无血清纳米材料冻存剂及其制备方法、使用方法，冻存液与流程

本发明涉及细胞冻存领域，具体而言，涉及一种无血清纳米材料冻存剂及其制备方法、使用方法，冻存液。

背景技术：

细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，起到了细胞保种的作用。

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，利用冻存技术可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。

目前现有技术中，细胞冻存液中的主要成分有10％二甲基亚砜(dmso)、20％～90％胎牛血清(fbs)、剩余组分为不完全培养基。培养基以及fbs可为细胞提供必要的营养物质。dmso是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，从而达到降低细胞损伤的保护效果。但fbs属于动物源性物质，成分比较复杂，在临床应用上存在潜在的风险，也增加了污染的几率，并且由于冻存液中含有动物血清，会导致冻存液的成分存在不稳定的因素，此外细胞冻存后的复温过程多为水浴复温，复温效能低下，复温过程中细胞损伤大。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种无血清纳米材料冻存剂，该冻存剂不含有任何血清成分，避免了冻存液会被污染的潜在弊端的存在，成分也更加稳定，并同时复配了氧化石墨烯来调整溶液的性状，使其更利于细胞的保存，冻存效果也更为优异，本身氧化石墨烯具有吸附性强、导热性佳、抑制冰晶形成等多种作用，有利于减少细胞降温过程中的损伤，该新兴的石墨烯材料可通过改性，易于产生光热效应或携带药物，易于通过加快复温速度减少复苏过程中的细胞损伤，将其引入冻存剂中提高了冻存剂本身的应用性，与传统冻存剂相比，复苏后的细胞在存活率上有明显的提高，因此值得广泛推广进行应用。

本发明的第二目的在于提供上述冻存剂的制备方法，制备方法本身操作简便，前后步骤衔接紧密，操作条件温和，无三废产生，整个操作过程绿色环保。

本发明的第三目的在于提供上述冻存剂的使用方法，使用方法简单，易操作，对环境要求低，适于更为广泛的进行应用。

本发明的第四目的在于提供包含上述冻存剂的冻存液，该冻存液中还包含了用于混悬细胞的细胞混悬剂，这样细胞可以形成均一的分散液，更利于冻存操作的顺利进行。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明提供了一种无血清纳米材料冻存剂，包括dmso、血清替代物以及氧化石墨烯组成。

目前现有技术中，细胞冻存液中的主要成分有10％二甲基亚砜(dmso)、20％～90％胎牛血清(fbs)、剩余组分为不完全培养基。培养基以及fbs可为细胞提供必要的营养物质。dmso是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，从而达到降低细胞损伤的保护效果。但fbs属于动物源性物质，成分比较复杂，在临床应用上存在潜在的风险，也增加了污染的几率，并且由于冻存液中含有动物血清，会导致冻存液的成分存在不稳定的因素，此外细胞冻存后的复温过程多为水浴复温，复温效能低下，复温过程中细胞损伤大。

本发明为了解决上述技术问题，提供了一种不含有血清的细胞冻存液，该细胞冻存液的成分比较简单，除了常规使用的二甲基亚砜(dmso)，还含有血清替代物和氧化石墨烯，氧化石墨烯具有吸附性强、导热性佳、抑制冰晶形成等多种作用，有利于减少细胞降温过程中的损伤，该新兴的石墨烯材料可通过改性，易于产生光热效应或携带药物，易于通过加快复温速度减少复苏过程中的细胞损伤，将其引入冻存剂中提高了冻存剂本身的应用性，与传统冻存剂相比，复苏后的细胞在存活率上有明显的提高，因此值得广泛推广进行应用。

可见，通过采用本发明的冻存剂不仅可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤，此外还能避免存在潜在污染的弊端问题的出现，后续复温的效能得到了提高，因此值得广泛推广进行应用。

优选地，作为进一步可实施的方案，所述dmso与所述血清替代物的体积比为1：(9-15)之间，dmso与血清替代物控制在比较适宜的比例范围内，才能保证冻存操作的顺利进行。

优选地，所述dmso与所述血清替代物的体积比为1:10。

优选地，作为进一步可实施的方案，所述氧化石墨烯配制成浓度为1-5ug/ml的氧化石墨烯水溶液。

优选地，所述氧化石墨烯水溶液添加后终浓度为1-5ug/ml之间，氧化石墨烯水溶液的添加量也不宜过大，如果添加量太大可能溶液的稳定性会受到破坏，也会影响到冻存的效果。

