一种多粘类芽孢杆菌发酵物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及农作物病害生物防治技术领域，尤其涉及一种多粘类芽孢杆菌发酵物及其制备方法和应用。

背景技术：

生物农药是指:“利用生物活体或其代谢产物对害虫、病菌、杂草等有害生物进行防治的一类农药制剂，或者是通过生物技术或仿生合成具有农药功能的生物制品”。在农药登记管理中生物农药概念通常是狭义的，主要指昆虫天敌、植物源农药、微生物农药和转基因生物。

日前，国内化学农药虽发挥了重要作用，但环境污染问题越来越突出，生物农药的绿色发展是粮食安全、生态安全和环境安全的需要，同时能进一步减少病虫草害抗药性的发生。

多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)是一类产芽孢的革兰氏阳性细菌，类芽孢杆菌属，分布广泛，不仅存在土壤、植物根系和体表，而且也是植物体内常见的内生细菌。多粘类芽孢杆菌对植物具有非致病性，同时具有防病和促生作用，作为生防菌广泛应用在农业生产中。多粘类芽孢杆菌能在植物宿主中快速的定殖并移动，从而能与病原菌竞争空间和营养，它还能通过诱导作用提高宿主植物的抗病能力，并通过固氮和溶磷作用为宿主植物提供成分，促进植物生长。

天然生物膜(菌膜)：多粘类芽孢杆菌能产生肽类、蛋白质类、核苷类和酚类等多种抗菌物质，能防治多种由病原细菌、病原真菌、根结线虫引起的植物病害，同时能形成粘性菌膜，菌膜的形成一方面可以通过调节微生物菌体的生长和繁殖来控制，另一方面也可以通过调节微生物生长过程中胞外多糖、s层蛋白的分泌来控制。菌膜作用于细菌或孢子体，易于黏附到各种靶体表面并有利定殖，可提高环境抗逆性、同时有利于孢子萌发，在抑菌活性等多方面也发挥重要的作用。

人工生物膜(脂质体)：当磷脂分散在水中时能形成多层微囊，每一层均为磷脂双分子层，各层之间被水相分开，这种具有类似生物膜的磷脂双分子结构称为脂质体。由于它的结构类似于细胞，所以又称为人工生物膜。脂质体作为药物的载体具有持效作用。脂质体作为药物的储库，可使被包封药物缓慢释放，从而使药物制剂具有控释作用。

制备脂质体的原料主要是类脂物质，应用较多的以植物性的大豆卵磷脂为主，其主要为不饱和脂肪酸，可以使脂质体具有较低的相转变温度，有很好的流动性和低的粘滞性，同时大豆卵磷脂作为两性表面活性物质，无毒性，受酸碱度、盐浓度的影响较小，生物兼容性好，而且本身亦具有良好的生理活性，可促性药物的透黏膜吸收，可以单独形成微乳。

常规脂质体作为一种良好的载体，有着许多独特的优点，但同时也存在着一定的不足，随着时间的推移，存在着絮凝、沉降、粒径增大所导致的内容物渗透等稳定性较差的问题，限制了其在医药、农药产业中的应用。许多药物在喷施到田间，短时间内达到峰值，即被降解。由于高分子聚合物的药物载体稳定性好，用其去修饰脂质体表面，通过表面修饰过的脂质体将微生物药物包裹，可以延缓药物的排放和代谢，同时可以有效的延长微生物药物在植物中的滞留时间，从而延长药效。另一方面，改性后的脂质体能保持微生物良好的定殖能力。

聚乙二醇(peg)包覆脂质体：peg是由乙氧基单元构成的聚醚类高聚物，是一种无毒、无副作用、环境友好的水溶性高分子聚合物。peg-4000作为粘合剂，可提高脂质体微囊体的表面成膜性和固化强度，有利于囊体中药物释放的持效性，也是有利于保持微生物孢子体萌发活力的微环境。同时，peg具有便宜、易得，既溶于水又溶于多种有机溶剂，具有独特的端基反应性和可修饰性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种多粘类芽孢杆菌发酵物及其制备方法和应用，该制备方法得到的发酵物富含孢子体和菌膜，可用于制备孢子体微囊和孢子体微囊悬浮剂，并用于防治水稻的纹枯病、稻曲病和恶苗病。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种多粘类芽孢杆菌发酵物的制备方法，包括：依次进行菌种的活化、种子培养和发酵培养，经离心、浓缩后，得到多粘类芽孢杆菌发酵物；所述发酵物为菌膜和多粘类芽孢杆菌孢子体的混合物；

所述菌种的命名为多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)zju-n，保藏编号为：cctccno:m2018692，保藏日期为2018年10月19日；

