本发明涉及一种猪冻精用预稀释液，属于猪精液的冷冻保存
技术领域：
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背景技术：
猪的人工授精(artificialinsemination，ai)技术，即利用人工方法采集公猪的精液，对其进行品质检查，将活率合格的原精进行稀释、分装、17℃恒温保存等，再用输精管将精液输送到发情母猪生殖道内，使其受孕。人工授精可提高公猪的配种效率，与本交相比，人工授精时一头优秀种公猪每年配种的母猪可提高10～20倍。由于良种公猪利用率的提高，加速了品种改良；减少公猪的饲养量，节省了饲养管理费用；可克服自然交配的难点，如公、母猪体格相差太大和某些生殖道异常等困难；可扩大优秀公猪在时间和地域上的利用率，为优秀种猪精液的资源共享提供便利条件；此外，人工授精还可以有效防止公、母猪多种疫病接触传染的可能。正是由于人工授精在养猪生产中具有很多优越性，使得这一技术在许多养猪发达国家得到大力推广。然而，国内外在猪的人工授精中所用的精液多为常温(15～20℃)液态保存鲜精液，配种时的精子活力较高(0.6～0.8)、配种母猪的受胎率较高(75％～85％)，但其鲜精一是不能长期保存(保存期一般在3～5天)，二是不便于远距离运输，因此，无法充分发挥优秀种公猪尤其是顶级种公猪的种用价值。近年来，人工授精技术在猪繁育上的应用，已经从采用常温精液输配技术，逐渐转移到冻精制作和冻精输配技术上。冻精制作是指利用干冰(-79℃)、液氮(-196℃)等作制冷源，将精液特殊处理后冷冻，保存在超低温(-79℃或-196℃)的状态下，达到长期保存的目的。目前，这项技术再牛、羊上早已广泛推广应用，但由于猪的精液自身抗氧化能力的不足，猪的精子耐冻性差，公猪精液冷冻制作后，经解冻并稀释处理，检测猪的精子活率严重下降，导致猪的精液冷冻技术在猪场生产实践中始终难以广泛推广应用。有研究人员认为，氧化损伤是导致这个现象产生的主要因素之一。氧化损伤主要是由精子活性氧(如过氧化氢，超氧化物阴离子，羟自由基)水平的升高引起，活性氧能够破坏精子的蛋白、dna和质膜中脂质。公猪精液对活性氧敏感性的原因是因为膜脂质中不饱和脂肪酸的浓度相对较高，而精浆的天然抗氧化能力相对较低。特别是，在冷冻保存过程中产生的超氧自由基将导致精子膜的脂质过氧化，膜的完整性降低和精子凋亡的增加，从而影响精子活力。lij也在文献《seminalplasmaantioxidantsaredirectlyinvolvedinboarspermcryotolerance》指出精液的抗冻性与精液抗氧化能力有关，现阶段，在猪冷冻精液制作过程中的预稀释步骤多采用mondena、bts、androhepplus等鲜精稀释液，或者基于这些鲜精稀释液的配方进行了微调，这些稀释液不仅成分复杂，而且不能有效增强精液的抗氧化性，制作冻精的合格率极低。技术实现要素：为解决上述问题，本发明提供了一种猪冻精用预稀释液，可有效保护冻精制作过程中的精子抵抗氧化损伤，从而提高冻精制作的合格率，扩大优良种公猪的利用效率，减少公猪的饲养量，降低猪场生产成本，显著增加经济效益。为达到上述目的，本发明的猪冻精用预稀释液以水为溶剂，溶质及其浓度为：tris230-270mmol/l、柠檬酸70-90mmol/l、葡萄糖55-70mmol/l、半胱氨酸盐酸1-5mmol/l。作为上述方案的优选，所述猪冻精用预稀释液的溶质及其浓度为：tris245-265mmol/l、柠檬酸75-85mmol/l、葡萄糖58-68mmol/l、半胱氨酸盐酸2-4.5mmol/l。