一种人类卵母细胞及胚胎玻璃化冻融装置及其使用方法与流程

本发明属于医疗器械领域，具体涉及一种人类卵母细胞及胚胎玻璃化冻融装置及其使用方法。

背景技术：

随着国家全面“二孩”政策的放开，国内符合二孩标准的夫妻大约在9000万对，其中有6000万女性在35岁以上，这部分高龄妇女若想怀孕，很多都需借助辅助生殖(试管婴儿)技术。但由于环境污染、工作生活压力大、年龄增大以及不良生活方式等因素的叠加影响，根据中国人口协会、国家计生委联名发布的《中国不孕不育现状调研报告》显示，中国的不孕不育发病率在12.5％-15％，患者人数超过4000万，即意味着每7-8对夫妇中就有1对患有不孕不育问题，这些都不得不借助辅助生殖手段。

而在胚胎实验室进行ivf-et(体外受精—胚胎移植)操作时，会碰到取卵手术当日，女方卵母细胞已取出，但男方因种种原因无法取出精子的情况，也会碰到女方因恶性肿瘤而急需在接受化学治疗或放射线治疗前对生育力进行保存的情况，此时就需要对女性的卵母细胞进行冻存操作。而当胚胎体外发育到一定阶段，会碰到可利用胚胎数目大于移植胚胎数目或女方子宫内膜未处于最佳胚胎移植期等情况，此时就必须对胚胎进行冷冻保存操作。

目前，卵母细胞或胚胎的冷冻主要分为程序化冷冻和玻璃化冷冻。玻璃化冷冻相较于程序化冷冻因不需要购置昂贵的程序化冷冻仪，且具有操作简单、省时、冷冻效果好等优点而被大多数胚胎实验室所采用。

但现有的玻璃化冷冻和解冻操作往往在三孔板或四孔板中进行，且往往每间隔1～3分钟，实验人员需要用毛细玻璃管对卵母细胞/胚胎进行不同浓度冷冻液或解冻液间的转移操作，且为了保证卵母细胞/胚胎能与冷冻液或解冻液充分进行细胞膜内外的物质交换，需要用毛细玻璃管将卵母细胞/胚胎置于不同的液层并进行反复的抽吸吹打，同时还需来回搅动液面。而卵母细胞/胚胎的冷冻解冻过程本身就是细胞急剧皱缩-回胀-再皱缩-再回胀的过程，处于一个非自然生理的较为脆弱的状态，而此时再用毛细玻璃管对胚胎进行抽吸、吹打、搬运、搅动等的操作，势必存在影响卵母细胞/胚胎后续发育的风险，且不同孔之间的频繁转移的操作也存在将微小的卵母细胞/胚胎搬丢的风险，此外反复高频的操作也增加了实验人员的工作强度。

目前，国际上现有的卵母细胞/胚胎冷冻保护剂均选用蔗糖作为非渗透性保护剂，而选用丙二醇(proh)、乙二醇(eg)或二甲基亚砜(dmso)等为渗透性保护剂。现有国际上的冷冻保护剂配方如下：

配方1：

卵母细胞/胚胎冷冻液：

平衡液：75％缓冲液(v/v)+10％sps(v/v)+7.5％proh(v/v)+7.5％eg(v/v)；

冷冻液：60％缓冲液(v/v)+10％sps(v/v)+15％proh(v/v)+15％eg(v/v)+0.5mol/l蔗糖

卵母细胞/胚胎解冻液：

解冻液i：90％缓冲液(v/v)+10％sps(v/v)+1mol/l蔗糖；

解冻液ii：90％缓冲液(v/v)+10％sps(v/v)+0.5mol/l蔗糖；

解冻液iii：90％缓冲液(v/v)+10％sps(v/v)+0.25mol/l蔗糖；

解冻液iv：90％缓冲液(v/v)+10％sps(v/v)

配方2：

卵母细胞/胚胎冷冻液：

预平衡液：95％缓冲液(v/v)+5％hsa(v/v)

