一种微生物农药成膜剂及其应用的制作方法

本发明涉及一种微生物农药成膜剂及其应用。

背景技术：

植物病害是影响农业生产的自然灾害之一，给农业生产和作物产量带来巨大损失，因此植物病害控制技术一直为人们所关注。使用化学杀菌剂控制其发生和为害是目前常用有效的方法，但化学杀菌剂的长期大量使用会造成土壤、大气等环境污染、破坏生态平衡。近年来随着人们食品安全、生态平衡、公共卫生安全意识的不断增强，对农用化学投入品的长期、大量使用带来的生态失衡和非可持续发展问题有了清醒的认识，从而呼唤安全、环保、高效农用投入品的理论创新和产品生产技术创新。植物病害生物防治是利用有益微生物和微生物代谢产物对农作物病害进行有效防治的技术与方法，由于该技术在控制病害中具有明显的安全、环保、高效等特点，因而倍受关注。

植物病害生物防治技术研究发展至今，国内外每年均有大量的文献发表，但研究内容多停留在分离到的某种生防菌对常见植物致病菌的作用效果和应用效果的报道，很少有将其研制成生物农药剂型的报道。

目前，成膜剂大多应用在种衣剂上，姚丽霞等(姚丽霞,武占省,李春.一种复合型成膜剂的成膜性能测定及其对生防菌抑菌活性的影响[j].农药学学报,2009,11(3):381-387)将2％聚乙烯醇、1％羧甲基纤维素钠及0.3％钠基膨润土混合制的pva-scmc-na-b共混膜，该膜是用于棉种的种衣剂，具有优良成膜性、水溶性、黏结性及吸水性，且对微生物的生长及抑菌活性、种子发芽率几乎无影响。ryu等(ryucm,kimj,choio,etal.improvementofbiologicalcontrolcapacityofpaenibacilluspolymyxae681byseedpelletingonsesame[j].biologicalcontroltheory&applicationinpestmanagement,2006,39(3):282-289.)用陶土、硅石和多粘类芽孢杆菌菌悬液混合做成的种衣剂对芝麻种子进行包衣处理，发现不仅可以减轻猝倒病的发生，而且还可以促进植物生长，但种衣剂成本较高，不宜用于植物叶部病害的防治。早期有中国农业大学开发的高脂膜与化学农药混合使用从而应用于防治多种植物的多种病害的报道(邓定辉.高脂膜在植物医学上的应用[j].植物医生,2001,14(1):28-29)。陈安良等(陈安良,胡加付,张绍勇.用于林木病虫害防治的农药成膜剂及其制备方法:,cn103960228a[p].2014)将聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等某一成膜助剂与有机溶剂、农药助剂和化学农药混合研制出应用于林木病虫害防治的农药成膜剂。但是这些成膜剂都是与化学农药混合而来，由于化学农药稳定、不易分解、沉淀等特性，因此该成膜剂成分的选择不需要过多考虑对化学农药的影响。

paenibacilluskribensisps04菌株是发明人实验室于2004年自主分离的、具有广谱抗真菌生物活性的类芽孢杆菌菌株。前期研究表明ps04菌株产生的广谱抗真菌代谢产物为嘌呤类似物，并且能产生大量的胞外多糖--果聚糖，研究表明ps04菌株胞外多糖具有良好的水溶性和广谱、高效的抗真菌活性，并且可以提高作物的抗病性，用该菌株开发研制生物农药可以避免化学农药的污染和一些生物农药制剂中助剂(如苯、二甲苯)导致的环境污染。自2010年以来。发明人课题组开展了大量的应用研究实验，结果表明ps04发酵液对水稻纹枯病(rhizcotoniasolani)、稻瘟病(magnaporthegrisea)、烟草青枯病等应用效果良好，与其他化学农药或生化农药相比，具有绿色、无毒、不污染环境、对植物无损害和促进开花、结实等功效。事实证明，ps04菌株具有良好的应用价值和研究价值，尤其是在我国提出至2020年实现农药、化肥零使用零增长的长期发展规划和全球关注农产品生产和食品安全的大背景下，开展将其研制成生物农药新剂型的研究对计划的实施具有更好的指导意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种微生物农药成膜剂及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种微生物农药成膜剂，其特征在于：其中含有微生物发酵液、羧甲基纤维素钠、淀粉、甘油、表面活性剂、水。