优选地，作为进一步可实施的方案，氧化石墨烯水溶液的氧化石墨烯粒径为20-200nm之间。

优选地，作为进一步可实施的方案，所述血清替代物的型号为gibcoknockout^tm血清替代物10828-028，这种血清替代物比较常见，容易获得。

本发明实施例还提供了无血清纳米材料冻存剂的制备方法，包括如下步骤：

将dmso添加到血清替代物中混匀，再添加氧化石墨烯水溶液混合均匀，4℃保存即可。

具体操作时可以按照如下步骤进行：无菌条件下取血清替代物置于离心管，加入dmso混合均匀，体积比为血清替代物：dmso＝1：(9-15)。取出5μl混合物后，加入1-5ug/ml的氧化石墨烯水溶液，混合均匀，4℃保存。

氧化石墨烯水溶液的最优添加后终浓度为1-5ug/ml，保存温度为4℃。

本发明实施例还提供了包含上述无血清纳米材料冻存剂的冻存液；所述冻存液中优选地还包括无血清培养基构成的细胞混悬剂。

本发明实施例还提供了上述无血清纳米材料冻存剂的使用方法，包括如下步骤：

将细胞与细胞混悬剂混合均匀后，逐滴加入所述细胞冻存剂，-80℃以下冻存。

上述冻存的温度可以根据实际需要进行调整。

优选地，作为进一步可实施的方案，细胞冻存剂加入之前先在冰水混合物中预冷，通过预冷的操作可以加强后续冻存细胞的效果。

优选地，细胞与细胞混悬剂混合均匀后，细胞的终浓度为(4-6)×10⁶个/ml。

优选地，作为进一步可实施的方案，细胞混悬剂与细胞冻存剂的体积比控制在1：(3-5)之间，优选地为1：4。

优选地，作为进一步可实施的方案，冻存采用程序性降温的方式，降温速率为0.5-2℃/min之间，优选地为1℃/min。

程序性降温仪控温速率更精确，原理为通过微电脑程序调节液氮泵入速率降温；降温盒内容物为异丙醇，置于-80℃以下的冰箱后该物质降温速率约为1℃/min左右。其实可以根据实际需要进行选择，如果要求精确科学研究，可采用程序性降温，如果为一般的科学研究可采用程序性降温盒，无论是程序性降温仪还是降温盒，都是市售的商品，降温盒为实验室常用物品。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明的无血清纳米材料冻存剂，不含有任何血清成分，避免了冻存液会被污染的潜在弊端的存在，成分也更加稳定，并同时复配了氧化石墨烯来调整溶液的性状，使其更利于细胞的保存，冻存效果也更为优异，因此值得广泛推广进行应用；

(2)本发明上述冻存剂的制备方法，本身操作简便，前后步骤衔接紧密，操作条件温和，无三废产生，整个操作过程绿色环保；

(3)本发明上述冻存剂的使用方法操作简单，对环境要求不高，适于更为广泛的进行应用。

(4)本发明还提供了包含上述冻存剂的冻存液，该冻存液中还包含了用于混悬细胞的细胞混悬剂，这样细胞可以形成均一的分散液，更利于冻存操作的顺利进行；

(5)本发明的冻存方法可以明显提高冻存后细胞复苏率，并减少不同批次细胞冻存复苏率不稳定、以及避免由血清中的支原体，病毒，朊病毒及其他病毒颗粒引发的污染。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为采用本发明实施例1的冻存方法冻存后的细胞复苏率以及比较例1的冻存方法冻存后的细胞复苏率的比较。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

1、主要成分：细胞混悬剂及细胞冻存剂。

细胞混悬剂由无血清培养基100％构成。

细胞冻存剂由体积百分比为10％的dmso、以及90％的血清替代物构成，添加5ug/ml的氧化石墨烯水溶液(水为溶剂，粒径为200nm，浓度为1ug/ml)

血清替代物的型号(gibcoknockout^tm血清替代物10828-028)。

2、制备方法：

无菌条件下取血清替代物置于离心管，加入dmso混合均匀，体积比为血清替代物：dmso＝9：1。取出5μl混合物后，加入5ug/ml的氧化石墨烯水溶液，混合均匀，4℃保存。

3、使用方法：

1)细胞超净台无菌环境，1.5mlep管内加入细胞混悬剂均匀混悬细胞，细胞终浓度为1×10⁶个/ml，混悬液体积为200μl。细胞冻存剂冰水混合物中预冷，逐滴加入细胞冻存剂800μl，细胞混悬剂与细胞冻存剂的体积比控制在1:4。