冷冻液i:85％缓冲液(v/v)+5％hsa(v/v)+5％dmso(v/v)+5％eg(v/v)

冷冻液ii:75％缓冲液(v/v)+5％hsa(v/v)+10％dmso(v/v)+10％eg(v/v)

冷冻液iii:25％缓冲液(v/v)+5％hsa(v/v)+20％dmso(v/v)+20％eg(v/v)+30％蔗糖

卵母细胞/胚胎解冻液：

解冻液i：65％缓冲液(v/v)+5％hsa(v/v)+30％蔗糖；

解冻液i：75％缓冲液(v/v)+5％hsa(v/v)+20％蔗糖；

解冻液i：85％缓冲液(v/v)+5％hsa(v/v)+10％蔗糖；

解冻液i：90％缓冲液(v/v)+5％hsa(v/v)+5％蔗糖

中国专利cn104663649a应用海藻糖替代蔗糖作为非渗透性冷冻保护剂，同时联合丙二醇(proh)和乙二醇(eg)作为渗透性冷冻保护剂于临床上取得不错的冻融效果，其配方为：

卵母细胞/胚胎冷冻液：

平衡液：60％缓冲液(v/v)+20％人血清替代物(v/v)+10％proh(v/v)+10％eg(v/v)；

冷冻液：40％缓冲液(v/v)+20％人血清替代物(v/v)+20％proh(v/v)+20％eg(v/v)+0.65mol/l海藻糖

卵母细胞/胚胎解冻液：

解冻液i：80％缓冲液(v/v)+20％人血清替代物(v/v)+1mol/l海藻糖；

解冻液ii：80％缓冲液(v/v)+20％人血清替代物(v/v)+0.5mol/l海藻糖；

解冻液iii：80％缓冲液(v/v)+20％人血清替代物(v/v)+0.2mol/l海藻糖；

解冻液iv：80％缓冲液(v/v)+20％人血清替代物(v/v)

以上所述缓冲液包括人输卵管液htf1024(sage，usa)，人输卵管液htf1023(sage，usa)，3-吗啉基丙磺酸gmops(vitrolife,sweden)及杜氏磷酸盐缓冲液dpbs(sage，usa)等，血清蛋白替代物sps(sage，usa)、人血清白蛋白hsa(vitrolife,sweden)均为人血清替代物，另v/v代表体积比。

但以上配方中，卵母细胞或胚胎都存在经历非连续性的浓度由低到高(例如配方1中渗透性冷冻保护剂proh的浓度由7.5％直接跳转至15％)或由高到低(cn104663649a专利配方中非渗透性冷冻保护剂海藻糖浓度由1mol/l直接跳转至0.5mol/l)。虽然目前玻璃化冷冻法能够于临床上取得较满意的复苏存活率、卵裂率、囊胚形成率和临床妊娠率。但自第一例人类胚胎玻璃化冻融后顺利分娩(1998年由mukaida完成)至今也不过20年历史，而玻璃化冻融后产生子代的安全性究竟如何，目前仍缺乏大样本的数据支持。

因此，尽可能减少体外环境或操作对胚胎的应激性刺激影响，让卵母细胞或胚胎在玻璃化冷冻和解冻过程中经历的冷冻保护剂的浓度变化更趋于渐进和柔和，对胚胎的体外生长发育及子代的安全性都是有益的。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种能使得卵母细胞/胚胎在体外进行玻璃化冷冻和解冻的过程中处于一个冷冻液或解冻液浓度连续性渐变的环境，能有效减少体外环境或操作对卵母细胞/胚胎的应激性刺激影响，且能免去一系列重复性操作的安全高效的玻璃化冻融装置及其使用方法。

本发明解决上述问题的技术方案是：

本申请的实施例提供一种人类卵母细胞及胚胎玻璃化冻融装置，所述装置包括水平设置的底盘，所述底盘上固定设有第一电机，所述第一电机的输出轴竖直向上延伸并连接有振动部；所述振动部包括回旋振荡托盘，所述回旋振荡托盘的下表面与所述第一电机的输出轴固定相连，以带动所述回旋振荡托盘转动，且所述第一电机连接有第一电源和控制所述第一电机启停的第一开关；