进一步地，表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、曲拉通中的任意一种。

进一步地，表面活性剂为曲拉通。

进一步地，微生物发酵液为paenibacilluskribensisps04发酵液。

进一步地，以质量百分比计，含有羧甲基纤维素钠2％～4％。

进一步地，以质量百分比计，含有淀粉1％～3％。

进一步地，以质量百分比计，含有甘油0.1％～0.3％。

进一步地，以质量百分比计，含有表面活性剂0.2％～0.5％。

进一步地，以质量百分比计，含有微生物发酵液10％～80％。

上述的微生物农药成膜剂的使用方法：将微生物农药成膜剂喷洒于植株上即可。

本发明的有益效果是：

本发明中的成膜剂是采用天然多糖类高分子化合物羧甲基纤维素钠和淀粉，并辅以增塑剂和表面活性剂，以ps04菌液为主要活性物质的生物农药新剂型，具有绿色、环保、安全等特点；药剂可广泛地应用于水稻、蔬菜、烟草等农作物和经济作物的生产中。该成膜剂是一种可在植物表面形成半透膜的生物农药，该药剂所形成的膜具有ps04菌液的生防特性，抑制水稻纹枯病、稻瘟病等真菌病害的生长，诱导植物产生抗病性的作用；还有可阻挡病菌的入侵、延缓药效、耐雨水冲刷和附着力强等特点。解决了传统农药剂型易被雨水淋溶流失、药效释放快等缺点，因此本发明既能丰富植物病害生物控制的农药剂型种类，也为其更好的应用提供理论依据。

本发明中的成膜助剂与多种常见细菌具有较好的生物相容性，为其他微生物成膜剂的研制提供了研究基础。

附图说明

图1为淀粉含量对膜力学性能的影响；

图2为淀粉含量对膜水溶性及水蒸气透过率的影响；

图3为淀粉含量对膜厚度的影响；

图4为淀粉含量对膜透光率的影响；

图5为甘油含量对膜强度及拉伸率的影响；

图6为甘油含量对膜水溶性及水蒸气透过率的影响；

图7为甘油含量对膜透光率的影响；

图8为单一膜与混合膜的红外光谱图，a：羧甲基纤维素钠膜，b：淀粉膜，c：羧甲基纤维素钠-淀粉膜，d：羧甲基纤维素钠-淀粉-甘油膜；

图9为共混膜扫描电镜观察；

图10为助剂及各表面活性剂对细菌生长的影响，图中柱上字母不同者表示在0.05水平上的差异显著性(经duncan氏新复极差法检验，p＜0.05)；

图11为高浓度成膜剂喷施番茄叶片的显微观察；

图12为成膜剂50倍液处理后不同时刻番茄叶片气孔观察；

图13为果糖标准曲线；

图14为成膜剂在不同植物叶片上的淋溶实验的结果。

具体实施方式

与普通化学农药相比，微生物农药的剂型加工难度更大，尤其是微生物成膜剂，不仅要考虑成膜助剂对微生物菌体的影响，而且还要求助剂有良好的生物、环境相容性。本发明所选用的成膜助剂属于天然多糖类高分子化合物，其在自然界分布广泛、含量多且来源丰富，并且大多数多糖可作为基材用于制备多糖膜，而且不仅具有优良的水溶性和成膜性，而且绿色、环保、可生物降解。从成膜材料的筛选结果(表1)可以看出，单一羧甲基纤维素钠所形成的膜具有较高黏度，较好的力学特性，良好的成膜性，但是其本身易溶于水。淀粉虽可成膜，但该膜坚硬较脆，不易揭膜，从而导致部分数据无法测得。单一的成膜材料所具备的特性未必是最优秀和满足研究需要的，因此将两种及多种成膜材料共混改性来达到优势特性互补的目的，从而研究出成膜特性最优的混合成膜配方。羧甲基纤维素钠膜有黏性，韧性高，比较适合作为成膜基材，其次淀粉膜虽然易脆，但是其透明性高，来源广，成本低，且其淀粉糊可作为黏着剂，用于提高农药对固体表面的黏着性，因此可作为成膜辅材。

