用于组织保存的方法和组合物与流程

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年8月28日提交的美国临时专利申请no.62/550,945的优先权权益，其全部内容通过引用纳入本文。

本文描述的发明涉及组织，特别地脑组织保存的方法和组合物(composition)。

背景技术：

固定和保存组织以维持结构的能力对于长期研究中维持临床和科学组织样本很重要。包括来自人类和非人类(如啮齿动物)来源的全脑库(wholebrainbanking)的神经组织，对于研究许多脑疾病如阿尔茨海默氏病(alzheimer’disease)特别重要。参见，例如samarasekera等，brainbankingforneurologicaldisorders，lancetneurology，第12卷，第11期，第1096页-第1105页(2013)。

不幸地，自1960年代以来，脑库技术没有很大变化。人脑通常在持续16-36小时的长时间缺血性延迟后，通常通过浸泡在福尔马林中保存。不幸地，缺血性延迟(血流停滞)、福尔马林固定以及基于缓慢扩散的固定剂渗透的该组合甚至在样本被分析前导致大量的超微结构损坏和蛋白质和/或rna的损失。

保存脑的其他方法包括用醛灌注脑并且在相对温暖的温度(如约4℃)储存固定的脑。然而，由于固定的脑保持化学活性并且能够经历化学和形态学降解，因此该技术不保证长期储存脑的超微结构的静态保存。在零下温度固定的脑的储存用作抑制化学降解，但是冰的形成会导致脑的超微结构显著脱水和机械损坏。

最近开发的被称为醛稳定化冷冻保存(asc)的用于动物脑的保存的技术，有望大大提高保存脑的保存质量和储存时间。参见mcintyre&fahy，aldehyde-stabilizedcryopreservation(醛稳定化冷冻保存)，cryobiology，第71卷，第448页-第458页(2015)。asc通过灌注递送戊二醛，使得能够快速固定所有的脑结构。然后引入冷冻保护剂，使得能够在非常低的温度长期储存。asc方法仍然有许多缺陷，包括结构质量、储存温度和质量控制。例如，用固定液灌注组织可导致肌肉或组织收缩或水肿，其限制液体灌注到毛细血管床中。另外，使用asc方法保存可导致细胞外空间的损失、锚定的神经递质囊泡的损失、髓磷脂的释放(unraveling)、细胞骨架的重组和整体组织皱缩。

本文所涉及的所有出版物、专利和专利申请的公开内容均通过引用方式全部纳入本文。

技术实现要素：

本文描述了保存组织(如脑)的方法以及分析保存的组织的方法。本文还描述了可以用于保存组织的洗涤液(washfluid)、固定液和冷冻保护液。

在一个方面中，保存受试者组织的方法包括：通过用包括水性液体(如盐水(saline)或缓冲盐水)的洗涤液灌注组织来洗涤组织；通过用包括醛的固定液灌注组织来固定组织；以及通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注组织来冷冻保护组织；其中洗涤液、固定液或冷冻保护液包括染料或造影剂。

在另一个方面中，保存受试者组织的方法包括：通过用包括水性液体(如盐水或缓冲盐水)的洗涤液灌注组织来洗涤组织；通过用包括醛的固定液灌注组织来固定组织；通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注组织来冷冻保护组织，冷冻保护液具有约-80℃或更高的玻璃化温度。

在另一个方面中，保存受试者组织的方法包括：通过用包括(1)水性液体(如盐水或缓冲盐水)和(2)离子通道封阻剂、钙螯合剂、血栓溶解剂、抗血小板药、呼吸毒药或突触毒药中的任何一种或多种的洗涤液灌注组织来洗涤组织；通过用包括醛的固定液灌注组织来固定组织；以及通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注组织来冷冻保护组织。

在另一个方面中，保存受试者组织的方法包括：通过用包括水性液体(如盐水或缓冲盐水)的洗涤液灌注组织来洗涤组织；通过用包括醛的固定液灌注组织来固定组织；以及通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注组织来冷冻保存组织；其中在组织中缺血发作后开始洗涤。