所述回旋振荡托盘的上表面上开设有用于容纳容置板的限位凹槽，所述限位凹槽的中心轴与所述第一电机的输出轴的中心轴共线；所述容置板偏心设置在所述限位凹槽内，所述容置板的中间开设有用于盛放液体的开口槽，且所述开口槽的槽口向上敞开；

所述底盘的一侧设有竖直向上延伸的支架，所述支架上固定设有水平延伸的延伸夹；且所述延伸夹的固定端固定在所述支架上，所述延伸夹的自由端向所述底盘的上方水平延伸；

所述延伸夹的自由端上开设有沿竖直方向贯通的通孔，出液管可滑动地贯穿所述通孔并通过夹持组件固定在所述延伸夹上；所述出液管的底端开设有出液口，所述出液口位于所述开口槽的开口的上方，以向所述开口槽内注入所述液体；且所述出液管位于所述延伸夹下方的管体上设有刻度；

所述出液管的顶端内连接有可沿所述出液管上下移动以用于抽吸或推注所述液体的驱动部，所述驱动部包括可沿竖直方向上下滑动地设置在所述出液管内的活塞，所述活塞的顶端通过连接杆与活塞杆相连；所述活塞杆可沿所述出液管的轴向滑动地设置在所述出液管内，所述活塞杆贯穿所述出液管的顶端开口，且所述活塞杆面向所述支架的一侧设有沿竖直方向延伸的齿条，且所述齿条与齿轮相啮合；

所述齿轮通过支撑板设置在支架上，所述齿轮固定套设在第二电机的输出轴上，所述第二电机固定在所述支撑板上，所述支撑板固定在所述支架上，且所述支撑板位于所述延伸夹的上方；

所述第二电机连接有第二电源、控制所述第二电机启停的第二开关和控制所述第二电机的转速的速度控制器。

进一步的，所述第一电机通过电机支撑板固定在所述底盘上。

进一步的，所所述装置还包括定时器，且所述定时器固定在所述支撑板上。

进一步的，所述开口槽的开口的面积大于槽底的面积。

进一步的，所述夹持组件具体为弹簧夹，所述出液管通过位于所述延伸夹上方和下方的弹簧夹固定在所述延伸夹上。

进一步的，所述活塞杆的外壁与所述出液管的内壁相贴合。

进一步的，所述回旋振荡托盘圆心处标注有红色凸点。

进一步的，所述液体是玻璃化冷冻液或解冻液，其中所述玻璃化冷冻液是平衡缓冲液、单一浓度的渗透性冷冻保护液或单一浓度的非渗透性冷冻保护液。

其中：所述平衡缓冲液的成分是体积分数为95％的人输卵管培养液和体积分数为5％的人血清替代物的混合液。

所述单一浓度的渗透性冷冻保护液是体积分数为55％的人输卵管培养液、体积分数为5％的人血清替代物、体积分数为20％的二甲基亚砜和体积分数为20％的乙二醇的混合物。

所述单一浓度的非渗透性冷冻保护液是体积分数为95％的蔗糖和体积分数为5％的人血清替代物的混合物。

所述解冻液是体积分数为65％的人输卵管培养液、体积分数为30％的蔗糖和体积分数为5％的人血清替代物的混合物。

本实施例还提供一种人类卵母细胞及胚胎玻璃化冻融装置的使用方法，包括以下步骤：

步骤1：出液管1通过驱动部抽取700ul的所述单一浓度的渗透性冷冻保护液，并向容置板的开口槽内加入300ul的所述平衡缓冲液，并使所述单一浓度的渗透性冷冻保护液和所述平衡缓冲液在25℃下静置平衡30min；

步骤2：调节出液管位置，使其与底盘保持垂直且出液口位于回旋振荡托盘圆心的正上方2～3cm处，然后将容置板置于回旋振荡托盘的限位凹槽内；

步骤3：开始进行玻璃化冷冻，向容置板的开口槽内加入所要冷冻的卵母细胞或胚胎，打开第一电机的第一开关，使所述回旋振荡托盘转动，且转速为100rpm，从而带动容置板圆周运动；

