。
本发明还提供一种黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂的特性检测方法，包括实验室对照和大田对照，具体步骤如下：
所述实验室验对照包括以下步骤，
步骤(1)——对照样品的制备：按照本发明所述的暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂中所示的重量份比例称取各原料组分，将各原料组分直接混合后得到对照样品A；按照本发明所述的暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂中所示重量份比例的性信息素、增效剂重量份比例，将增效剂乙酸反式-2-己烯酯，加入中国发明专利CN103828808A、CN106818838A所述的原料组分中，并按照其制备方法制备得到对照样品B、C。
步骤(2)——释放曲线对比：在质量区间0.5～1.5g范围内，精密称取若干份质量相同的所述黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂和经步骤(1)制得的对照样品A、B、C，敞口放置于20～35℃自然环境下，以24小时为取样间隔时间，分别测定1～30天药剂残余质量，将药剂残余质量转换为药物释放量，并以时间为横坐标、释放百分比为纵坐标，制作黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂和对照样品A、B、C的释放曲线；
如此设计，(1)为检验本剂型在黑鳃金龟诱导剂领域的释放特性，(2)为验证本暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂，与背景技术中所涉及的现有诱导剂、以及本单位在前申请的以CN103828808A、CN106818838A为代表的性信息素添加剂型，在进行非创造性直接技术特征置换后，所得的剂型，在释放效果上的对比。
所述大田对照包括以下步骤，
步骤(1)——对照样品的制备：按照本发明所述的暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂中所示的重量份比例称取各原料组分，将各原料组分直接混合后得到对照样品A；按照发明所述的暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂中所示的的性信息素、增效剂重量份比例，将增效剂乙酸反式-2-己烯酯，加入中国发明专利CN103828808A、CN106818838A所述的原料组分中，并按照其制备方法制备得到对照样品B、C。
步骤(2)——取若干份质量相同的所述黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂和经步骤(1)制得的对照样品A、B、C，大田中间隔间60米设置若干诱捕器，并将所述黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂和对照样品A、B、C分别放入等数量的诱捕器中，每5天调查记录一次各样品在一天内的诱虫数量，并进行种类和雌雄的鉴别。
如此设计，(1)为检验本剂型在黑鳃金龟诱导剂领域的效果特性，(2)为验证本暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂，与背景技术中所涉及的现有诱导剂、以及本单位在前申请的以CN103828808A、CN106818838A为代表的性信息素添加剂型，在进行非创造性直接技术特征置换后，所得的剂型，在诱虫效果上的对比。
本发明一种暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂除保持本所剂型传统的绿色环保的特点和良好的诱虫效果外，通过对诱导剂的合理选择、配合各组分剂量的调整、制备工艺的优化等手段，有效提高了制剂的诱虫效果和释放效果，具有对规模化生产具有显著的经济意义和生态意义。
附图说明
下面结合附图对本发明暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂及其制备和效验作进一步说明：
图1是本暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂的释放曲线；
图2是本暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂与对照样品A、B、C大田诱捕暗黑鳃金龟甲雄虫效果的对比直方图；
图3是本暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂与对照样品A、B、C大田诱捕暗黑鳃金龟甲雌虫效果的对比直方图；
图4是本暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂所述的羧甲基纤维素钠结构简式。
具体实施方式