所述种子培养的培养基成分为：蔗糖10-15g/l，胰蛋白胨5-10g/l，酵母浸提物3-5g/l，牛肉膏1.5-3g/l，nacl8-10g/l，ph7.0-7.2；

所述发酵培养的培养基成分为：马铃薯220-250g/l，胰蛋白胨5-8g/l，蔗糖10-15g/l，酵母浸提物1-5g/l，牛肉膏0.5-1g/l，nacl1-5g/l，ca(no3)2·4h2o0.5-2g/l，na2hpo4.12h2o1.5-3g/l，ph7.0-7.2。

上述制备方法中采用的多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)zju-n为水稻多功能性内生菌，寄生在水稻中，能快速在水稻中占据有利的生态位，并能与寄主植物建立共生关系，同时能够有效的抑制水稻多种病害的侵染，降低病害发生率，显著提高水稻的产量和安全性，实现水稻的健康无公害生产。多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)zju-n还具有生长速度快，产孢能力强的特点；更重要的是，该菌株能够高产菌膜，有利于后续孢子体微囊和悬浮剂的制备，提高悬浮剂的防治效果。

本发明采用上述特定的多粘类芽孢杆菌菌株进行发酵处理，并通过改变种子培养基和发酵培养基中c源和n源的原料种类以及其他各营养物的组分，能使多粘类芽孢杆菌在种子液和发酵培养前期菌株的营养体呈指数型快速增长，保证了后期充足的孢子体的数量，随着发酵培养基中营养物的快速耗尽、ph升高，多粘类芽孢杆菌在稳定后期开始形成大量的孢子体和菌膜。

作为优选，所述菌种活化的条件为：25～35℃下培养24～48h；更优选，28～30℃下培养36～48h。

作为优选，所述种子培养的条件为：25～35℃下培养12～24h；转速为140～200rpm；更优选，28～30℃下培养18-24h；转速为150～180rpm。

作为优选，所述发酵培养的条件为：25～35℃下培养48～72h；转速为250～400rpm；更优选，28～30℃下培养48～72h；转速为300～350rpm。

本发明提供了一种利用上述制备方法制得的多粘类芽孢杆菌发酵物，该多粘类芽孢杆菌发酵物的孢子数为10¹⁰-10¹¹个/ml。

本发明还提供了一种孢子体微囊，以质量百分数计，由以下组分构成：

多粘类芽孢杆菌发酵物100份；

聚乙二醇1～10份；

大豆卵磷脂1～20份；

所述多粘类芽孢杆菌发酵物如上所述。

本发明还提供了一种孢子体微囊悬浮剂，以质量百分数计，由以下组分构成：

所述孢子体微囊如上所述。

进一步地，所述分散剂为聚羧酸盐、有机磷酸酯和萘磺酸盐聚合物中的至少一种。

进一步地，所述乳化剂为聚酯复合物、有机磷酸酯、eo/po嵌段聚醚、蓖麻油聚氧乙烯醚，脂肪醇聚氧乙烯醚、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯和失水山梨醇脂肪酸酯中的至少一种。

进一步地，所述助悬剂为膨润土、白炭黑和硅酸镁铝中的至少一种。

本发明还提供了孢子体微囊悬浮剂在制备防治水稻纹枯病、稻曲病和水稻恶苗病药剂中的应用。

进一步地，所述孢子体微囊悬浮剂的施用量为30-300ml。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明制备方法通过选择特定的多粘类芽孢杆菌、改变种子培养基和发酵培养基的组分类型和用量进行发酵，能够得到富含菌膜和多粘类芽孢杆菌孢子体的发酵产物，显著提高多粘类芽孢杆菌的孢子率和菌膜含量。

(2)本发明提供的孢子体微囊以及用孢子体微囊制备的悬浮剂具有耐雨水冲刷和持效期长的特点，对水稻多种病害都具有良好的防治效果，能有效替代或减少化学农药的使用，并能促进植物生长，增加水稻产量。

(3)本发明提供的多粘类芽孢杆菌发酵工艺能使该菌株自身分泌产生大量的粘性菌膜，可直接利用作为天然的生物膜材料，同时用天然的脂质体生物膜植物大豆卵磷脂加工，经高分子聚合物peg4000修饰所形成的新型微囊体，其加工技术新颖，绿色环保无污染，为生物农药的制剂加工提供了新的思路。

(4)本发明成功开发了一种能有效利用自身分泌出的生物膜来包囊其活性孢子，用绿色环保的生物材料来进一步的加工改良形成新型微生物农药，该加工技术在植物病害绿色防控的发展工作中提供了新的思路。