步骤4：1min后，打开第二电机的第二开关，使得所述第二电机带动齿轮转动，齿轮与齿条相啮合，活塞杆向下推动活塞，将所述单一浓度的渗透性冷冻保护液以100ul/min的流速从出液口推出并注入开口槽内，同时开启定时器，定时6min；

步骤5：当定时器发出提示声响时，关闭出第二开关，并用吸管向所述开口槽内加入400ul的所述单一浓度的非渗透性冷冻保护液；

步骤6：1min后，关闭第一开关，用毛细玻璃管将开口槽内的卵母细胞或胚胎转移到玻璃化冷冻载杆上，并迅速投入-196℃的液态氮中进行储存；

步骤7：开始进行玻璃化解冻前，用出液管内的活塞杆抽取1ml的所述平衡缓冲液，并向开口槽内加入300ul的所述解冻液，的所述解冻液，使所述平衡缓冲液在25℃下静置平衡30min，而将盛有所述解冻液的容置板置于37℃的温箱内静置平衡30min；

步骤8：调节出液管的位置，使其保持与底盘相垂直，且出液口位于回旋振荡托盘圆心的正上方2～3cm处；

步骤9：开始进行玻璃化解冻，将容置板从温箱内取出并置于操作台上，再迅速从-196℃的液态氮中取出所要解冻的卵母细胞或胚胎并置入盛有所述解冻液的开口槽内，通过显微镜观察并确认卵母细胞或胚胎已从冷冻载杆上卸下并进入到开口槽内，再将容置板置于所述回旋振荡托盘的限位凹槽内，并开启第一开关，使回旋振荡托盘进行旋转，且旋转速度为100rpm；

步骤10：2min后，打开第二电机的第二开关，将所述平衡缓冲液以100ul/min的流速滴入所述开口槽内，同时开启定时器，定时9min；

步骤11：当定时器发出提示声响时，关闭第二开关和第一开关，用毛细玻璃管将卵母细胞或胚胎从开口槽内转移到配子培养液或卵裂培养液内，并放置于37℃、co2浓度为6％的恒温恒湿培养箱内，以备后续操作。

本发明的有益效果主要表现在：

1、本发明所述装置通过出液管和回旋振荡盘的共同作用，使得卵母细胞/胚胎在体外进行玻璃化冷冻和解冻的过程中处于一个冷冻液或解冻液浓度连续性渐变的环境，且免去了实验人员对胚胎反复抽吸、吹打、转移、搅动等的操作，有效减少了体外环境及人为操作对胚胎应激性刺激的影响，有益于胚胎的远期发育和子代安全。同时也减轻了实验人员的工作强度，使人员能有效利用冷冻解冻过程中的间隙时间展开实验室的其他工作，提高了工作效率。

2、所述容置板偏心设置在所述限位凹槽内，即所述容置板的中心轴与所述回旋振荡托盘的中心轴相偏离，使得所述容置板具有较好的摇晃效果，从而促使所述开口槽内的液体均匀混合。

3、出液管设有的刻度方便实验人员于冷冻或解冻操作开始前准确吸取定量的液体(冷冻液或平衡缓冲液)，在保证实验反应充分完全的同时避免了液体的浪费。

4、出液管的出液口与开口槽的距离为2～3cm，距离较近，可有效避免液体下滴后的飞溅而影响冻融效果。

5、所述速度控制器能限制所述第二电机的转速，使得所述齿轮匀速转动，从而带动所述活塞杆匀速移动。

6、开口槽的开口的直径为3cm，保证了出液管滴注的液体全部进入开口槽内；所述开口槽呈上大下小的圆台状，消除了圆柱状凹槽底部直角处的视野干扰区，则使得开口槽能承接更多体积液体的同时更利于显微镜下的观察和毛细玻璃管的吸取操作。