表1成膜材料的筛选结果

注：淀粉因膜较脆不能揭膜，无法测定膜强度和拉长倍数。

淀粉的加入使羧甲基纤维素钠膜的性能得到很大程度的提升，从结果(图1～4)可以看出：1％～4％淀粉含量加入形成的共混膜比单一羧甲基纤维素钠膜的强度提升0～67.1％，韧性提升45.1％～111％，水溶性最多减小72.1％，透气性升高63.5％～83.9％，但是膜厚度和透光性有所降低；而增塑剂的加入使其部分特性又得到提升，从增塑剂的筛选结果(图5～7)可以看出甘油对共混膜的影响较大，0.1％～0.4％甘油的加入，使共混膜的韧性提升23.1％～40.3％，水溶性又再一次减小，最多减小16.7％，透气性又提升46.8％～106.5％，透光率提升132.9％～147.1％，结果说明共混膜的特性较好于单一膜的，增塑剂的加入可以大幅度改善共混膜的性能。

红外表征结果(图8)表明，共混膜中羧甲基纤维素钠与淀粉之间产生较强的氢键作用，从而使羧甲基纤维素钠与淀粉之间产生良好的相容性。对膜材料的电镜观察(图9)可以看出，共混膜的表面紧密均匀无裂缝，且其横截面也呈现出质地均匀的形态。

表面活性剂的作用是将药液的表面张力降低到低于作物叶片或防治对象的临界表面张力以下，从而使药液才可以在作物叶片或防止对象表面润湿展布。从表2可以看出在所选的表面活性剂用量为0.2％～1％时，膜剂表面张力降低程度有限，并且在用量为0.5％时，膜剂的表面张力就基本稳定。但比较所选四种表面活性剂的作用，十二烷基硫酸钠对膜剂的影响作用最大，曲拉通次之，吐温80再次之，木质素磺酸钠的影响作用最小。从而可以确定十二烷基硫酸钠和曲拉通比较适合作为膜剂的表面活性剂。

表2不同浓度不同表面活性剂对制剂表面张力的影响

注：表中均为十次重复所得平均值±se

进一步考虑表面活性剂的生物相容性，测试方法如下：

将保存的各菌种摇瓶活化作为种子液，取0.1ml的各菌株种子液接种于分别含有10％成膜助剂和0.5％各表面活性剂的50ml培养液中，在30℃、180r/min振荡培养24h(ps04由于生长较慢，24h变化不明显，故培养48h)。利用紫外分光光度计测定od600的吸收值来表示各菌株的生长量。每组3次重复，以不添加任何助剂各菌株的生长量为对照。

测试结果如图10所示，从图10中可以看出10％的助剂对各细菌的影响作用不明显，对四种表面活性剂而言，曲拉通和木质素磺酸钠对ps04的生物相容性最好，吐温80次之，而十二烷基硫酸钠对各细菌的生长有明显的抑制作用，同时结果也表明，吐温80对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌的生长影响作用较小，曲拉通和木质素磺酸钠对这三种菌的生长有一定的抑制作用。

综合考虑表面活性剂的表面张力及对常见细菌的生物相容性，十二烷基硫酸钠虽然对膜剂有良好的降低表面张力的作用，但对细菌有很强的抑菌活性；曲拉通有良好的降低表面张力的作用，并且对细菌也具有良好的生物相容性；吐温80和木质素磺酸钠不及前两者的作用效果，但是对细菌有较好的生物相容性，综上所述，曲拉通的使用对成膜剂是做好的选择。

下面将结合实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

实施例1微生物农药成膜剂的制备

一种微生物农药成膜剂，以质量百分比计含有羧甲基纤维素钠4％，淀粉2％，甘油0.3％，曲拉通0.5％，ps04发酵液60％，其余为水。

制备方法：

(1)制备ps04发酵液：

查氏培养基：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁(mgso4·7h2o)0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，蒸馏水1l，用于ps04菌株培养。

刮取保存在斜面上的菌种接种于装有100ml查氏培养基的250ml锥形瓶中，30℃、180r/min振荡培养24h作为种子液，之后按5％的接种量接种到查氏培养基中，于30℃，180r/min振荡培养84h，得到发酵液原液。(胡亮亮,徐汉虹,廖美德.胶冻样类芽孢杆菌ps04产抗真菌物质培养条件的优化[j].华中农业大学学报,2011,30(3):276-279.)

