一种大量冻存间充质干细胞的冻存液及方法与流程

本发明涉及干细胞领域，更具体的说是涉及一种大量冻存间充质干细胞的冻存液及方法。

背景技术

目前，间充质干细胞的临床转化应用越来越广泛，临床应用中对于间充质干细胞数量的要求也越来越高。但是现有的间充质干细胞均用1ml或1.5ml冻存管冻存，对于多个患者使用时，需要一次性复苏几十管，操作极为繁琐，浪费时间和人力，且影响细胞的存活率。

此外，现有技术中的冻存液大多添加二甲基亚砜(dmso)，dmso是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，从而降低冻存对细胞的损伤；然而，dmso具有细胞毒性，深低温时，dmso的细胞毒性受到抑制，但复苏时对细胞造成的毒性却非常严重，因此，要求操作人员复苏细胞时动作迅速，尽快洗掉二甲基亚砜；显然，对于大量复苏冻存管冻存的间充质干细胞而言，即使操作人员操作熟练，也容易影响细胞的存活率。

因此，如何提供一种复苏简单、快速，细胞存活率高的间充质干细胞冻存液及冻存方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种大量冻存间充质干细胞的冻存液及方法，一次性可冻存2.5×10⁸-3.5×10⁸个间充质干细胞，复苏简单快速，细胞存活率高。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种大量冻存间充质干细胞的冻存液，包括：α-mem基础培养基，丙二醇，氮酮，白蛋白和低分子右旋糖酐；所述丙二醇的浓度为1.2-1.8mol/l，所述氮酮的浓度为0.5-4ml/100ml；所述白蛋白的浓度为8-12mg/ml，所述低分子右旋糖酐的浓度为7.5-8.5ml/100ml。

其中，丙二醇为一种渗透性细胞冻存保护剂，毒性远低于dmso，可减少冻存过程中渗透压的改变对细胞容积的影响，减少细胞内冰晶的形成，进而防止细胞形态崩解所造成的细胞冻存后死亡。

氮酮为一种无色至微黄色液体，无臭、无味、无毒。对亲油、亲水性活性成分均有明显的助渗作用，氮酮进入细胞内，与细胞内基质相作用，增强细胞膜的通透性，平衡细胞内外电解质的浓度，对冷冻细胞起到保护作用。

白蛋白为一种非渗透性细胞冻存保护剂，其分子量大，质量摩尔浓度低，可降低细胞外电解质浓度。

低分子右旋糖酐为一种非渗透性细胞冻存保护剂，可形成稳定的胶体溶液，保证冻存细胞质量的稳定性。

在大量冻存过程中上述冻存液成分相互配合既可缩短冻存时的相变时间，减少冰晶的产生，又可缩短复苏时的相变时间，避免产生再结晶导致细胞再次受到伤害。此外，本发明冻存液的共熔点温度低，利于间充质干细胞的大量冻存及快速复苏。并且，渗透性细胞冻存保护剂与非渗透性细胞冻存保护剂按特定比例相互协作，既减少了细胞内冰晶的形成，降低细胞外电解质浓度，又防止过度脱水所导致的细胞不可逆皱缩，进而避免复苏时极度膨胀所造成的细胞受损。

优选地，一种大量冻存间充质干细胞的冻存液，包括：α-mem基础培养基，丙二醇，氮酮，白蛋白和低分子右旋糖酐；所述丙二醇的浓度为1.5mol/l，所述氮酮的浓度为2ml/100ml，所述白蛋白的浓度为10mg/ml，所述低分子右旋糖酐的浓度为8ml/100ml。

