本发明涉及土壤硒处理油菜秸秆溶解性有机质在防治油菜菌核病中的应用，属于农药技术领域。
背景技术：
硒是人和动物的必需微量元素，也是植物的有益元素。在我国，有7亿多的人口生活在缺硒地区，食补逐渐成为一种补充硒元素的主流方式。随着越来越多的富硒农产品被开发，产生了大量的富硒农产品副产物，如富硒油菜秸秆等，急需进行农业废弃物的资源化利用。
溶解性有机质主要是指能够溶于水、酸或碱溶液的有机质，是化学组成和结构十分复杂的有机混合物。根据操作定义，将能够通过0.45μm滤膜的有机物质称为溶解性有机质。作为秸秆在土壤中存在的重要形式，溶解性有机质能够影响疏水性有机污染物和金属离子的生物地球化学过程。此外，溶解性有机质在生态系统物质和能量循环中起到重要作用，是异养微生物碳源和能源的主要提供者。溶解性有机质任何成分的改变都能影响到土壤养分的生物利用率进而改变微生物活性。
油菜菌核病是一种世界性病害，在我国各油菜产区均有发生，尤其在长江流域及东南沿海油菜产区发生最为严重，对油菜的产量和品质造成了巨大的损失。引起菌核病的核盘菌[sclerotiniasclerotiorum(lib.)debary]是一种土传性病原真菌。核盘菌属于广谱性病原微生物，分布地域非常广泛，可侵染包括油菜、向日葵、大豆等在内的400多种植物。目前对菌核病的主要防治手段包括选育抗病品种和化学农药抗菌剂等。然而，目前并没有筛选出完全抗病的品种，而采用抗菌剂防治造成了环境农药残留等问题，这使得新型植物源农药的开发和需求量逐渐增加。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供土壤硒处理油菜秸秆溶解性有机质在防治油菜菌核病中的应用，本发明在充分利用农作物废弃物的同时提供一种新型环保的杀菌剂，用于防治核盘菌引起的病害。
本发明采用气相色谱-质谱(gc-ms)联用的方法，从油菜秸秆溶解性有机质中共鉴定出29种化合物，其中包括18种有机酸、4种糖、4种核苷、2种多元醇和1种杂环化合物。土壤硒处理与未经土壤硒处理的油菜秸秆溶解性有机质成分相同，但各个成分在含量上却有很大差异。没有任何文献报道过油菜秸秆溶解性有机质的成分，以及土壤硒处理对这些成分的影响。在本发明中，土壤硒处理增加了富马酸、琥珀酸、粘酸、苯乙酸、马来酸、丙二酸、葡糖二酸和蜜二糖的含量，而这些物质对核盘菌有不同程度的抑制作用。
在本发明中，通过体外实验证实了土壤硒处理油菜秸秆溶解性有机质对核盘菌致病力相关因子的抑制作用。没有任何文献报道过用油菜秸秆溶解性有机质防治核盘菌。同时，本发明证实了油菜秸秆溶解性有机质在接触条件下对核盘菌菌丝的生长有抑制作用，而土壤硒处理获取的油菜秸秆溶解性有机质有更好的抑制作用。结果表明，当油菜秸秆溶解性有机质浓度低于10mg/ml时，对于核盘菌菌丝生长没有抑制作用；当油菜秸秆溶解性有机质浓度为10mg/ml时，未经土壤硒处理的油菜秸秆溶解性有机质的抑制作用稍强于土壤硒处理的油菜秸秆溶解性有机质；当油菜秸秆溶解性有机质浓度为20mg/ml时，土壤硒处理的油菜秸秆溶解性有机质对核盘菌菌丝的生长有较好的抑制作用，且远高于未经土壤硒处理的油菜秸秆溶解性有机质对核盘菌的抑制作用。
具体地，本发明提供如下技术方案：
土壤硒处理油菜秸秆溶解性有机质在防治油菜菌核病中的应用。
土壤硒处理油菜秸秆溶解性有机质在抑制核盘菌生长或降低核盘菌致病力中的应用。
土壤硒处理油菜秸秆溶解性有机质在制备抑制核盘菌生长或降低核盘菌致病力的药物中的应用。
一种针对核盘菌的抗菌剂，包含土壤硒处理油菜秸秆溶解性有机质。
所述的土壤硒处理油菜指在施硒处理的土壤生长的油菜。
所述的土壤硒处理油菜秸秆溶解性有机质优选通过包括如下步骤的方法制备：将土壤硒处理油菜秸秆风干后粉碎，加入水煮沸，然后过0.45μm滤膜真空抽滤，冷冻干燥，得到土壤硒处理油菜秸秆溶解性有机质。
本发明具有如下有点和有益效果：本发明不仅能够充分利用富硒农产品生产中获得的农作物废弃物，且油菜秸秆溶解性有机质的制备方法简单易行，容易操作。所制备的土壤硒处理油菜秸秆溶解性有机质对核盘菌菌丝的生长有较好的抑制作用，可用于油菜菌核病的防治。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：土壤硒处理油菜秸秆的获取
试验地点为华中农业大学资源与环境学院农业生态研究基地。以亚硒酸钠为硒源，向土壤中施加1.12kg/ha，以不施加亚硒酸钠为对照。在土壤中施加硒源的一个月后，进行播种，所用油菜种子为中双9号。油菜成熟后进行收割，并测定油菜秸秆中的硒含量。
表1油菜秸秆中硒含量
注：ck为对照，未施硒处理；se为施硒处理。
由此可得出，土壤硒处理可以增加油菜秸秆中硒的含量。
实施例2：土壤硒处理油菜秸秆溶解性有机质的制备