在上述的方法的一些实施方式中，洗涤液、固定液或冷冻保护液包括染料或造影剂。

在上述的方法的一些实施方式中，洗涤液、固定液或冷冻保护液包括不透射线染料。

在上述的方法的一些实施方式中，方法进一步通过使在组织中洗涤液、固定液或冷冻保护液的分布成像进行监控。

在另一个方面中，保存受试者组织的方法包括通过用包括水性液体(如盐水或缓冲盐水)的洗涤液灌注组织来洗涤组织；通过用包括醛的固定液灌注组织来固定组织；通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注组织来冷冻保护组织；以及通过使在组织中洗涤液、固定液或冷冻保护液的分布成像进行监控。

在上述的方法的一些实施方式中，通过计算机断层扫描(ct)、微计算机断层扫描(microct)、x-射线或磁共振成像(mri)进行监控。

在上述的方法的一些实施方式中，根据灌注方案进行用洗涤液、固定液或冷冻保护液灌注组织，其中灌注方案基于监控的洗涤液、固定液或冷冻保护液的分布进行改进。

在上述的方法的一些实施方式中，方法进一步包括使组织玻璃化。在一些实施方式中，组织被玻璃化至约-100℃或更冷的温度。在一些实施方式中，方法包括储存玻璃化的组织约72小时或更长。在一些实施方式中，方法包括解冻玻璃化的组织。

在上述的方法的一些实施方式中，方法包括使保存的组织的至少一部分成像。

在上述的方法的一些实施方式中，方法包括通过显微解剖学分析表征保存的组织的至少一部分。

在上述的方法的一些实施方式中，使用电子显微镜、扩展显微镜(expansionmicroscopy)或荧光原位杂交(fish)扩展显微镜使保存的组织的至少一部分成像。

在本文提供的一个方面中，分析来自受试者的保存的组织的方法包括使保存的组织成像或对保存的组织进行显微解剖学分析，所述组织已通过以下被保存：通过用包括水性液体(如盐水或缓冲盐水)的洗涤液灌注组织来洗涤组织；通过用包括醛的固定液灌注组织来固定组织；通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注组织来冷冻保护组织；以及监控在组织的灌注期间洗涤液、固定液或冷冻保护液的分布。

在本文提供的另一个方面中，分析来自受试者的保存的组织的方法包括使保存的组织成像或对保存的组织进行显微解剖学分析，所述组织已经通过以下被保存：通过用包括水性液体(如盐水或缓冲盐水)的洗涤液灌注组织来洗涤组织；通过用包括醛的固定液灌注组织来固定组织；以及通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注组织来冷冻保护组织，冷冻保护液具有约-80℃或更高的玻璃化温度。

在本文提供的另一个方面中，分析来自受试者的保存的组织的方法包括使保存的组织成像或对保存的组织进行显微解剖学分析，所述组织已经通过以下被保存：通过用包括水性液体(如盐水或缓冲盐水)、离子通道封阻剂、钙螯合剂、血栓溶解剂、呼吸毒药、突触毒药和血管舒张药的洗涤液灌注组织来洗涤组织；通过用包括醛的固定液灌注组织来固定组织；以及通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注组织来冷冻保护组织。

在上述的方法的一些实施方式中，在组织的灌注期间监控组织中洗涤液、固定液或冷冻保护液的分布。在一些实施方式中，使用ct、microct、x-射线或mri监控组织的灌注。

在上述的方法的一些实施方式中，方法包括解冻保存的组织。

在上述的方法的一些实施方式中，使保存的组织成像或对保存的组织进行显微解剖学分析包括使用电子显微镜、聚焦离子束显微镜、扩展显微镜或荧光原位杂交(fish)显微镜使保存的组织成像。

在上述分析来自受试者的保存的组织的方法的一些实施方式中，根据灌注方案进行用洗涤液、固定液或冷冻保护液灌注组织，其中灌注方案基于在组织的灌注期间洗涤液、固定液或冷冻保护液的分布进行改进。