7、将所述弹簧夹固定在所述出液管的不同轴向位置上，可以调节所述出液管的出液口与容置板之间的距离。

8、活塞和所述活塞杆的外壁面均与所述出液管的内壁面相贴合，提高了出液管推注液体的稳定性。

9、凸点可用于校准所述出液口的中心轴与所述回旋振荡托盘的圆心相对齐，便于肉眼观测和操作。

10、所述开口槽槽底的圆心处设有记号点，所述记号点参照所述第一凸点可以确定所述容置板在所述限位凹槽上的初始放置位置，便于肉眼观测和操作。

11、冷冻液及解冻液的基础底液选用htf(人输卵管培养液)则是考虑其比之现有技术的hepes或mops缓冲体系更接近于人体内的自然生理环境。

附图说明

图1是一实施例中本发明所述装置的结构示意图；

图2是应用现有国际上玻璃化冷冻液(具体为背景技术中的配方2)时，渗透性冷冻保护剂浓度与反应时间的关系曲线图；

图3是应用图1所述装置进行冷冻操作时，渗透性冷冻保护剂浓度与反应时间的关系曲线图；

图4是应用现有国际上玻璃化解冻液(具体为背景技术中所述的配方2)时，渗透性冷冻保护剂浓度与反应时间的关系曲线图；

图5是应用图1所述装置进行解冻操作时，渗透性冷冻保护剂浓度与反应时间的关系曲线图。

其中，图2～5中，横轴的t表示时间，纵轴的(v/v，％)表示体积分数。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明专利的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，如出现术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，如出现术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，如出现术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

参照附图，本实施例提供一种人类卵母细胞及胚胎玻璃化冻融装置，所述装置包括水平设置的底盘27，所述底盘27上固定设有第一电机21，所述第一电机21的输出轴211竖直向上延伸并连接有振动部22；所述振动部22包括回旋振荡托盘25，所述回旋振荡托盘25的下表面与所述第一电机21的输出轴211固定相连，以带动所述回旋振荡托盘25转动，且所述第一电机21连接有第一电源22和控制所述第一电机21启停的第一开关24；

具体的，所述第一电机的输出轴的中心轴向与竖直方向相平行，所述第一电机21转动可以带动所述回旋振荡托盘25同步转动。

所述回旋振荡托盘25的上表面上开设有用于容纳容置板3的限位凹槽26，所述限位凹槽26的中心轴与所述第一电机21的输出轴211的中心轴共线；所述容置板3偏心设置在所述限位凹槽26内，所述容置板3的中间开设有用于盛放液体的开口槽32，且所述开口槽32的槽口向上敞开；

具体的，所述容置板3是透明的。

具体的，所述回旋振荡托盘25在所述第一电机21的带动下转动时，可以促使所述容置板3摆动。且所述容置板3偏心设置在所述限位凹槽26内，即所述容置板3的中心轴与所述回旋振荡托盘25的中心轴相偏离，例如，所述回旋振荡托盘25的中心轴沿水平方向偏离所述回旋振荡托盘25的中心轴2mm，使得容置板3在回旋震荡托盘25上的旋转直径振幅为4mm，以使得所述容置板3具有较好的摇晃效果，从而促使所述开口槽32内的液体均匀混合。

所述底盘27的一侧设有竖直向上延伸的支架8，所述支架8上固定设有水平延伸的延伸夹81；且所述延伸夹81的固定端固定在所述支架8上，所述延伸夹81的自由端向所述底盘27的上方水平延伸；

具体的，所述支架8呈长杆状，所述延伸夹81的固定端固定套设在所述支架8的中间部位上。

所述延伸夹81的自由端上开设有沿竖直方向贯通的通孔，出液管1可滑动地贯穿所述通孔并通过夹持组件固定在所述延伸夹81上；所述出液管1的底端开设有出液口13，所述出液口13位于所述开口槽32的开口的上方，以向所述开口槽32内注入所述液体；且所述出液管1位于所述延伸夹81下方的管体上设有刻度；