一种大量冻存间充质干细胞的方法，使用上述冻存液对间充质干细胞进行冻存。

优选地，如上所述一种大量冻存间充质干细胞的方法，将上述冻存液注入50ml冻存袋中，对间充质干细胞进行冻存。

优选地，如上所述一种大量冻存间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

(1)配置上述冻存液，置于4℃储存备用；

(2)收集培养至细胞融合达85％以上的间充质干细胞，消化，稀释中和，离心；

(3)使用冻存液悬浮离心后的细胞沉淀，轻轻混匀，取样计数并进行无菌检测；

(4)将细胞悬液注入50ml冻存袋中，冰上操作；

(5)封口，于程序降温仪中降温至-80℃，液氮保存。

优选地，所述步骤(1)中配置好的冻存液分装为25-35ml/管，方便冻存使用。

进一步优选地，所述步骤(1)中配置好的冻存液分装为30ml/管。

优选地，所述步骤(2)中收集的间充质干细胞数量为2.5×10⁸-3.5×10⁸个。

进一步优选地，所述步骤(2)中收集的间充质干细胞数量为3×10⁸个。

优选地，所述步骤(3)中将所收集的间充质干细胞悬浮于30ml冻存液中，冻存液浓度达1×10⁷个/ml。

优选地，所述步骤(5)中的降温程序如下：

打开设备，迅速降温至4℃，放入样本后程序降温：

20℃/min，至箱体-4℃；

0.1℃/min，至样本4℃；

1℃/min，至样本-5℃；

0.5℃/min，至样本-11℃；

1℃/min，至样本-25℃；

5℃/min，至样本-80℃；

到达-80℃后即可取出样本，关机。

冻存液组成、用量，冻存细胞的浓度，冻存降温程序均会对复苏后间充质干细胞的存活率产生较大影响，本发明通过对冻存液、冻存细胞、冻存降温程序进行综合设计得到的冻存方法可保证间充质干细胞复苏存活率高，复苏简单方便易操作。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种大量冻存间充质干细胞的冻存液，将α-mem基础培养基，丙二醇，氮酮，白蛋白和低分子右旋糖酐以特定配比组合，形成的冻存液在大量冻存间充质干细胞时对细胞的损伤小，冻存细胞质量稳定，复苏时间短，存活率高。进一步地，本发明还提供了一种大量冻存间充质干细胞的方法，通过50ml冻存袋冻存间充质干细胞，在保证细胞冻存质量的同时，极大缩短复苏所需时间，简化了复苏流程，进而降低复苏时间过长对间充质干细胞的影响。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明实施例1细胞复苏后培养24h生长状态图(4×)。

图2附图为本发明实施例2细胞复苏后培养24h生长状态图(4×)。

图3附图为本发明实施例3细胞复苏后培养24h生长状态图(4×)。

图4附图为本发明对比例1细胞复苏后培养24h生长状态图(4×)。

图5附图为本发明对比例2细胞复苏后培养24h生长状态图(4×)。

图6附图为本发明对比例3细胞复苏后培养24h生长状态图(4×)。

图7附图为本发明对比例4细胞复苏后培养24h生长状态图(4×)。

图8附图为本发明对比例5细胞复苏后培养24h生长状态图(4×)。

图9附图为本发明对比例6细胞复苏后培养24h生长状态图(4×)。

图10附图为本发明对比例7细胞复苏后培养24h生长状态图(4×)。

图11附图为本发明对比例8细胞复苏后培养24h生长状态图(4×)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

配置一种大量冻存间充质干细胞的冻存液300ml，在α-mem基础培养基中添加丙二醇，氮酮，白蛋白和低分子右旋糖酐；其中，丙二醇的浓度为1.5mol/l，氮酮的浓度为2ml/100ml，白蛋白的浓度为10mg/ml，低分子右旋糖酐的浓度为8ml/100ml。