在上述的方法的一些实施方式中，冷冻保护液相对于固定液以梯度方式灌注到组织中。

在上述的方法的一些实施方式中，洗涤液、固定液或冷冻保护液包括离子通道封阻剂或离子受体封阻剂。

在上述的方法的一些实施方式中，固定液或冷冻保护液包括钙螯合剂。

在上述的方法的一些实施方式中，洗涤液、固定液或冷冻保护液包括呼吸毒药。

在上述的方法的一些实施方式中，洗涤液、固定液或冷冻保护液包括突触毒药。

在上述的方法的一些实施方式中，洗涤液、固定液或冷冻保护液包括血管舒张药。

在上述的方法的一些实施方式中，洗涤液、固定液或冷冻保护液包括肿胀剂(oncoticagent)。

在上述的方法的一些实施方式中，洗涤液或固定液包括离子表面活性剂。

在上述的方法的一些实施方式中，洗涤液包括麻醉剂。

在上述的方法的一些实施方式中，洗涤液包括血栓溶解剂。

在上述的方法的一些实施方式中，洗涤液包括抗凝血剂。

在上述的方法的一些实施方式中，洗涤液包括抗血小板剂。

在上述的方法的一些实施方式中，固定液包括甲醛或戊二醛。

在上述的方法的一些实施方式中，冷冻保护液包括醛。

在上述的方法的一些实施方式中，冷冻保护液包括乙二醇、二甲亚砜、甘油或聚乙二醇。

在上述的方法的一些实施方式中，冷冻保护液具有约-195℃至约+50℃的玻璃化温度。

在上述的方法的一些实施方式中，在受试者死亡的8小时内保存组织。

在上述的方法的一些实施方式中，受试者是人类。在一些实施方式中，受试者是非人类动物。在一些实施方式中，非人类动物是啮齿动物。

在上述的方法的一些实施方式中，组织是器官或其部分。在一些实施方式中，组织是脑或其部分。在一些实施方式中，组织的体积是约100cm³或更大。

本文进一步提供了根据上述方法中的任何一种形成的保存的组织。

本文进一步描述了用于通过灌注固定组织的固定液，其包括(1)醛和(2)染料或造影剂。在一些实施方式中，醛是甲醛或戊二醛。

本文进一步描述了用于冷冻保护组织的冷冻保护液，其包括(1)玻璃化剂和(2)染料或造影剂。在一些实施方式中，冷冻保护液包括醛。在一些实施方式中，冷冻保护液包括乙二醇、甘油、二甲亚砜、聚乙二醇。在一些实施方式中，冷冻保护液具有约-195℃至约+50℃的玻璃化温度。

附图说明

图1示出用洗涤液灌注受试者的脑的示例性设置(setup)。洗涤液通过受试者的颈动脉灌注并且洗涤液从颈静脉排出。

图2a-图2f示出保存受试者的脑的示例性方法。在图2a，将洗涤液灌注到受试者的脑中。在图2b，将第一阶段固定液(fix*)灌注到受试者中。在图2c，设置装有第二阶段固定液(fix)。在图2d，将第二阶段固定液相对于第一阶段固定液(fix*)以梯度方式灌注到受试者的脑中。在图2e，在没有第一阶段固定液的情况下，将第二阶段固定液灌注到受试者的脑中。在图2f，将冷冻保护液(cpa)相对于第二阶段固定液以梯度方式灌注到受试者的脑中。

图3a-图3l示出保存的脑组织的电子显微镜图像。图3a示出来自皮层样本的倒置反差图像(invertedcontrastimage)，其示出核质(a)和髓磷脂(b，c)的良好的保存和高的保留。图3b是皮层样本的电子显微镜图像，其示出血管(a)、多个突起(process)(即神经元的多个分支)(b)和保存良好的基质(c)。一些损坏(d)还是可见的。图3c示出具有保存良好的突触(a)、有髓突起(myelinatedprocess)(b)、无髓突起(unmylenatedprocess)(c)和一些损坏区域(d，e)的皮层样本的另外的电子显微镜图像。图3d是示出多个锥体细胞(a)和多个有髓突起(b)的电子显微镜图像。图3e示出使用扫描电子显微镜获得的醋酸铀染色的皮层样本内的多个突触(a、b、c)。图3f是扁桃腺的电子显微镜图像，其示出多个突触(a)和细小突起以及几个展开的线粒体(b)。图3g是铣削以揭示脑组织的用20微米的树脂层涂覆的皮层样本的聚焦离子束铣削图像。图3h是铣削以揭示脑组织的用树脂层涂覆的胼胝体样本的聚焦离子束铣削图像。图3i是示出髓磷脂和部分破裂的切迹(a、b、c)的醋酸铀染色的皮层的电子显微镜图像。图3j是示出良好保存的有髓突起(a，b)的海马体样本的聚焦离子束扫描电子显微镜(fib-sem)图像。图3k示出来自树脂块内的皮层样本的图像。尽管脑组织的保存比先前的研究更好，但是观察到一些对脑超微结构的损坏。例如，在图3j中，观察到细胞内成分的一些损失(c)。图3l是示出几个平行突起中破裂的髓磷脂(a)以及正常的髓磷脂(b)的醋酸铀染色的皮层样本的电子显微镜图像。