作为上述方案的优选，所述猪冻精用预稀释液的溶质及其浓度为：tris250-260mmol/l、柠檬酸78-82mmol/l、葡萄糖60-65mmol/l、半胱氨酸盐酸3-4mmol/l。作为上述方案的优选，所述猪冻精用预稀释液中tris与柠檬酸的物质的量浓度比为(3-3.2):1。本发明猪冻精用预稀释液的ph值为6.8-7.2，渗透压为350-450mosmo。本发明中葡萄糖作为精液主要能量来源，也可采用葡萄糖水合物替代。本发明使用tris和柠檬酸来维持维持稳定的ph值与渗透压，其中柠檬酸可用柠檬酸水合物替代。本发明中使用半胱氨酸盐酸作为抗氧化剂，可用半胱氨酸或n-乙酰半胱氨酸替代。与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明配方简单，只有四种成分，容易配制。此外，本发明中以半胱氨酸盐酸为抗氧化剂，其浓度远大于常见的鲜精稀释液，能够弥补猪的精液自身抗氧化能力的不足，降低了精液在冻存过程中剧烈变化对精子的氧化损伤，从而大大提高猪的精子耐冻性，提高冻精制作的合格率，同时，在本发明中通过tris和柠檬酸的合理配比，来维持维持稳定的ph值与渗透压，更加适宜精子的冻存。具体实施方式实施例1一种猪冻精用预稀释液，溶剂为水，溶质及其浓度为：tris230mmol/l、柠檬酸70mmol/l、葡萄糖55mmol/l、半胱氨酸盐酸1mmol/l。实施例2一种猪冻精用预稀释液，溶剂为水，溶质及其浓度为：tris230mmol/l、柠檬酸73mmol/l、葡萄糖58mmol/l、半胱氨酸盐酸2mmol/l。实施例3一种猪冻精用预稀释液，溶剂为水，溶质及其浓度为：tris245mmol/l、柠檬酸82mmol/l、葡萄糖60mmol/l、半胱氨酸盐酸3mmol/l。实施例4一种猪冻精用预稀释液，溶剂为水，溶质及其浓度为：tris250mmol/l、柠檬酸83mmol/l、葡萄糖62mmol/l、半胱氨酸盐酸3.5mmol/l。实施例5一种猪冻精用预稀释液，溶剂为水，溶质及其浓度为：tris260mmol/l、柠檬酸87mmol/l、葡萄糖65mmol/l、半胱氨酸盐酸4mmol/l。实施例6一种猪冻精用预稀释液，溶剂为水，溶质及其浓度为：tris265mmol/l、柠檬酸88mmol/l、葡萄糖68mmol/l、半胱氨酸盐酸3.7mmol/l。实施例7一种猪冻精用预稀释液，溶剂为水，溶质及其浓度为：tris270mmol/l、柠檬酸90mmol/l、葡萄糖70mmol/l、半胱氨酸盐酸5mmol/l。实施例8一种猪冻精用预稀释液，溶剂为水，溶质及其浓度为：tris231mmol/l、柠檬酸70mmol/l、葡萄糖70mmol/l、半胱氨酸盐酸5mmol/l。实施例9一种猪冻精用预稀释液，溶剂为水，溶质及其浓度为：tris231mmol/l、柠檬酸70mmol/l、葡萄糖70mmol/l、半胱氨酸盐酸2.5mmol/l。实施例10一种猪冻精用预稀释液，溶剂为水，溶质及其浓度为：tris235mmol/l、柠檬酸75mmol/l、葡萄糖70mmol/l、半胱氨酸盐酸2.5mmol/l。实施例11一种猪冻精用预稀释液，溶剂为水，溶质及其浓度为：tris255mmol/l、柠檬酸85mmol/l、葡萄糖64mmol/l、半胱氨酸盐酸3mmol/l。实施例12一种猪冻精用预稀释液，溶剂为水，溶质及其浓度为：tris257mmol/l、柠檬酸78mmol/l、葡萄糖62mmol/l、半胱氨酸盐酸3mmol/l。