具体的，所述出液口13的中心轴线与所述限位凹槽26的中心轴共线。

具体的，所述出液管1的容量为1ml，其中，所述刻度11包括标记容积的刻度线和对应的刻度示数。所述刻度示数自出液口13的出液口13向上逐渐增大，且相邻两刻度线的容积差值为0.1ml。

在本实施例中，出液管1设有的刻度11方便实验人员于冷冻或解冻操作开始前准确吸取定量的液体(冷冻液或平衡缓冲液)，在保证实验反应充分完全的同时避免了液体的浪费。

在本实施例中，出液管1的出液口13与开口槽32的距离为2～3cm，距离较近，可有效避免液体下滴后的飞溅而影响冻融效果。

所述出液管1的顶端内连接有可沿所述出液管1上下移动以用于抽吸或推注所述液体的驱动部，所述驱动部包括可沿竖直方向上下滑动地设置在所述出液管1内的活塞，所述活塞的顶端通过连接杆12与活塞杆相连；所述活塞杆可沿所述出液管1的轴向滑动地设置在所述出液管1内，所述活塞杆贯穿所述出液管1的顶端开口，且所述活塞杆面向所述支架的一侧122设有沿竖直方向延伸的齿条，且所述齿条与齿轮5相啮合；

所述齿轮5通过支撑板7设置在支架8上，所述齿轮5固定套设在第二电机6的输出轴61上，所述第二电机6固定在所述支撑板7上，所述支撑板7固定在所述支架8上，且所述支撑板7位于所述延伸夹81的上方；

具体的，所述第二电机6的输出轴61与所述活塞杆相垂直。所述第二电机6带动所述齿轮5转动，所述齿轮5在转动的过程中驱动相啮合的齿条，从而使得所述活塞杆上下移动，从而抽吸或推注所述液体。

所述第二电机6连接有第二电源62、控制所述第二电机6启停的第二开关65和控制所述第二电机6的转速的速度控制器63。

具体的，所述速度控制器63控制所述第二电机6的转速，可以控制所述所述液体出液或进液的流量。所述速度控制器63能限制所述第二电机6的转速，使得所述齿轮5匀速转动，从而带动所述活塞杆匀速移动，且液体的出液速度为100ul/min。

进一步的，所述第一电机21通过电机支撑板23固定在所述底盘27上。

具体的，所述第一电机21慢速转动，且所述第一电机的转速为100rpm。

进一步的，所述装置还包括定时器64，且所述定时器64固定在所述支撑板7上。

进一步的，所述开口槽32的开口的面积大于槽底的面积。

具体的，所述开口槽32呈上大下小的圆台状，其中，所述开口槽32的开口的直径为3cm，所述开口槽32的槽底直径为2cm，所述开口槽32的槽深为1cm。

在实施例中，开口槽32的开口的直径为3cm，保证了出液管滴注的液体全部进入开口槽32内；所述开口槽32呈上大下小的圆台状，消除了圆柱状凹槽底部直角处的视野干扰区，则使得开口槽32能承接更多体积液体的同时更利于显微镜下的观察和毛细玻璃管的吸取操作。

进一步的，所述夹持组件具体为弹簧夹811，所述出液管1通过位于所述延伸夹81上方和下方的弹簧夹811固定在所述延伸夹81上。

具体的，所述弹簧夹811夹持在所述出液管1外，且所述弹簧夹811的粗于所述通孔，从而限制所述出液管1沿所述出液管1滑动。将所述弹簧夹811固定在所述出液管1的不同轴向位置上，可以调节所述出液管1的出液口13与容置板3之间的距离。

进一步的，所述活塞杆的外壁与所述出液管1的内壁相贴合。

具体的，所述活塞和所述活塞杆的外壁面均与所述出液管的内壁面相贴合，提高了出液管推注液体的稳定性。其中，所述活塞杆面向所述支架8的一侧122设有沿竖直方向延伸的齿条，所述活塞杆的另一侧121为光面。