具体实施方式

本文描述了保存来自受试者的组织的方法。在某些实施方式中，组织是诸如脑的完整的器官。组织通过用洗涤液灌注组织洗涤、通过用固定液灌注组织固定和通过用冷冻保护液灌注组织冷冻保护。洗涤液从组织内的血管冲洗血液和/或凝结剂。在一些实施方式中，洗涤液包括可以例如通过扩张血管或溶解血块来促进灌注的成分。在一些实施方式中，洗涤液包括可以最小化固定液的不期望作用的成分。固定液通过在组织内形成交联固定组织，该交联帮助保存组织并限制腐烂(decay)(除了玻璃化组织以外)。冷冻保护液向组织提供玻璃化剂，其在冷却组织用于储存时抑制冰晶的形成。一旦组织已经用洗涤液、固定液和冷冻保护液灌注，则组织可以在低温玻璃化并储存。然后，玻璃化的组织可以被解冻用于分析，例如通过使组织成像。本文还描述了分析保存的组织的方法，以及洗涤液、固定液和冷冻保护液。

脑或其部分的小心保存可以允许组织的更详细的显微解剖学分析，并更好地理解神经连接。这可以帮助脑电图(brainmapping)和脑内神经连接的连接体、综合图(comprehesivemap)的开发。例如，本文所述的方法允许脑组织内的基质纳米结构、髓磷脂纳米结构、椎体细胞纳米结构或神经突触的一种或多种的保存。尽管最近的研究已导致维持保存的组织的结构完整性的显著提高，但是需要持续的进步来更好地解决组织的显微解剖。

诸如脑的许多组织和器官包括复杂的血管网络。灌注到组织中的如洗涤液、固定液和冷冻保护液的液体通过血管流动以到达组织的各个部分。液体的不完全灌注可以导致组织的不良保存。在较老的和/或不健康的组织样本中，脉管系统中病灶的障碍在灌注期间可以大大延迟或甚至阻止组织的充分的洗涤、固定和/或冷冻保护。先前的方法依靠固定的方案来灌注样本，并且假设液体被均匀地递送至组织。然而这些先前的实践用于实验室演示，这种水平的质量控制对于整个组织或整个器官样本的稳固的、可重复的保存是不可接受的。在灌注期间的动态监控可以允许如损坏血管的手术修补的矫正措施或延长液体灌注时间，以确保避免大的渗透梯度，并确保将足够量的液体输送到所有的组织区域。通过在灌注到本文所述的组织中的洗涤液、固定液、冷冻保护液或任何其他液体中包括染料(如不透射线染料)或造影剂，灌注可以通过使组织中液体的分布成像来监控。示例性的造影剂或不透射线染料包括但不限于碘化盐(如碘化钾或碘化钠)、钡盐(例如氯化钡)、与重金属(如铅或金)络合的螯合物或钆。在一些实施方式中，通过ct、microct、x-射线或mri监控分布。在一些实施方式中，方法包括对组织进行矫正手术以疏通或绕过堵塞的血管。足够的监控确保在下一个保存步骤发生之前，将组织用液体充分地灌注。