附图说明

图1为实施例1中多粘类芽孢杆菌(zju-n)拮抗水稻纹枯病菌(1)、稻曲病菌(2)和水稻恶苗病菌(3)的结果图；

其中，a为对照ck；b为多粘类芽孢杆菌(zju-n)。

图2为实施例2中多粘类芽孢杆菌的发酵装置图；

图3为实施例3中孢子体微囊悬浮剂的抗雨水淋刷图；

其中，包括自制的孢子体微囊悬浮剂(左)和未制成微囊悬浮剂的孢子液(右)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1多粘类芽孢杆菌的室内生物测定

1、从水稻中分离内生菌

从浙江温岭、金华地区的水稻恶苗、纹枯发病田块中，挑取健康稻株，取上下中部植株叶片径杆，切成5mm×5mm的小块，用75％乙醇消毒1min左右，再用灭菌水漂洗3次，除去残留的消毒剂，最后将其放在无菌吸水纸上吸去多余的水分，再把其放入无菌研钵中，加入6mlbps缓冲液研碎，取上清10、50、100倍稀释，取各稀释液200μl涂布于lb平板，同时验证最后一次冲洗水涂布于lb平板，检验组织表面消毒是否彻底，30℃暗培养1-2d，并记录菌落形态、大小和颜色。

上述分离得到的多粘类芽孢杆菌的生物学特征为：菌落在na培养基上形成乳白色菌落，半透明，菌落光滑，粘液状。革兰式染色为阳性，菌体细胞呈杆状，在逆境条件下，多粘类芽孢杆菌能在膨大孢子囊中产生椭圆形休眠体-芽孢，规格为1.4-1.8×0.5-0.8μm。

将上述分离得到多粘类芽孢杆菌进行菌种保藏，保藏信息如下：菌种名称：多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)zju-n；保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国武汉武汉大学；保藏编号：cctccno:m2018692；保藏日期：2018年10月19日。

2、室内拮抗实验评价多粘类芽孢杆菌对水稻纹枯病、稻曲病和水稻恶苗病的抑制作用

对实验室分离鉴定的水稻纹枯、稻曲病和水稻恶苗病菌株重新活化培养分别约3d、10d和5d左右，在菌株生长活跃的同一圆周上制取菌碟(直径0.5cm)，菌丝面朝下并将其转移到pda平板中央，用灭菌镊子取出浸在菌液中的滤纸片，放置在离病原菌碟2.5cm处的平板上，以无菌液滤纸片做对照，实验做4个重复，然后把培养皿倒置在25℃培养箱中，水稻纹枯培养4d，稻曲培养10d，恶苗病培养5d，取出观察是否具有了明显的抑制作用。

如图1(a1和b1)所示，当量取ck对照平板的纹枯菌落直径为8.9cm时，加拮抗菌zju-n平板中的纹枯菌只长了2.2cm，抑制率达到了80％，说明多粘类芽孢杆菌zju-n对水稻纹枯病菌具有明显的拮抗效果。

如图1(a2和b2)所示，当量取ck对照平板的稻曲菌落直径为3.6cm时，加拮抗菌zju-n平板中的稻曲病菌仅为1.5cm，抑制率达到了67％，说明多粘类芽孢杆菌zju-n对稻曲病菌具有明显的拮抗效果。

如图1(a3和b3)所示，当量取ck对照平板的水稻恶苗病菌落直径为3.8cm时，加拮抗菌zju-n平板中的稻曲病菌为2.1cm，抑制率达到了52％，说明多粘类芽孢杆菌zju-n对水稻恶苗病菌具有较明显的拮抗效果。

实施例2多粘类芽孢杆菌(zju-n)的发酵工艺

本实施例发酵所用的培养基见表1。

表1本实施例发酵所用的培养基汇总

设备：多粘类芽孢杆菌(zju-n)液体成套发酵设备购置于上海楚怡生物科技有限公司。

发酵工艺流程：

(1)菌种活化：挑取一环多粘类芽孢杆菌zju-n于固体平板上划线活化，将接种好的平板置于30℃培养箱中培养72h；

(2)种子培养：挑取步骤(1)活化的多粘类芽孢杆菌的一个独立菌落接种于装有100ml种子培养液的250ml三角瓶中，在温度为30℃、转速160rpm的条件下培养24h；

(3)发酵培养：将培养好的种子液以3％的接种量接入含有13l的发酵培养基的15l发酵罐中，控制发酵罐温度为30℃、转速为300rpm，80％-100％的溶解氧，在发酵开始后，每隔12h进行取样镜检，直到镜检下看到形态统一的芽孢(几乎没有菌体存在)，再进行芽孢率的检测，观察粘性分泌物生物菌膜的产生，最后确定发酵终止时间和发酵工艺的优劣，最终得到多粘类芽孢杆菌发酵物。

