三唑酮·丙环唑聚乳酸微球及其制备方法与流程

本发明具体涉及一种三唑酮·丙环唑聚乳酸微球及其制备方法。

背景技术

农药剂型是指将农药的有效成分加工成适用于施药环境的形态，使之可以发挥最佳的生物效能，并最大幅度的降低对施药者、农作物及换技能的危害。目前我国常用的农药剂型有粉剂、可湿性粉剂、乳油和颗粒剂等，这些剂型在病虫害方面防治效果较好，但是由于一些存在于加工和使用过程中的不合理之处，使得农药利用率较低，并危害人畜健康及环境。

近些年，社会对环境保护及可持续发展愈发重视，新型环境友好型农药剂型的需求越来越大，许多农药研发企业借鉴医学领域的剂型开发新型农药，取得了巨大的成果，有效改善了传统农药的一些缺点。

三唑酮和丙环唑均属于三唑类药剂。通过抑制菌体麦角甾醇的生物合成，使病原菌的细胞膜功能受到破坏，最终导致细胞死亡，从而起到杀菌、防病和治病的功效。前期研究发现将两种农药复配，可以增大效能和提高防治效果，延缓抗药性的产生，并且能降低生产成本。目前关于三唑酮·丙环唑复配制备的缓释微球并没有相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种三唑酮·丙环唑聚乳酸微球的制备方法。

本发明所提供的三唑酮·丙环唑聚乳酸微球是按照包括下述步骤的方法制备得到的：将三唑酮、丙环唑和聚乳酸溶于二氯甲烷中作为油相，待完全溶解后，倒入作为水相的阿拉伯胶-明胶水溶液中，进行分散乳化，制得初乳液；然后将所述初乳液持续搅拌，即得三唑酮·丙环唑聚乳酸微球。

其中，所述三唑酮和丙环唑的质量比可为4：6-6：4；

所述三唑酮和丙环唑的质量之和与所述聚乳酸的质量比可为1:2-1:3；

所述分散乳化的分散速度可为3500rpm/min-4000rpm/min；

所述油相与水相的体积比可为1:15-1:20；

所述阿拉伯胶-明胶水溶液中阿拉伯胶和明胶的质量比可为1:1-2:1；

所述阿拉伯胶-明胶水溶液中阿拉伯胶-明胶的质量浓度可为1.5％-1.75％；

所述油相中聚乳酸浓度可为120mg/ml。

进一步的，以微球载药量为评价指标时，最佳的参数选择为：

所述三唑酮和丙环唑的质量比为4：6；

所述三唑酮和丙环唑的质量之和与所述聚乳酸的质量比为1:3；

所述分散乳化的分散速度为4000rpm/min；

所述油相与水相的体积比为1:20；

所述阿拉伯胶-明胶水溶液中阿拉伯胶和明胶的质量比为1:1；

所述阿拉伯胶-明胶水溶液中阿拉伯胶-明胶的质量浓度为1.5％；

所述油相中聚乳酸浓度为120mg/ml。

进一步的，当以微球包封率为评价指标时，最佳的参数选择为：

所述三唑酮和丙环唑的质量比为4：6；

所述三唑酮和丙环唑的质量之和与所述聚乳酸的质量比为1:2；

所述分散乳化的分散速度为3500rpm/min；

所述油相与水相的体积比为1:20；

所述阿拉伯胶-明胶水溶液中阿拉伯胶和明胶的质量比为1:1；

所述阿拉伯胶-明胶水溶液中阿拉伯胶-明胶的质量浓度为1.75％；

所述油相中聚乳酸浓度为120mg/ml。

上述制备方法中，所述分散乳化的时间可为0.4-0.8min，优选为0.6min。

上述制备方法中，所述持续搅拌在磁力搅拌器上进行，所述磁力搅拌的时间可为2h-3h，优选为3h；所述磁力搅拌的速度可为600rpm/min-700rpm/min，优选为600rpm/min。

上述制备方法中，所述聚乳酸的分子量可为6-12。

在本发明的整个制备过程中，体系的温度维持在20-30℃为宜。

为了减少在加工的过程中泡沫对微球制备的影响，对所述初乳液持续搅拌之前，还可向所述初乳液中加入消泡剂。所述消泡剂为常用的消泡剂如有机硅消泡剂。所述消泡剂可适量加入2～3滴。