此外，在洗涤液、固定液和/或冷冻保护液中包括某些化合物可以帮助更好地保存组织，如本文进一步详细讨论的。例如，在一些实施方式中，洗涤液、固定液和/或冷冻保护液包括离子通道封阻剂、离子受体封阻剂、钙螯合剂、呼吸毒药、突触毒药、血管舒张药、肿胀剂、麻醉剂、血栓溶解剂(也称为“血栓疏通剂(clotbustingagent)”)、抗血小板药、离子表面活性剂或抗凝血剂中的一种或多种。这些化合物例如通过在保存过程期间增加灌注效率或稳定组织微观结构增强了组织的保存。

如本文使用的，单数形式“一个/一种”(“a”)、“一个/一种”(“an”)和“该”(“the”)包括复数参考，除非上下文另有明确规定。

本文中提及“约”值或参数包括(和描述)针对该值或参数本身的变化。例如，提及“约x”的描述包括“x”的描述。

“抗凝血剂”是直接地或间接地抑制凝血因子活性并抑制血液凝结的任何一种或多种化合物。

“抗血小板剂”是减少血小板聚集的任何一种或多种化合物。

术语受试者的“死亡”指通过呼吸活动、心跳和脑活动的完全丧失所定义的受试者的临床死亡。

术语“离子通道封阻剂”和“离子受体封阻剂”同义使用以指通过离子通道或离子受体的方式抑制一种或多种离子(例如钠、钾、钙等)跨细胞膜运输的任何一种或多种化合物。

术语“缺血”指其中供应给组织的氧气不足以维持组织的功能性的组织状态。

术语“显微解剖学分析”指在微观或亚微观的分辨率水平上生物组织的物理结构的评估。

如本文使用的术语“纳米结构”指最小尺寸小于100纳米的生物系统的物理结构。

“肿胀剂”是增加血管内液体的渗透压的任何一种或多种化合物。

术语“灌注”(“perfusing”)或“灌注”(“perfusion”)指通过在压力下向组织施加液体穿过通向组织的一个或多个血管或者穿过组织内的一个或多个血管来将液体递送入组织。

“呼吸毒药”是抑制生物化学呼吸的任何一种或多种化合物，且包括电子传输抑制剂、解偶联剂和质子通道封阻剂。

“突触毒药”是抑制锚定的神经递质囊泡从神经突触的神经元释放的任何一种或多种化合物。

“血栓溶解剂”或“血栓疏通剂”是将血纤维蛋白溶酶原转化为血纤维蛋白溶酶以分解纤维蛋白原和纤维蛋白，并且增强血管中血凝块(血栓)的解离的任何一种或多种丝氨酸蛋白酶。

“血管舒张药”是扩张血管的的任何一种或多种化合物。

术语“玻璃化剂”、“冷冻保护剂”(“cryoprotectionagent”)和“冷冻保护剂”(“cryoprotectant”)可互换地使用，且指通过在冷却期间限制冰晶的形成保护生物样本免受冰冻损坏的任何一种或多种化合物。

“玻璃化温度”或“玻璃转换温度”指这样的温度，低于此温度时材料充当无定形固体，并且高于此温度时材料充当粘性液体或橡胶材料。玻璃化温度是根据astme1356-08(2014)，采用差示扫描量热法分配玻璃转换温度的标准测试方法(standardtestmethodforassignmentoftheglasstransitiontemperaturesbydifferentialscanningcalorimetry)的动态力学分析确定的。

应当理解，本文所述的发明的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“基本上由方面和变化组成”。

在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值，以及在该陈述的范围内的任何其他陈述的值或中间值，都涵盖在本公开内容的范围内。在陈述的范围包括上限或下限的情况下，排除任一那些包括的限值的范围也包括在本公开内容中。

应当理解，本文所述的各种实施方式的一个、一些或所有性能可以被组合以形成本发明的其他实施方式。本文使用的章节标题仅出于组织的目的，并且不应解释为限制所描述的主题。

通过本文所述的方法保存或分析的组织包括包含全部器官或其部分的器官。示例性的器官包括但不限于脑、膀胱、心脏、胆囊、肠(如大肠或小肠)、肾脏、肝脏、肺、卵巢、胰腺、前列腺、脾脏、胃、胸腺或子宫。在一些实施方式中，组织是神经组织。在一些实施方式中，脑的部分包括下述、是下述或是下述的部分：大脑、大脑皮层、胼胝体、额叶、顶叶、枕叶、丘脑、上丘脑、松果体、下丘脑、脑垂体、底丘脑、海马体、屏状核、小脑、颞叶、脑干、脑桥、中脑或延髓。在一些实施方式中，保存整个动物。