进一步的，所述回旋振荡托盘25圆心处标注有凸点251。

具体的，所述凸点251可用于校准所述出液口13的中心轴与所述回旋振荡托盘25的圆心相对齐，便于肉眼观测和操作。

进一步的，所述开口槽32槽底的圆心处设有记号点31。所述记号点31参照所述第一凸点251，以确定所述容置板3在所述限位凹槽26上的初始放置位置，便于肉眼观测和操作。7、所述液体是玻璃化冷冻液或解冻液，其中所述玻璃化冷冻液是平衡缓冲液、单一浓度的渗透性冷冻保护液或单一浓度的非渗透性冷冻保护液。

其中：所述平衡缓冲液的成分是体积分数为95％的人输卵管培养液和体积分数为5％的人血清替代物的混合液。

所述单一浓度的渗透性冷冻保护液是体积分数为55％的人输卵管培养液、体积分数为5％的人血清替代物、体积分数为20％的二甲基亚砜和体积分数为20％的乙二醇的混合物。

所述单一浓度的非渗透性冷冻保护液是体积分数为95％的蔗糖和体积分数为5％的人血清替代物的混合物。

所述解冻液是体积分数为65％的人输卵管培养液、体积分数为30％的蔗糖和体积分数为5％的人血清替代物的混合物。

具体的，所述人输卵管培养液选自人输卵管液htf1024(sage，usa)，人输卵管液htf1023(sage，usa)；所述人血清替代物选自人血清白蛋白hsa(vitrolife,sweden)；所述二甲基亚砜、乙二醇，均为渗透性冷冻保护剂，分别选自二甲基亚砜dmso(sigma，usa)和乙二醇eg(sigma，usa)；所述蔗糖为非渗透性冷冻保护剂，选自蔗糖sucrose(sigma，usa)。

在本实施例中，冷冻液及解冻液的基础底液选用htf(人输卵管培养液)则是考虑其比之现有技术的hepes或mops缓冲体系更接近于人体内的自然生理环境。

本实施例还提供一种人类卵母细胞及胚胎玻璃化冻融装置的使用方法，包括以下步骤：

步骤1：出液管通过驱动部抽取700ul的所述单一浓度的渗透性冷冻保护液，并向容置板3的开口槽32内加入300ul的所述平衡缓冲液，使所述单一浓度的渗透性冷冻保护液和所述平衡缓冲液在25℃下静置平衡30min；

步骤2：调节出液管1位置，使其与底盘27保持垂直且出液口13位于回旋振荡托盘25圆心的正上方2～3cm处，然后将容置板3置于回旋振荡托盘25的限位凹槽26内；

步骤3：开始进行玻璃化冷冻，向容置板3的开口槽32内加入所要冷冻的卵母细胞或胚胎，打开第一电机21的第一开关24，使所述回旋振荡托盘25转动，且转速为100rpm，从而带动容置板3圆周运动；

步骤4：1min后，打开第二电机6的第二开关65，使得所述第二电机6带动齿轮5转动，齿轮5与齿条相啮合，活塞杆向下推动活塞，将所述单一浓度的渗透性冷冻保护液以100ul/min的流速从出液口13推出并注入开口槽32内，同时开启定时器64，定时6min；

步骤5：当定时器64发出提示声响时，关闭出第二开关65，并用吸管向所述开口槽32内加入400ul的所述单一浓度的非渗透性冷冻保护液；

步骤6：1min后，关闭第一开关24，用毛细玻璃管将开口槽32内的卵母细胞或胚胎转移到玻璃化冷冻载杆上，并迅速投入-196℃的液态氮中进行储存；

步骤7：用出液管1内的活塞杆抽取1ml的所述平衡缓冲液，并向开口槽32内加入300ul的所述解冻液，使所述平衡缓冲液在室温环境下静置平衡30min，而将盛有所述解冻液的容置板3置于37℃的温箱内静置平衡30min；