使用上述冻存液大量冻存间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

(1)配置上述冻存液，混合均匀后分装为30ml/管，置于4℃备用；

(2)收集t175培养瓶中细胞融合达85％以上的间充质干细胞30瓶，加入消化酶消化细胞后，用生理盐水稀释中和，1500rpm离心5分钟，弃上清；

(3)使用1管冻存液悬浮离心后的细胞沉淀，轻轻混匀，取样计数，间充质干细胞数量约为3×10⁸个；进行无菌检测，保证所冻存的间充质干细胞无污染；

(4)将步骤(3)中得到的细胞悬液注入50ml冻存袋中，冰上操作；冻存袋选用德国美天妮公司50ml血袋；

(5)对冻存袋进行标记，封口，于程序降温仪中降温至-80℃，降温程序如下：

1)打开设备，迅速降温至4℃，放入样本后程序降温：

2)20℃/min，至箱体-4℃；

3)0.1℃/min，至样本4℃；

4)1℃/min，至样本-5℃；

5)0.5℃/min，至样本-11℃；

6)1℃/min，至样本-25℃；

7)5℃/min，至样本-80℃；

到达-80℃后即可取出样本，关机。

降温后置于液氮中保存。

上述步骤均在无菌环境下操作。

细胞复苏时将冻存袋从液氮中取出，迅速置于37℃水浴箱中，1min内融化。在生物安全柜中，对冻存袋进行消毒，然后剪开冻存袋的细管，一次性将细胞悬液注入离心管中，使用生理盐水洗涤一次，即可发放给临床患者应用，复苏过程1人操作即可，从细胞融化到洗涤完成仅需5min。

实施例2

配置一种大量冻存间充质干细胞的冻存液300ml，在α-mem基础培养基中添加丙二醇，氮酮，白蛋白和低分子右旋糖酐；其中，丙二醇的浓度为1.2mol/l，氮酮的浓度为0.5ml/100ml，白蛋白的浓度为12mg/ml，低分子右旋糖酐的浓度为8.5ml/100ml。

使用上述冻存液大量冻存间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

(1)配置上述冻存液，混合均匀后分装为35ml/管，置于4℃储存备用；

(2)收集t175培养瓶中细胞融合达85％以上的间充质干细胞35瓶，加入消化酶消化细胞后，用生理盐水稀释中和，1500rpm离心5分钟，弃上清；

(3)使用1管冻存液悬浮离心后的细胞沉淀，轻轻混匀，取样计数，间充质干细胞数量约为3.5×10⁸个；进行无菌检测，保证所冻存的间充质干细胞无污染；

(4)将步骤(3)中得到的细胞悬液注入50ml冻存袋中，冰上操作；冻存袋选用德国美天妮公司50ml血袋；

(5)对冻存袋进行标记，封口，于程序降温仪中降温至-80℃，降温程序如实施例1，降温后置于液氮中保存。

上述步骤均在无菌环境下操作。

细胞复苏方法同实施例1。

实施例3

配置一种大量冻存间充质干细胞的冻存液300ml，在α-mem基础培养基中添加丙二醇，氮酮，白蛋白和低分子右旋糖酐；其中，丙二醇的浓度为1.8mol/l，氮酮的浓度为4ml/100ml；白蛋白的浓度为8mg/ml，低分子右旋糖酐的浓度为7.5ml/100ml。

使用上述冻存液大量冻存间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

(1)配置上述冻存液，混合均匀后分装为25ml/管，置于4℃备用；

(2)收集t175培养瓶中细胞融合达85％以上的间充质干细胞25瓶，加入消化酶消化细胞后，用生理盐水稀释中和，1500rpm离心5分钟，弃上清；

(3)使用1管冻存液悬浮离心后的细胞沉淀，轻轻混匀，取样计数，间充质干细胞数量约为2.5×10⁸个；进行无菌检测，保证所冻存的间充质干细胞无污染；

(4)将步骤(3)中得到的细胞悬液注入50ml冻存袋中，冰上操作；冻存袋选用德国美天妮公司50ml血袋；

(5)对冻存袋进行标记，封口，于程序降温仪中降温至-80℃，降温程序如实施例1，降温后置于液氮中保存。

上述步骤均在无菌环境下操作。

细胞复苏方法同实施例1。

对比例1

配置一种大量冻存间充质干细胞的冻存液，在α-mem基础培养基中添加氮酮，白蛋白和低分子右旋糖酐；其中，氮酮的浓度为2ml/100ml，白蛋白的浓度为10mg/ml，低分子右旋糖酐的浓度为8ml/100ml。

细胞冻存及复苏方法同实施例1。

对比例2

配置一种大量冻存间充质干细胞的冻存液，在α-mem基础培养基中添加丙二醇，白蛋白和低分子右旋糖酐；其中，丙二醇的浓度为1.5mol/l，白蛋白的浓度为10mg/ml，低分子右旋糖酐的浓度为8ml/100ml。