2)开启程序性降温，降温速率为1℃/min，最后降温至-80℃以下进行冻存。

实施例2

1、主要成分：细胞混悬剂及细胞冻存剂。

细胞混悬剂由无血清培养基100％构成。

细胞冻存剂由体积百分比为5％的dmso、以及95％的血清替代物构成，添加1ug/ml的氧化石墨烯水溶液(水为溶剂，粒径为20nm，浓度为5ug/ml)

血清替代物的型号(gibcoknockout^tm血清替代物10828-028)。

2、制备方法：

无菌条件下取血清替代物置于离心管，加入dmso混合均匀，体积比为血清替代物：dmso＝15：1。取出5μl混合物后，加入1ug/ml的氧化石墨烯水溶液，混合均匀，4℃保存。

3、使用方法：

1)细胞超净台无菌环境，1.5mlep管内加入细胞混悬剂均匀混悬细胞，细胞终浓度为6×10⁶个/ml，混悬液体积为200μl。细胞冻存剂冰水混合物中预冷，逐滴加入细胞冻存剂1000μl，细胞混悬剂与细胞冻存剂的体积比控制在1:5。

2)开启程序性降温，降温速率为2℃/min，最后降温至-85℃以下进行冻存。

实施例3

1、主要成分：细胞混悬剂及细胞冻存剂。

细胞混悬剂由无血清培养基100％构成。

细胞冻存剂由体积百分比为9％的dmso、以及91％的血清替代物构成，添加2ug/ml的氧化石墨烯水溶液(水为溶剂，粒径为100nm，浓度为3ug/ml)

血清替代物的型号(gibcoknockout^tm血清替代物10828-028)。

2、制备方法：

无菌条件下取血清替代物置于离心管，加入dmso混合均匀，体积比为血清替代物：dmso＝1：10。取出5μl混合物后，加入2ug/ml的氧化石墨烯水溶液，混合均匀，4℃保存。

3、使用方法：

1)细胞超净台无菌环境，1.5mlep管内加入细胞混悬剂均匀混悬细胞，细胞终浓度为5×10⁶个/ml，混悬液体积为200μl。细胞冻存剂冰水混合物中预冷，逐滴加入细胞冻存剂800μl，细胞混悬剂与细胞冻存剂的体积比控制在1:4。

2)开启程序性降温，降温速率为1℃/min，最后降温至-80℃以下进行冻存。

实施例4

1、主要成分：细胞混悬剂及细胞冻存剂。

细胞混悬剂由无血清培养基100％构成。

细胞冻存剂由体积百分比为10％的dmso、以及90％的血清替代物构成，添加3ug/ml的氧化石墨烯水溶液(水为溶剂，粒径为150nm，浓度为1.5ug/ml)

血清替代物的型号(gibcoknockout^tm血清替代物10828-028)。

2、制备方法：

无菌条件下取血清替代物置于离心管，加入dmso混合均匀，体积比为血清替代物：dmso＝1：9。取出5μl混合物后，加入3ug/ml的氧化石墨烯水溶液，混合均匀，4℃保存。

3、使用方法：

1)细胞超净台无菌环境，1.5mlep管内加入细胞混悬剂均匀混悬细胞，细胞终浓度为5.5×10⁶个/ml，混悬液体积为200μl。细胞冻存剂冰水混合物中预冷，逐滴加入细胞冻存剂800μl，细胞混悬剂与细胞冻存剂的体积比控制在1:4。

2)开启程序性降温，降温速率为1.5℃/min，最后降温至-90℃以下进行冻存。

比较例1

1、主要成分：细胞混悬剂及细胞冻存剂。

细胞混悬剂由无血清培养基100％构成。

细胞冻存剂由体积百分比为10％的dmso、以及体积百分比为90％的胎牛血清(fbs)。

2、使用方法：

1)细胞超净台无菌环境，1.5mlep管内加入细胞混悬剂均匀混悬细胞，细胞终浓度为5×10⁶个/ml，混悬液体积为200μl。细胞冻存剂冰水混合物中预冷，逐滴加入细胞冻存剂800μl，细胞混悬剂与细胞冻存剂的体积比控制在1:4。

2)开启程序性降温，降温速率为1℃/min，最后降温至-80℃以下进行冻存。

将比较例1冻存后细胞的复苏率与实施例1冻存后细胞的复苏率进行对比，具体结果如附图1所示，可见采用本发明的冻存方法能够显著提高细胞的复苏率。

本发明的冻存方法不仅可以明显提高冻存后细胞复苏率，同时还可减少不同批次细胞冻存复苏率不稳定、以及避免由血清中的支原体，病毒，朊病毒及其他病毒颗粒引发的污染。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。