步骤8：调节出液管1的位置，使其保持与底盘27相垂直，且出液口13位于回旋振荡托盘25圆心的正上方2～3cm处；

步骤9：开始进行玻璃化解冻，将容置板3从温箱内取出并置于操作台上，再迅速从-196℃的液态氮中取出所要解冻的卵母细胞或胚胎并置入盛有所述解冻液的开口槽32内，通过显微镜观察并确认卵母细胞或胚胎已从冷冻载杆上卸下并进入到开口槽32内，再将容置板3置于所述回旋振荡托盘25的限位凹槽26内，并开启第一开关24，使回旋振荡托盘25进行旋转，且旋转速度为100rpm；

步骤10：2min后，打开第二电机6的第二开关66，将所述平衡缓冲液以100ul/min的流速滴入所述开口槽32内，同时开启定时器，定时9min；

步骤11：当定时器发出提示声响时，关闭第二开关66和第一开关24，用毛细玻璃管将卵母细胞或胚胎从开口槽32内转移到配子培养液或卵裂培养液内，并放置于37℃、co2浓度为6％的恒温恒湿培养箱内，以备后续操作。

通过图3与图2的对比，可以看出应用本发明所述装置进行冷冻较之现有的玻璃化冷冻(图2)，渗透性冷冻保护液dmso和eg的浓度随着反应时间的推移呈连续性渐进式的增高(图3)；而通过图5与图4的对比，可以看出应用本发明所述装置进行解冻较之现有的玻璃化解冻(图4)，非渗透性冷冻保护液蔗糖的浓度随着反应时间的推移呈连续性渐进式的降低(图5)，整个体外反应环境更加柔和。

本申请实施例至少具有如下技术效果：

1、本发明所述装置通过出液管和回旋振荡盘的共同作用，使得卵母细胞/胚胎在体外进行玻璃化冷冻和解冻的过程中处于一个冷冻液或解冻液浓度连续性渐变的环境，且免去了实验人员对胚胎反复抽吸、吹打、转移、搅动等的操作，有效减少了体外环境及人为操作对胚胎应激性刺激的影响，有益于胚胎的远期发育和子代安全。同时也减轻了实验人员的工作强度，使人员能有效利用冷冻解冻过程中的间隙时间展开实验室的其他工作，提高了工作效率。

2、所述容置板偏心设置在所述限位凹槽内，即所述容置板的中心轴与所述回旋振荡托盘的中心轴相偏离，使得所述容置板具有较好的摇晃效果，从而促使所述开口槽内的液体均匀混合。

3、出液管设有的刻度方便实验人员于冷冻或解冻操作开始前准确吸取定量的液体(冷冻液或平衡缓冲液)，在保证实验反应充分完全的同时避免了液体的浪费。

4、出液管的出液口与开口槽的距离为2～3cm，距离较近，可有效避免液体下滴后的飞溅而影响冻融效果。

5、所述速度控制器能限制所述第二电机的转速，使得所述齿轮匀速转动，从而带动所述活塞杆匀速移动。

6、开口槽的开口的直径为3cm，保证了出液管滴注的液体全部进入开口槽内；所述开口槽呈上大下小的圆台状，消除了圆柱状凹槽底部直角处的视野干扰区，则使得开口槽能承接更多体积液体的同时更利于显微镜下的观察和毛细玻璃管的吸取操作。

7、将所述弹簧夹固定在所述出液管的不同轴向位置上，可以调节所述出液管的出液口与容置板之间的距离。

8、活塞和所述活塞杆的外壁面均与所述出液管的内壁面相贴合，提高了出液管推注液体的稳定性。

9、凸点可用于校准所述出液口的中心轴与所述回旋振荡托盘的圆心相对齐，便于肉眼观测和操作。

10、所述开口槽槽底的圆心处设有记号点，所述记号点参照所述第一凸点可以确定所述容置板在所述限位凹槽上的初始放置位置，便于肉眼观测和操作。

11、冷冻液及解冻液的基础底液选用htf(人输卵管培养液)则是考虑其比之现有技术的hepes或mops缓冲体系更接近于人体内的自然生理环境。

本说明书实施例所述的内容仅仅是对发明构思的实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式，本发明的保护范围也包括本领域技术人员根据本发明构思所能够想到的等同技术手段。