将油菜秸秆风干后粉碎，过40目筛，称取20g，加入600ml蒸馏水，浸泡30min，煮沸30min，用纱布过滤。取滤渣，加入400ml蒸馏水，煮沸30min，用纱布过滤。将两次滤液混合，过0.45μm滤膜真空抽滤，冷冻干燥。所得即为油菜秸秆溶解性有机质，并于4℃冰箱内密封保存。土壤硒处理提高了油菜秸秆溶解性有机质的提取率，具体见表2。
表2油菜秸秆溶解性有机质的提取率
结果表明，土壤硒处理获得的油菜秸秆溶解性有机质的提取率高于未经土壤硒处理获得的油菜秸秆溶解性有机质，且提高了5.2％。
取油菜秸秆溶解性有机质样本10±1mg于2mlep管中，加入0.48ml提取液(甲醇水体积比＝3:1)，再加入10μl核糖醇，涡旋30s；加入瓷珠，45hz研磨仪处理4min，超声5min(冰水浴)；将样本4℃离心，12000rpm离心15min；移取0.4ml上清液于2ml进样瓶(甲烷硅基化的)中；在真空浓缩器中干燥提取物；向干燥后的提取物加入60μl甲氧胺盐试剂(甲氧胺盐酸盐，溶于吡啶20mg/ml)，轻轻混匀后，放入烘箱中80℃孵育30min；向每个样品中加入80μl双三甲基硅烷三氟乙酰(含有1％三甲基氯硅烷，v/v)，70℃孵育1.5h后上机检测。采用agilent7890气相色谱-飞行时间质谱联用仪对油菜秸秆溶解性有机质进行分析。分析条件如下表3：
表3分析条件
使用chromatof软件(v4.3x，leco)对质谱数据进行了峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等分析。对物质定性工作中，使用了leco-fiehnrtx5数据库，包括质谱匹配及保留时间指数匹配。gc-ms分析结果见表4，从土壤硒处理的油菜秸秆溶解性有机质中共鉴定出29种物质。
表4硒处理的油菜秸秆溶解性有机质的主要化合物
注：rt，保留时间；mean，该物质在该组对比内的一个实验组的相对定量值均值。
结果表明，土壤硒处理过的油菜秸秆溶解性有机质相较于未经土壤硒处理的油菜秸秆溶解性有机质，提高了富马酸、琥珀酸、粘酸、苯乙酸、马来酸、丙二酸、葡糖二酸和蜜二糖的含量，而这些物质对核盘菌的生长有不同程度的抑制作用。
实施例3：土壤硒处理油菜秸秆溶解性有机质对核盘菌菌丝生长的抑制作用
在体外用接触实验测定土壤硒处理油菜秸秆溶解性有机质对核盘菌菌丝生长的抑制作用。所用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基，供试植物病原真菌为核盘菌(sclerotiniasclerotiorum，jzjl-13，华中农业大学植物科学技术学院)。
在直径为90mm的培养皿中加入温度为40℃左右的pda培养基10ml，再加入一定量的油菜秸秆溶解性有机质与之混匀，获得油菜秸秆溶解性有机质终浓度为2-20mg/ml，待培养基凝固后，将活化好的核盘菌菌饼(直径为4mm)放置到pda培养基的正中央。培养皿用parafilm封口膜密封，倒置放于20℃的培养箱中。两天后，用十字交叉法测量菌丝生长直径，并计算菌丝生长抑制率。以不添加任何物质的pda培养基为空白对照，每个处理重复4次，结果见表5。
表5油菜秸秆溶解性有机质对核盘菌的抑制作用
注：rsdom，未经土壤硒处理的油菜秸秆溶解性有机质；rsdomse，土壤硒处理的油菜秸秆溶解性有机质。
结果表明，当油菜秸秆溶解性有机质浓度低于10mg/ml时，对于核盘菌菌丝生长没抑制作用。当油菜秸秆溶解性有机质浓度为10mg/ml时，未经土壤硒处理的油菜秸秆溶解性有机质的抑制作用稍强于土壤硒处理的的油菜秸秆溶解性有机质。当油菜秸秆溶解性有机质浓度为20mg/ml时，土壤硒处理的的油菜秸秆溶解性有机质对核盘菌菌丝的生长的抑制率高达20.9％，有较好的抑制效果。
实施例4：土壤硒处理油菜秸秆溶解性有机质对核盘菌致病力相关因子的抑制作用
(1)细胞壁降解酶-聚甲基半乳糖醛酸酶(pmg)和纤维素酶(cx)活性的测定：10mlpda培养基倒入培养皿中，接种核盘菌菌饼。在20℃下培养2天后，取直径为4mm的新鲜菌饼，转移到装有100ml含10mg/ml溶解性有机质(rsdom或rsdomse，对照不加溶解性有机质)的液体培养基的三角瓶中。液体培养基采用改良的maravs等(1986)的培养基：kno32.0g、kcl0.5g、feso40.01g、k2hpo41.0g、mgso4·7h2o0.5g、vb10.1g、l-天冬酰胺0.5g、底物柑桔果胶或羧甲基纤维素钠10.0g(柑桔果胶用于pmg的产生，羧甲基纤维素钠用于cx的产生)、去离子水1000ml。液体培养基ph值调到5.0后于121℃下灭菌15分钟。每个三角瓶中加入3个菌饼，在100rpm、20℃条件下培养5天。过滤除去菌丝，4℃、10000rpm下离心25分钟，取上清液作为活体外待测酶液。利用dns(3,5-二硝基水杨酸)法在岛津uv-120-02分光光度计520nm处测定反应混合物消光值，根据酶反应所释放的还原糖量计算pmg和cx的活性。反应混合液为1ml待测酶液、1ml醋酸-醋酸钠缓冲液(50mm，ph5.0)、1ml底物1％柑桔果胶或1％羧甲基纤维素钠(1％柑桔果胶或1％羧甲基纤维素钠，用50mm、ph5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液配，分别用来测定pmg和cx活性)，于30℃水浴锅中反应30分钟，立即加入1.5mldns中止反应。结果见表6，pmg、cx的酶活单位为30℃下每分钟催化底物释放1μg还原糖所需酶量。