(2)制备微生物农药成膜剂：

将淀粉于水中沸水浴溶解，待其常温与羧甲基纤维素钠一起溶于上述制得的ps04发酵液中，再加入甘油和曲拉通均匀混合，即得到微生物农药成膜剂。

成膜剂的应用实验

1.成膜剂喷涂叶片显微观察

喷施20倍稀释药液待干燥后，发现喷施膜剂的区域在光照状态下比较亮，如图11中a图红框中所示，在显微镜下观察发现，a图中红色方框中为喷施成膜剂的部分叶片，框内叶片明显发亮，这是药剂成的膜反光所造成，而红框外的叶片颜色较正常。b图为a图红圈中的放大显微图，明显在叶片中央出现分界线，其上部为膜剂处理部分，下部为未处理状态。可见在高浓度膜剂喷施下，药剂可在叶片表面形成一层薄膜。

2.对叶片气孔的影响

通过光学显微镜观察成膜剂处理后的番茄叶片气孔特性，如图12所示，图上部为对照组不同时刻的气孔观察图，图下部为成膜剂处理后不同时刻番茄叶片气孔的观察图。数据统计如表1所示，通过对番茄叶片一天内不同时间段的气孔观察及结果数据分析表明，成膜剂对植物叶片气孔的影响作用不明显。

表3成膜剂50倍液处理后不同时刻番茄叶片气孔指标分析

3.实验室模拟雨水淋溶实验

该成膜剂含有成膜成分羧甲基纤维素钠、淀粉、增塑剂甘油、表面活性剂曲拉通以及主要的活性成分ps04发酵液，该发酵液中富含果聚糖，前期研究表明此多糖主要起诱导植物产生抗病性和增加作物产量等的作用，为该发酵液防治作物病害的主要活性物质之一，因此为研究含有该发酵液的成膜剂在植物叶片上的耐雨水冲刷的能力，我们以此果聚糖的含量来表示其活性成分的含量，从而达到测定成膜剂在植物叶片上的耐淋溶效果。实验方法如下：

(1)试剂的配制

a.0.182g/l果糖标准溶液：称取0.0182g/l分析纯果糖(预先在55℃下真空干燥至恒重)，用少量蒸馏水溶解后定容至100ml，冰箱保存备用。

b.0.5g/l间苯二酚(a试剂)：称取0.05g间苯二酚，溶于100ml蒸馏水中，储存于冰箱中备用。

c.0.216g/l硫酸铁铵[fenh4(so4)2·l2h2o，b试剂]：称取0.1082gfenh4(so4)2·l2h2o，溶于500ml浓盐酸中，密封储存备用。

(2)果聚糖的测定方法

根据seliwanof反应，硫酸铁铵为催化剂，多糖在酸性条件下生成果糖，与间苯二酚生成橘红色配合物，该配合物的颜色深浅在一定范围内与果糖的量成正比。吸取适量液加水稀释至1ml，加入1.5mla试剂，1.5mlb试剂，于80℃水浴50min，冷却在473nm测定吸光值。

(3)模拟淋溶实验

将制备好的成膜剂样品液滴(10μl)滴于近叶脉表面上并使其自然干燥，再将叶子固定在带有胶带的玻璃载玻片上，用1ml蒸馏水滴定以模拟雨水，然后将洗涤液在叶片下方用一试管接收。滴定次数为10次，每次100μl(约为7滴)。将收集到的样品及10μl原样品按上述测定果聚糖的方法进行测定其在473nm处的吸光值，将吸光值代入标准回归方程，计算出每次滴定所洗涤下来的果聚糖含量，并计算最终叶片上残留的样品含量百分比。实验测定三次，取平均值。

取0.182g/l果糖标准溶液0.2～1ml，0.1ml为间隔，如表4各试剂含量加入试管中，按1.7.2中方法进行测定，以吸光度对果糖质量做出标准曲线(如图13)。回归方程y＝0.0046x+0.0099，n＝9，r＝0.997，式中x为果糖质量(μg)，y为吸光度。果糖含量在0～182μl范围内符合朗伯-比尔定律。

表4果糖标准曲线测定各试剂含量

对番茄、水稻、茄子、玉米、霸王花等植物叶片的淋溶实验处理结果数据统计如图14所示，从图中可以看出，霸王花在1ml水的第5次淋溶下，叶片上的残留量已经保持不变，最终有28％有效成分的残留。番茄和水稻是在第8次淋溶下，叶片上的活性物质残留量基本保持不变，最终有46％左右的残留。而茄子在第6次淋溶下，有效物质残留量保持在64％不变。玉米在第5次淋溶下，最终有71％的残留量。膜剂在叶片上的残留结果的差别，是由于不同植物叶片表面的状况不一样所导致的，但对多植物叶片实验表明，膜剂仍表现出良好的耐淋溶的特性。