细胞冻存及复苏方法同实施例1。

对比例3

配置一种大量冻存间充质干细胞的冻存液，在α-mem基础培养基中添加丙二醇和氮酮；其中，丙二醇的浓度为1.5mol/l，氮酮的浓度为2ml/100ml。

细胞冻存及复苏方法同实施例1。

对比例4

配置一种大量冻存间充质干细胞的冻存液，在α-mem基础培养基中添加丙二醇，氮酮，白蛋白和低分子右旋糖酐；其中，丙二醇的浓度为3mol/l，氮酮的浓度为4ml/100ml，白蛋白的浓度为20mg/ml，低分子右旋糖酐的浓度为160ml/100ml。

细胞冻存及复苏方法同实施例1。

对比例5

配置一种大量冻存间充质干细胞的冻存液，在α-mem基础培养基中添加胎牛血清和dmso；其中，胎牛血清的浓度为30ml/100ml，dmso的浓度为10ml/100ml。

细胞冻存及复苏方法同实施例1。

对比例6

配置如实施例5所示冻存液，使用冻存管冻存，每管1ml细胞悬液，间充质干细胞浓度1×10⁷个/ml，共30管。每管进行标记，并用封口膜逐个封口。

细胞冻存降温程序同实施例1。

细胞复苏方法如下：从液氮中取出30个冻存管，摆放于试管架上，于37℃水浴箱中融化。此过程需双人操作，以避免冻存管落入水中；并且融化过程中冻存管易爆裂，造成细胞损失，并威胁操作人员的安全。

细胞融化后，在生物安全柜中，剥下冻存管的封口膜，分别消毒管口处，打开冻存管盖，逐个混匀，然后吸取30个管中的细胞进行洗涤；从细胞融化到洗涤完成需20min，操作繁琐、易染菌，并且如未及时洗涤很容易造成细胞损伤。

对比例7

配置如实施例1所示冻存液，使用冻存管冻存，每管1ml细胞悬液，间充质干细胞浓度1×10⁷个/ml，共30管。每管进行标记，并用封口膜逐个封口。

细胞冻存降温程序同实施例1。

细胞复苏方法同实施例6。

对比例8

间充质干细胞浓度2×10⁷个/ml，其他参数同实施例1。

选取间充质干细胞p4代细胞的3个批次(msc20150318，msc20150409，msc20150425)，分别使用实施例1-3，对比例1-8中冻存液及方法进行冻存，1个月后，复苏，统计细胞存活率，每个批次重复3次，结果如表1所示。

表1

上表中，实施例2与实施例1比较，p〉0.05；实施例3与实施例1比较，p〉0.05；可见，三者无显著差别；

对比例1-8分别与实施例1比较，均p〈0.05，有显著性差异；

对比例5与对比例6比较，p〈0.05，有显著性差异，可见，传统试剂配方用冻存袋冻存效果要优于用冻存管冻存的效果；

对比例7与对比例6比较，p〈0.05，有显著性差异，可见，在使用冻存管冻存的条件下，使用本发明配方冻存液效果优于传统配方。

进一步地，对于间充质干细胞p4代细胞msc20150318，分别使用实施例1-3，对比例1-8中冻存液及方法进行冻存，1个月后，复苏，培养24小时，细胞生长状态如图1-11所示。

其中实施例1-3细胞复苏后生长状态最好，铺满瓶底，明显优于其它各组。

对比例1、2分别未添加丙二醇、氮酮，细胞复苏后生长均较差；其中，未添加丙二醇时细胞生长状态优于未添加氮酮，可见，氮酮的添加对细胞冻存的影响大于丙二醇。

对比例3未添加白蛋白和低分子右旋糖酐，细胞活率最低，生长状态差。

对比例4冻存液各组分增量，效果低于实施例，且浪费试剂。

对比例5使用传统dmso冻存液加细胞袋冻存，复苏后虽细胞生长较多，但中间有空洞形成，状态不均匀，效果差于本发明实施例，但优于对比例6传统dmso冻存液加冻存管冻存的方法。

对比例7使用本发明冻存液配方加冻存管冻存，复苏后细胞生长优于对比例6传统dmso冻存液加冻存管冻存的方法。

对比例8细胞浓度加倍，由于冻存保护剂和营养物质不足，复苏后细胞生长也较原倍细胞数量差。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。