实验以最优化发酵培养液13l，温度30℃，转速为300rpm，80-100％的溶解氧，3％的接种量进行15l发酵罐的发酵(如图2)，镜检下确定产孢率在10⁹个/ml，芽孢率达95％以上，观察到分泌大量粘性菌膜需要3-4天。

实施例3发酵工艺的优化

本实施例对发酵培养基进行的优化：在基础培养基(胰蛋白胨：5g/l；牛肉膏：3g/l；酵母浸提物：1g/l；nacl：3g/l；na2hpo4.12h2o：1.5g；ca(no3)2.4h2o：0.5g)的基础上考察了几种常见碳源(碳源的用量与实施例2相同)对多粘类芽孢杆菌活菌数、产芽孢量和菌膜分泌情况的影响。见表2。其余步骤与实施例2完全相同。

表2:不同碳源对多粘类芽孢杆菌(zju-n)活菌数、产孢量和菌膜分泌量的影响

注：菌膜分泌量多“+++”，较多“++”，较少“+”，无分泌“-”

由上述表2可见，马铃薯和蔗糖是较为合适的碳源，同时在上述单因子试验之后，对碳源、氮源及无机盐的浓度作了进一步的筛选，得出较为合适的比例，即实施例2中所示的发酵培养基组分和用量，活菌数和芽孢率的结果见实施例2。

实施例4多粘类芽孢杆菌新型孢子体微囊悬浮剂的制备和田间应用1、新型孢子体微囊悬浮剂的制备和抗雨水冲刷测定

(1)孢子体微囊的制备：取固态高纯度大豆卵磷10g，胆固醇用量5g，混合后加氯仿浸泡溶解，减压蒸发氯仿，脂质(即大豆卵磷和胆固醇的混合物)在瓶内璧形成一层薄膜后，加入100ml实施例2制备的多粘类芽孢杆菌发酵物(即：芽孢和粘性菌膜的混合物)，然后通过手摇法，制得多层脂质体，期间加入质量分数为2.5％的peg4000，搅拌均匀，一段时间后，即可得到peg包覆的孢子体生物膜脂质体微囊(即：孢子体微囊)。

(2)孢子体微囊悬浮剂的制备：以质量百分数计，取制得的孢子体微囊20％，分散剂ds5553％，乳化剂of-346312％，乳化剂22805％，助悬剂膨润有机土2％，混合剪切，制备获得孢子体微囊悬浮剂，供田间使用。

(3)耐雨水冲刷测定：载玻片上人工附膜，模拟水稻植株表面腊质层，分别滴加孢子体微囊悬浮剂(左)和未制成微囊悬浮剂的孢子液(右，即只经实施例2发酵获得的多粘类芽孢杆菌发酵物)，模拟雨水均匀冲刷，观察结果(如图3)。

2、田间施用孢子体微囊悬浮剂对水稻纹枯病的防治效果和产量测定

施药地点：嘉兴农科院古塘基地时间：水稻孕穗期

处理组1：包含菌膜的多粘类芽孢杆菌孢子体微囊悬浮剂(本实施例第一部分制备得到)，3000亿cfu/亩；

处理组2：无菌膜的多粘类芽孢杆菌孢子体微囊悬浮剂，制备方法是：采用除发酵培养基的碳源为果糖外，其余内容与实施例2完全相同的发酵工艺制备发酵物，再采用实施例4第一部分完全相同的方法制备孢子体微囊和悬浮剂，并确保孢子体数量与处理组1相同；3000亿cfu/亩；

处理组3：24％噻呋酰胺sc，20毫升/亩；

处理组4：不施药对照。

小区面积33m²，4次重复。

调查方法：每小区按照对角线五点取样，每点调查0.5m²，记录总株数、病株数和病级数。

调查时间：施药后第14天。

药效计算方法：按以下公式计算：

式中：pt：防治效果，单位为百分率(％)；ck1：空白对照区施药后病情指数；pt1：药剂处理区施药后病情指数。

测产和考种于水稻成熟后进行，每处随机取样6点，每点0.25m²，合计1.5m²，调查穗数、晒干后称重量及测量千粒重(各重复组平均)。

表3水稻纹枯病田间药效试验结果的比较

表4实验田块测产及考种结果

结果如表3、表4所示，上述多粘类芽孢杆菌孢子体微囊悬浮剂能有效地防治水稻纹枯病的发生，防效略低于化学药剂噻氟酰胺，可用于替代或减少化学农药的使用，并减缓抗药性的发生；从测产及考种结果分析，自创微生物制剂(即：处理1)比对照增产3.3％。