实施例13一种猪冻精用预稀释液，溶剂为水，溶质及其浓度为：tris248mmol/l、柠檬酸82mmol/l、葡萄糖62mmol/l、半胱氨酸盐酸3mmol/l。实施例14一种猪冻精用预稀释液，溶剂为水，溶质及其浓度为：tris251mmol/l、柠檬酸81mmol/l、葡萄糖63mmol/l、半胱氨酸盐酸4mmol/l。在上述实施例中，柠檬酸可用柠檬酸水合物，葡萄糖可用葡萄糖水合物，半胱氨酸盐酸可用半胱氨酸和n-乙酰半胱氨酸替代。下面通过具体实验对本发明作进一步的说明：试验猪的选择选择健康状况良好、年龄相近的种公猪若干头，由专业人员进行精液采集，采精时，注意公猪射精第一阶段不采集，第三阶段不采集，只采集第二阶段射精的精液；对精液进行检测，若运动精子比例(tm)>80％，前向运动精子比例(pm)>70％，畸形率<10％，可进行冷冻。经检测精液合格的公猪为40头，随机分为四组，每组10头，分别为对照组1、对照组2、对照组3，试验组，其中：对照组1采用bts稀释液；对照组2采用mondena稀释液；对照组3采用androhepplus稀释液；试验组采用实施例14的稀释液。预稀释液的制备：试验组稀释液：根据物质的量与质量之间的换算关系，按照本发明实施例14的配方进行制备，制备方法如下：称取tris30.4g、柠檬酸15.55g、葡萄糖11.34g、半胱氨酸盐酸0.70g溶于1l水中。、bts稀释液：称取葡萄糖37g、柠檬酸钠6g、edta-na21.25g、碳酸氢钠1.25g、tris0.75g，溶于1l水。mondena稀释液：称取葡萄糖27.5g、柠檬酸钠6.9g、edta-na22.35g，、碳酸氢钠1g、柠檬酸2.9g、tris5.65g、半胱氨酸0.05g、bsa3g，溶于1l水。androhepplus稀释液由美国mofa公司提供，无需配置。将配置好的几种稀释液，35℃预热备用。冷冻精液制备：(1)向精液中按照重量比1:1加入预稀释液，混匀，室温静置2h后，转入17℃恒温箱静置2h后并离心，离心时间10min转速为1500rpm/min，弃上清，得到精子沉淀；(2)向精子沉淀中加入预冷至17℃的冷冻i液，混匀，使得猪的精子密度为20亿/ml，形成体系i，在2.5-4h内水浴降温至4℃；(3)向体系i中按照1:1的体积比加入预冷至4℃的冷冻ii液，得体系ii；(4)将体系ii混匀后灌装封口，然后用程序冷冻仪进行冷冻，冷冻程序分为三个阶段：4到1℃降温速率为1.5℃/min；1至-140℃降温速率为30℃/min；-140℃静置平衡5min，然后取出精液浸入液氮中保存。冻精合格率检测将各组冻精置于50℃水中解冻15-16s，分别加入1.5ml预热至30℃的解冻液，静置15-20min后，用精子质量分析系统检测每头猪冻精的tm和pm，若tm≥60，pm≥30的计为合格，统计合格率。表1不同预稀释液处理精液后冷冻效果组别预稀释液冷冻头次合格头次合格率对照组1bts10220％对照组2mondena10330％对照组3androhepplus10330％试验组实施例1410770％由表1可知，采用本发明进行预稀释制作而成的冻精，解冻后达达到合格的合格头次最多，合格率最多，效果优于其他预稀释液。在本实验例中，冷冻i、ii液均由北京田园奥瑞生物科技有限公司提供，解冻液采用美国mofa提供的androhepcryoguardthawextender，均无需配置。最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。当前第1页12