本发明以三唑酮·丙环唑复配药作为芯材，利用生物可降解材料聚乳酸(pla)为壁材，通过乳化-溶剂挥发法制备三唑酮·丙环唑聚乳酸缓释微球。通过单因素考察各个实验因子对微球制备工艺的影响，并采用正交实验，进一步优化制备工艺。筛选出微球最佳的工艺条件为：芯壁材质量比1:3、乳化剂质量分数1.50％、油水相体积比1:20、聚乳酸浓度120mg/ml、高速分散时间0.6min、高速分散速度4000rpm、磁力搅拌时间3h、磁力搅拌速度600rpm。

附图说明

图1为三唑酮hplc图谱；

图2为丙环唑hplc图谱；

图3为三唑酮·丙环唑微球hplc图谱；

图4为三唑酮的标准曲线；

图5为丙环唑的标准曲线；

图6为芯壁材质量比对微球的包封率和载药量的影响；

图7为乳化剂质量分数对微球的包封率和载药量的影响；

图8为油水相体积比对微球的包封率和载药量的影响；

图9为聚乳酸浓度对微球的包封率和载药量的影响；

图10为不同高速分散速度对微球载药量、包封率的影响；

图11为高速乳化分散速度对微球的包封率和载药量的影响；

图12为不同磁力搅拌时间对微球载药量、包封率的影响；

图13为不同磁力搅拌速度对微球载药量、包封率的影响；

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

试验材料

仪器设备：

激光粒度分析仪、高速内切式分散器、电子分析天平、磁力搅拌器、抽滤泵、高效液相色谱仪。

供试材料：

聚乳酸(pla，分子量约为8万)、明胶、阿拉伯胶、二氯甲烷、消泡剂、92％丙环唑原药(海南正业中农高科股份有限公司)、97％三唑酮原药(海南正业中农高科股份有限公司)。

实施例

1.1乳化-溶剂挥发法制备微球

将三唑酮和丙环唑按比例(4：6，w/w)进行混合，和一定量的聚乳酸在4℃条件下溶于二氯甲烷，得到油相。

将一定量的明胶和阿拉伯胶(质量比为1：1)加入70℃的蒸馏水中并搅拌直至全部溶解，冷却至室温制成乳化剂溶液。

将已经完全溶化的原药用注射器抽取加入到乳化剂溶液中，用高速分散器高速在4000rpm条件下分散0.6min，在制得的初乳液中加入1-3滴消泡剂，然后用磁力搅拌器以一定的转速和时间进行搅拌。

完全搅拌后，将得到的药进行抽滤，将抽滤出的固体物质自然风干得到三唑酮·丙环唑聚乳酸微球，置于密封袋中保存备用。

1.2粒径测定

取一定量聚乳酸微球样品，加入分散剂后置于40～60ml蒸馏水于量杯中，经超声波处理2分钟后，选用试样浓度遮光率为10％～20％，采用循环进样法，用激光粒度仪测定微球粒径，多次测量其平均粒径d50，在重复率低于1％的条件下选取3组d50值并记录。

1.3载药量和包封率的测定

1.3.1色谱检测条件

色谱柱：vx952505-t；检测器：紫外检测器；流动相：甲醇-水(体积比85:15)；检测波长：三唑酮(220nm)、丙环唑(230nm)；柱温：40℃；流速：1.0ml/min；进样量：10μl。保留时间：，三唑酮为4.3min，丙环唑为5.7min。

1.3.2试样溶液的配制

称取三唑酮·丙环唑聚乳酸微球0.1000g于50ml的棕色容量瓶中，加入适量二氯甲烷并置于冰箱中低温溶解，待微球溶解后取出容量瓶，待二氯甲烷挥发干后，加入适量甲醇然后用超声波分散10min，最后用甲醇定容至刻度，取出冷却至室温，用带有过滤膜(0.22μm)的注射器吸取样品到进样瓶中，放入液相色谱仪待测。