实施例1：本暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂由如下原料组分——性信息素、增效剂、缓释载体、缓释载体辅助剂、增溶剂和润湿剂制备而成，其中，所述原料组分具体为——性信息素为L-异亮氨酸甲酯和(R)-(-)-芳樟醇、所述增效剂为乙酸反式-2-己烯酯、所述缓释载体为羧甲基纤维素钠、缓释载体辅助剂为羟丙基甲基纤维素、所述增溶剂为聚乙二醇、所述润湿剂为无水乙醇；其中所述性信息素和增效剂合称增效性信息素；按重量份比例计，所述增效性信息素与增溶剂的重量份比例为1：13，所述增效性信息素与凝胶载体的重量份比例为1：10，所述凝胶载体、凝胶载体辅助剂的重量份比例为1：0.05；所述增效性信息素中，L-异亮氨酸甲酯、(R)-(-)-芳樟醇、乙酸反式-2-己烯酯三者的重量份比例为6：1：1.4。所述缓释载体——羧甲基纤维素钠具体为 HPMC4000或HPMC6000，所述增溶剂——聚乙二醇具体为聚乙二醇400。
本暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂通过以下工艺步骤制备而成：
步骤(1)——原料的称备：按上述的重量份配比，称得各原料组分备用，
步骤(2)——增效性诱素混合液的制备：将经步骤(1)称得的芳樟醇与乙酸反式-2-己烯酯用无水乙醇混匀为混合溶质、L-异亮氨酸甲酯与聚乙二醇混匀为混合溶剂，以等量递加法将混合溶质加入到混合溶剂中，得到增效性诱素混合液；
步骤(3)——凝胶缓释载体的制备：将经步骤(1)称得的羧甲基纤维素钠用去离子水浸泡24h，至形成透明溶液后，得凝胶缓释载体；
步骤(4)——凝胶粘度助剂的制备：将经步骤(1)称得的羟丙基甲基纤维素浸泡24小时，形成透明溶液后，得凝胶粘度助剂；
步骤(5)——增效性诱素缓释凝胶剂的制备：将经步骤(2)制得的增效性诱素混合液按等量递加法加入经步骤(3)制得的凝胶缓释载体，得到增效性诱素凝胶剂粗体，将增效性诱素凝胶剂粗体搅拌均匀后测试粘度，然后逐渐加入经步骤(4)制得的凝胶粘度助剂并实时监测粘度，至将增效性诱素凝胶剂粗体粘度调节为1500-3000Mpa.s之间，得增效性诱素缓释凝胶剂；所述的增效性诱素混合液加入凝胶缓释载体过程在低于20℃条件下进行；所述的增效性诱素缓释凝胶剂制得后，于凝胶灌装机中灌装后，密封包装，于25℃以下贮存。
实施例2：本暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂由如下原料组分——性信息素、增效剂、缓释载体、缓释载体辅助剂、增溶剂和润湿剂制备而成，其中，所述原料组分具体为——性信息素为L-异亮氨酸甲酯和(R)-(-)-芳樟醇、所述增效剂为乙酸反式-2-己烯酯、所述缓释载体为羧甲基纤维素钠、缓释载体辅助剂为羟丙基甲基纤维素、所述增溶剂为聚乙二醇、所述润湿剂为无水乙醇；其中所述性信息素和增效剂合称增效性信息素；按重量份比例计，所述增效性信息素与增溶剂的重量份比例为1：13，所述增效性信息素与凝胶载体的重量份比例为1：1，所述凝胶载体、凝胶载体辅助剂的重量份比例为1：0.1；所述增效性信息素中，L-异亮氨酸甲酯、(R)-(-)-芳樟醇、乙酸反式-2-己烯酯三者的重量份比例为5：1：3.5。所述缓释载体——羧甲基纤维素钠具体为HPMC4000 或HPMC6000，所述增溶剂——聚乙二醇具体为聚乙二醇400。
本暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂通过以下工艺步骤制备而成：
步骤(1)——原料的称备：按上述的重量份配比，称得各原料组分备用，
步骤(2)——增效性诱素混合液的制备：将经步骤(1)称得的芳樟醇与乙酸反式-2-己烯酯用无水乙醇混匀为混合溶质、L-异亮氨酸甲酯与聚乙二醇混匀为混合溶剂，以等量递加法将混合溶质加入到混合溶剂中，得到增效性诱素混合液；
步骤(3)——凝胶缓释载体的制备：将经步骤(1)称得的羧甲基纤维素钠用去离子水浸泡24h，至形成透明溶液后，得凝胶缓释载体；
步骤(4)——凝胶粘度助剂的制备：将经步骤(1)称得的羟丙基甲基纤维素浸泡24小时，形成透明溶液后，得凝胶粘度助剂；
步骤(5)——增效性诱素缓释凝胶剂的制备：将经步骤(2)制得的增效性诱素混合液按等量递加法加入经步骤(3)制得的凝胶缓释载体，得到增效性诱素凝胶剂粗体，将增效性诱素凝胶剂粗体搅拌均匀后测试粘度，然后逐渐加入经步骤(4)制得的凝胶粘度助剂并实时监测粘度，至将增效性诱素凝胶剂粗体粘度调节为1500-3000Mpa.s之间，得增效性诱素缓释凝胶剂；所述的增效性诱素混合液加入凝胶缓释载体过程在低于20℃条件下进行；所述的增效性诱素缓释凝胶剂制得后，于凝胶灌装机中灌装后，密封包装，于25℃以下贮存。
实施例3：本暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂由如下原料组分——性信息素、增效剂、缓释载体、缓释载体辅助剂、增溶剂和润湿剂制备而成，其中，所述原料组分具体为——性信息素为L-异亮氨酸甲酯和(R)-(-)-芳樟醇、所述增效剂为乙酸反式-2-己烯酯、所述缓释载体为羧甲基纤维素钠、缓释载体辅助剂为羟丙基甲基纤维素、所述增溶剂为聚乙二醇、所述润湿剂为无水乙醇；其中所述性信息素和增效剂合称增效性信息素；按重量份比例计，所述增效性信息素与增溶剂的重量份比例为1：13，所述增效性信息素与凝胶载体的重量份比例为1：20，所述凝胶载体、凝胶载体辅助剂的重量份比例为1：0.01；所述增效性信息素中，L-异亮氨酸甲酯、(R)-(-)-芳樟醇、乙酸反式-2-己烯酯三者的重量份比例为7：1：1.2。所述缓释载体——羧甲基纤维素钠具体为 HPMC4000或HPMC6000，所述增溶剂——聚乙二醇具体为聚乙二醇400。
本暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂通过以下工艺步骤制备而成：
步骤(1)——原料的称备：按上述的重量份配比，称得各原料组分备用，
步骤(2)——增效性诱素混合液的制备：将经步骤(1)称得的芳樟醇与乙酸反式-2-己烯酯用无水乙醇混匀为混合溶质、L-异亮氨酸甲酯与聚乙二醇混匀为混合溶剂，以等量递加法将混合溶质加入到混合溶剂中，得到增效性诱素混合液；
步骤(3)——凝胶缓释载体的制备：将经步骤(1)称得的羧甲基纤维素钠用去离子水浸泡24h，至形成透明溶液后，得凝胶缓释载体；
步骤(4)——凝胶粘度助剂的制备：将经步骤(1)称得的羟丙基甲基纤维素浸泡24小时，形成透明溶液后，得凝胶粘度助剂；
步骤(5)——增效性诱素缓释凝胶剂的制备：将经步骤(2)制得的增效性诱素混合液按等量递加法加入经步骤(3)制得的凝胶缓释载体，得到增效性诱素凝胶剂粗体，将增效性诱素凝胶剂粗体搅拌均匀后测试粘度，然后逐渐加入经步骤(4)制得的凝胶粘度助剂并实时监测粘度，至将增效性诱素凝胶剂粗体粘度调节为1500-3000Mpa.s之间，得增效性诱素缓释凝胶剂；所述的增效性诱素混合液加入凝胶缓释载体过程在低于20℃条件下进行；所述的增效性诱素缓释凝胶剂制得后，于凝胶灌装机中灌装后，密封包装，于25℃以下贮存。
试验例：本黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂的特性检测方法，包括实验室对照和大田对照，具体步骤如下：
所述实验室验对照包括以下步骤，
步骤(1)——对照样品的制备：按照实施例1所述重量份比例称取各原料组分，将各原料组分直接混合后得到对照样品A；按照实施例1的性信息素、增效剂重量份比例，将增效剂乙酸反式-2-己烯酯，加入中国发明专利 CN103828808A、CN106818838A所述的原料组分中，并按照其制备方法制备得到对照样品B、C。
步骤(2)——释放曲线对比：在质量区间0.5～1.5g范围内，精密称取若干份质量相同的所述黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂和经步骤(1)制得的对照样品A、B、C，敞口放置于20～35℃自然环境下，以24小时为取样间隔时间，分别测定1～30天药剂残余质量，将药剂残余质量转换为药物释放量，并以时间为横坐标、释放百分比为纵坐标，制作黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂和对照样品A、B、C的释放曲线；如图1所示。
由图1可得，本黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂的释放规律方程为 Y＝0.0766X2-5.437X+101.53，R＝0.9978，每天释放量在4.517-5.437％范围内，在30天内以平稳减量释放，且在30天后依然有30％的剩余量，故本制剂在释放平稳性上和释放有效期上均优于对照样品A、B、C。
所述大田对照包括以下步骤，
步骤(1)——对照样品的制备：按照实施例1所述的暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂中所示的重量份比例称取各原料组分，将各原料组分直接混合后得到对照样品A；按照实施例1所述的暗黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂中所示的的性信息素、增效剂重量份比例，将增效剂乙酸反式-2-己烯酯，加入中国发明专利CN103828808A、CN106818838A所述的原料组分中，并按照其制备方法制备得到对照样品B、C。
步骤(2)——取若干份质量相同的所述黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂和经步骤(1)制得的对照样品A、B、C，大田中间隔间60米设置若干诱捕器，并将所述黑鳃金龟甲反式增效缓释凝胶剂和对照样品A、B、C分别放入等数量的诱捕器中，每5天调查记录一次各样品在一天内的诱虫数量，并进行种类和雌雄的鉴别，绘制诱虫对比直方图如图2、3所示。
由图2可得，与速释型对照相比，本发明的持效期多于30天。与照样品 A、B、C相比，本发明对雄虫的诱捕效果明显提高：相比对照样品B、C平均增加172.8％，相比对照样品A平均增加155.5％。
由图3可得，与照样品A、B、C相比，本发明对雌虫的诱捕效果也有明显提高：相比对照样品A平均增加平均增加217.4％，相比对照样品B、C平均增加平均增加171.2％。
综上所述，本发明制剂相对于现有产品进行直接有效组分置换、相对于本单位在先申请产品进行有效组分替换，在缓释释放效果、诱虫效果上均有显著提高，且该提高的发明点在于有效组分的选择、配方量的调整、制备方法的改进，另外，本发明的诱虫谱明显扩大，除暗黑鳃金龟甲外，还诱捕到一定数量的铜绿丽金龟甲、白星花金龟甲等害虫。
上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。