表6细胞壁降解酶pmg和cx的活性
细胞壁降解酶是许多植物病原真菌的致病因子之一。结果表明，油菜秸秆溶解性有机质降低了核盘菌分泌的细胞壁降解酶的活性，土壤硒处理油菜秸秆溶解性有机质对细胞壁降解酶活性的抑制作用更为剧烈，分别降低了17.3％和28.2％的pmg和cx活性。
(2)核盘菌致病力相关基因表达量的测定：
在直径为90mm的培养皿中加入温度为40℃左右的pda培养基10ml，再加入一定量的油菜秸秆溶解性有机质(对照不加油菜秸秆溶解性有机质)与之混匀，获得油菜秸秆溶解性有机质终浓度为20mg/ml，待培养基凝固后，在培养基上平铺一张与培养皿大小一致的玻璃纸，将活化好的核盘菌菌饼(直径为4mm)放置到pda培养基的正中央。培养皿用parafilm封口膜密封，倒置放于20℃的培养箱中。两天后取核盘菌菌丝100mg，液氮研磨加入1mlrna提取液(采用ni-sclerotiniasclerotiorumrnareagent)，涡旋震荡10s，室温放置3min。加入200ul氯仿抽提，涡旋震荡15s，室温静置5min，4℃、12000rpm条件下离心10min。吸取上清于新离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，冰上放置30min。4℃、12000rpm条件下离心10min，去上清。然后加入1ml75％乙醇(用rnase-freeddh2o配制)洗涤沉淀。4℃、12000rpm条件下离心1min，倒出液体，室温放置晾干。加入200ulrnase-freeddh2o，充分溶解rna。
以rna为模板合成cdna的过程，采用的是easyscriptone-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix试剂盒(transgenbiotech,beijing,china)，具体操作步骤参照说明书。荧光定量pcr采用的是transstarttipgreenqpcrsupermix试剂盒(transgenbiotech,beijing,china)，所使用的仪器型号为abiq6flexsystem(appliedbiosystems,usa)，具体操作步骤参照说明书。以β-tublin作为内参基因，每个处理重复3次，用2-δδct法计算基因相对表达量。本实验使用的引物如下表：
表7引物序列
致病因子的基因相对表达量如下表8所示
表8不同致病因子的基因相对表达量
cwde2和cwde10是细胞壁降解酶相关基因，而细胞壁降解酶基因表达量的升高往往伴随着核盘菌致病力的降低。结果表明，油菜秸秆溶解性有机质能够降低核盘菌的致病力。此外，土壤硒处理油菜秸秆溶解性有机质相较于油菜秸秆溶解性有机质降低了cwde2和cwde10的基因表达量，在一定程度上降低了cwde2和cwde10的酶活。bi1是含有细胞程序性死亡抑制因子类似结构域的核盘菌蛋白。结果表明，油菜秸秆溶解性有机质下调了核盘菌中bi1的基因表达量，而土壤硒处理油菜秸秆溶解性有机质对核盘菌中bi1基因表达量的下调作用更加明显。因此，20mg/ml的土壤硒处理油菜秸秆溶解性有机质对核盘菌的致病因子有较好的抑制作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>华中农业大学
<120>土壤硒处理油菜秸秆溶解性有机质在防治油菜菌核病中的应用
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
atgctcctttcaccacaacc20
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<211>20
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<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
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<213>人工序列(artificialsequence)
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<213>人工序列(artificialsequence)
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