1.3.3测定

在上述操作条件下待仪器基线稳定后，依次从每瓶中吸取待测溶液检测，记录三唑酮、丙环唑和聚乳酸微球图谱的出峰时间。

1.3.5测定公式：

1.3.6单因素对微球制备工艺的影响

控制其他因子，分别将芯壁材质量比、乳化剂质量分数、油水相体积比、聚乳酸浓度、高速分散时间、高速分散速度、磁力搅拌时间和磁力搅拌速度作为单一变量，考察各个因子对微球制备工艺的具体影响。

1.3.7正交设计多因素对微球制备工艺的影响

为了优化制备工艺，我们选出五个对微球制备工艺影响较大的因素，即：芯壁材质量比(a)、聚乳酸浓度(b)、乳化剂质量分数(c)、油水相体积比(d)和高速分散速度(d)，每个因素设置四个水平，采用正交设计实验进一步优化微球制备工艺。

2结果与分析

2.1液相色谱条件

见图1-3。

2.1.1流动相的选择

参考相关文献选取液相检测方法[韦俏娜,马林,黄爱民,等.甲醇-水混合溶剂后处理制备丝素蛋白膜及其药物释放研究[j.]化学学报.2012(06):714-720.]，采用甲醇-水(体积比85:15)作为流动相进行分离检测，此时三唑酮和丙环唑能与杂质完全分离，且峰形较好。

2.1.2检测波长的选择

三唑酮含量的分析选择检测波长220nm条件下进行，丙环唑含量的分析选择检测波长在230nm条件下检测[赵春娟,高文惠.高效液相色谱法检测饲料中三唑类杀菌剂残留[j.]中国饲料.2015(03):24-25.]。本实验中，在220nm处能使三唑酮和丙环唑与其他杂质有效分开，且两种药均有较强的吸收峰，因此选用为二者的检测波长。

2.1.3方法的线性相关性测定

用移液管分别从三唑酮和丙环唑标准溶液中准确移取0.5ml至进样瓶中，按上述条件进行测定，以进样浓度(500mg/ml、250mg/ml、125mg/ml、62.5mg/ml、31.25mg/ml)为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线(如图4、图5)，获得标准曲线方程：三唑酮y＝615.43x-1621.2，相关系数为0.9971，丙环唑y＝135.99x+813.75，相关系数为0.9983。

2.2单因素对微球制备工艺的影响

2.2.1芯壁材质量比对微球制备工艺的影响

固定其他微球制备条件(聚乳酸浓度120mg/ml、油水相体积比1:20、乳化剂的质量分数1.5％、乳化分散速度4000rpm/min、乳化分散的时间为0.6min、磁力搅拌速度600rpm/min、磁力搅拌时间3h)，考察了芯壁材质量比1:2、1:3、1:4、1:5对微球制备工艺的影响(结果见表1、图6)。

结果表明：不同的芯壁材质量比对微球制备具有一定的影响。当芯壁材质量比逐渐增大时，微球的粒径平均值由39.68μm增加到68.6μm，载药量从30.12％逐渐减小到14.23％，包封率先增大后减小，从90.36％增加到到94.52％再减小到85.28。随着芯壁材质量比逐渐增大，有机相的浓度和粘度也逐渐增大，增加了剪切的难度，难以充分分散乳液，造成微球粒径不均匀且粒径明显增大；聚乳酸作为壁材包裹原药，在一定范围内，芯壁材质量比越高，芯材越多，则载药量也越大，但是当芯材过多而超过聚乳酸包裹能力时，多余的芯材就会扩散进乳液中，造成包封率的下降。故在制备聚乳酸微球时应该注意芯壁材质量比的平衡。

表1不同芯壁材质量比对微球粒径的影响

2.2.2乳化剂质量分数对微球制备工艺的影响

以明胶和阿拉伯胶(质量比1:1)作为乳化剂，固定其他微球制备条件(聚乳酸浓度120mg/ml、芯壁材质量比1:3、油水相体积比1:20、乳化分散速度4000rpm/min、乳化分散的时间为0.6min、磁力搅拌速度600rpm/min、磁力搅拌时间3h)，考察了乳化剂质量分数0.75％、1.00％、1.25％、1.50％、1.75％、2.00％对微球制备工艺的影响，结果见表2和图7。

结果表明：不同的乳化剂质量分数对微球制备具有一定的影响，当乳化剂浓度逐渐增大时，微球的粒径呈先减小后增大的趋势，由86.48μm减小到79.05μm再增加到108.54μm，包封率从77.68％增加到96.52％再减小到95.04％，载药量从19.42％增加到24.13％再减小到23.76％。乳化剂浓度过低会使乳液整体稳定性较差进而导致破乳现象，过高则会导致乳液中的有机相粘连成团，所以乳化剂浓度过低或过高时会导致检测的粒径偏大；同时载药量和包封率也是先增大后减小，原因和影响粒径的原因相同。

表2不同乳化剂质量分数对微球粒径的影响

2.2.3油水相体积比对微球制备工艺的影响

固定其他微球制备条件(聚乳酸浓度120mg/ml、芯壁材质量比1:3、乳化剂质量分数1.5％、乳化分散速度4000rpm/min、乳化分散的时间为0.6min、磁力搅拌速度600rpm/min、磁力搅拌时间3h)，考察了油水相体积比1:5、1:10、1:15、1:20、1:25对微球制备工艺的影响，结果表明：不同的油水相体积比对微球制备具有一定的影响(见表3和图8)。随着乳液中水相体积所占比例增大，微球的粒径一直增大，从38.455μm增大到60.77μm，是因为随着乳液中水相的增加，微球在搅拌时受到的剪切力随之减小，分散力度不够，故微球粒径较大。载药量和包封率都是先增大后减小，载药量从18.76％增大到23.56％又减小到22.99％，包封率由75.04％增加到94.24％又减小到91.96％，这是由于随着乳液中水相的增加，乳液可以溶解更多地二氯甲烷，随着二氯甲烷的挥发，聚乳酸可以充分包裹原药使得微球的载药量和包封率都有增大。当水相体积超过一定范围时，会导致更多的原药扩散于水中，使得载药量和包封率都有下降，而水相体积低于一定范围时，乳液中只能溶解少量二氯甲烷，挥发时间短造成聚乳酸在未完全包裹原药之前就以析出，产生大量空壳，使得载药量和包封率都较低。

表3不同油水相体积比对微球粒径的影响

2.2.4聚乳酸浓度对微球制备工艺的影响

固定其他微球制备条件(芯壁材质量比1:3、油水体积比1:20、乳化剂质量分数1.5％、乳化分散速度4000rpm/min、乳化分散的时间为0.6min、磁力搅拌速度600rpm/min、磁力搅拌时间3h)，考察了聚乳酸浓度90mg/ml、120mg/ml、150mg/ml、180mg/ml对微球制备工艺的影响，结果表明：不同的聚乳酸浓度对微球制备具有一定的影响(结果见表4、图9)。随着聚乳酸浓度的增加，微球的粒径从87.05μm增加到112.84μm，载药量从22.31％增加到24.03％，包封率从89.24％降低到96.12％。这是因为聚乳酸浓度增大导致乳液中油相粘度增到，使得微球更易发生团聚，使得粒径增大。而聚乳酸浓度增大使得乳液中壁材含量增大，在芯壁材质量比一定时，芯壁材含量增大使得聚乳酸能够包裹更多的原药，使得载药量和包封率都增加，但是由于聚乳酸浓度过大而造成大量聚乳酸在二氯甲烷挥发之前聚乳酸析出，导致产生大量空壳，使得载药量和包封率都降低。

表4不同聚乳酸浓度对微球粒径的影响

2.2.5高速分散对微球制备工艺的影响

固定其他微球制备条件(芯壁材质量比1:3、油水体积比1:20、聚乳酸浓度120mg/ml、乳化剂质量分数1.5％、磁力搅拌速度600rpm/min、磁力搅拌时间3h)，分别考察了高速分散速度3000rpm、3500rpm、4000rpm、4500rpm和高速分散时间0.2min、0.4min、0.6min、0.8min、1.0min、1.2min对微球制备工艺的影响，结果表明：不同的分散速度和分散时间对微球制备具有一定的影响(结果见表5、图10、11)。随着高速分散时间和高速分散速度的增加，微球的粒径分别从80.35μm下降到57.91μm、80.62μm下降到75.23μm，因为高速分散时间和高速分散速度的增加会导致搅拌时微球承受剪切力时间增长，承受剪切力增大，故而微球的粒径会有所降低。同时，微球的载药量和包封率总体上呈先增大后减小的趋势，在高速分散时间较短和速度较低时，微球不能充分的被搅拌，油相粘连度较高，产生空壳，使得载药量和包封率都较为低。随着高速分散时间增长，速度增大，微球充分分散，聚乳酸能很好地包裹原药，使得微球的载药量和包封率都有增加。但是当分散时间过长，速度过快时，乳液易发生破乳现象，微球破裂并泄出原药，所以载药量和包封率都会降低。

表5不同高速分散速度和分散时间对微球粒径的影响

2.2.6磁力搅拌对微球制备工艺的影响

固定其他微球制备条件(芯壁材质量比1:3、聚乳酸的浓度为120mg/ml、油水体积比1:20、乳化剂质量分数1.5％、乳化分散速度4000rpm/min、乳化分散的时间为0.6min)，分别考察了磁力搅拌速度500rpm、600rpm、700rpm、800rpm和磁力搅拌时间1h、2h、3h、4h对微球制备工艺的影响，结果表明：不同的磁力搅拌速度和搅拌时间对微球制备具有一定的影响(结果见表6、图12、13)。随着磁力搅拌时间和速度的增加，微球的粒径都分别逐渐减小，从72.88μm降低到64.4μm、82.20μm降低到76.78μm，是因为在磁力搅拌中，充分的搅拌时间和速度使乳液中油水相充分分离，形成的微球粒径较小。同时，在两种情况下，微球的载药量和包封率都是先增大后减小，原因同理，充分搅拌使油水相充分分离，聚乳酸可以较好的包裹原药，所以载药量和包封率都较高，而当磁力搅拌时间过长、速度过快时，乳液中微球会过多的碰撞，是微球容易产生破裂，泄出原药，导致载药量和包封率下降。

表6不同磁力搅拌速度和磁力搅拌时间对微球粒径的影响

2.3正交设计优化制备工艺

根据上述实验可以发现，影响聚乳酸微球制备工艺的因素较多，因此在单因素研究基础上，选出五个对微球制备工艺影响较大的因素，即：芯壁材质量比(a)、聚乳酸浓度(b)、乳化剂质量分数(c)、油水相体积比(d)和高速分散速度(e)，每个因素设置四个水平，采用正交设计实验进一步优化微球制备工艺。正交设计各个因素的水平见下表：

表7正交设计因素水平表

表8正交设计实验结果表

由上述正交设计实验结果得出，当以微球载药量为评价指标时，根据极差排出的单因素主次顺序为a﹥b﹥d﹥e﹥c，最佳的制备工艺为a2b2c2d3e3，即为芯壁材质量比1:3、聚乳酸浓度120mg/ml、乳化剂质量分数1.50％、油水相体积比1:20、高速分散速度4000rpm/min。当以微球包封率为评价指标时，根据极差排出的单因素主次顺序为b﹥a﹥d﹥e﹥c﹥，最佳制备工艺为a1b2c3d4e2，即为芯壁材质量比1:2、聚乳酸浓度120mg/ml、乳化剂质量分数1.75％、油水相体积比1:20、高速分散速度3500rpm/min。结合单因素分析可知：芯壁材质量比1:2时原药所占比例较大，载药量较高但是包封率低，在1:3时载药量和包封率都较高；聚乳酸在120mg/ml时载药量和包封率较高且粒径较小；乳化剂质量分数采用较为平衡的1.50％，此时载药量、包封率和粒径都保持正常；油水相体积比1:20粒径较小，载药量和包封率也都要优于其他情况下；高速分散速度为3500rpm时载药量和包封率低于4000rpm时。所以综合考察后选择芯壁材质量比1:3、聚乳酸浓度120mg/ml、乳化剂质量分数1.50％、油水相体积比1:20、高速分散速度4000rpm、高速分散时间0.6min、磁力搅拌速度600rpm、磁力搅拌时间3h，此为聚乳酸微球的最佳制备工艺。