本文所述的方法允许包括脑的大型的、完整的组织的保存。大型器官包含脉管系统的变化，并且当使用预定义的灌注方案时并不总是均匀地灌注。包括动态监控组织中液体的灌注的本文所述的方法，允许高质量的保存较大的组织。在一些实施方式中，保存的组织具有约100cm³或更大(如约120cm³或更大、约150cm³或更大、约200cm³或更大、约400cm³或更大、约600cm³或更大、约800cm³或更大、约1000cm³或更大或约1200cm³或更大)的体积。

组织来自如脊椎动物的受试者。在一些实施方式中，受试者是如人类或非人类动物的哺乳动物。示例性的非人类动物包括但不限于啮齿动物(如小鼠、大鼠、豚鼠或仓鼠)、非人类灵长类动物(如猴子、猿、黑猩猩、狒狒或大猩猩)、鸡、牛科动物、猪、猫、狗或兔子。在一些实施方式中，在保存之前将组织从动物中移除。在一些实施方式中，组织被保存在动物内适当的位置(即原位)。在一些实施方式中，在组织保存之前受试者是死亡的。在一些实施方式中，在保存过程期间受试者被安乐死。优选地，如果在保存过程期间受试者被安乐死，则在保存过程之前麻醉受试者。在一些实施方式中，方法包括在组织保存之前或之后从受试者中移除组织。

将如洗涤液、固定液或冷冻保护液的液体灌注到组织中中。在一些实施方式中，液体通过循环系统和/或淋巴系统灌注到组织中中。在一些实施方式中，一种或多种液体通过通向组织或器官的动脉灌注到组织中中，并且液体从来自组织或器官的静脉排出。例如，在一些实施方式中，脑的灌注包括将液体灌注入颈动脉(如颈总动脉、颈内动脉或颈外动脉)中并且将液体从颈静脉(如颈内静脉或颈外静脉)排出。

组织的灌注包括将液体递送入组织并且从组织排出液体。这允许液体置换。例如在洗涤步骤期间将洗涤液递送到组织中并且将血液从组织排出。在组织的固定步骤期间，将固定液递送入组织中并且将洗涤液从组织排出。在冷冻保护步骤期间，将冷冻保护液递送入组织中并且将固定液从组织排出。将洗涤步骤或固定步骤移至过程中的下一个步骤(即固定步骤或冷冻保护步骤)可以不连续地(discretely)发生(即立即从将洗涤液灌注到组织中转换为将固定液灌注到组织中，或从将固定液灌注到组织中转换为将冷冻保护液灌注到组织中)或以梯度形式发生(即逐渐增加递送到组织中的固定液或冷冻保护液的比例)。排出的液体可以被处置或再循环通过组织。例如，在一些实施方式中，在灌注步骤期间递送入组织的固定液从组织排出并且再循环至组织中。

洗涤液和组织的洗涤

通过用洗涤液灌注组织来洗涤组织。洗涤液是水性溶液，其可以包括一种或多种化合物，如用于扩张血管、溶解血块或制备用于固定的组织的化合物。洗涤液例如通过动脉被泵送入组织，并且例如通过静脉从组织排出。使用洗涤液洗涤组织从组织清除红细胞。在固定步骤期间残留在组织中的红细胞可导致毛细血管床的增加的刚性和堵塞。可以将第一套管插入动脉以递送洗涤液，并且可以将第二套管插入静脉或可以将静脉切开以排出液体。从组织排出的液体可包括血液和洗涤液的混合物，或一旦血液已被排出，则包括洗涤液。在一些实施方式中，从组织排出的液体在排出后被处置。

洗涤液可包括适合于洗涤组织的水性液体以除去血液。在一些实施方式中，洗涤液包括如盐水溶液的基于晶体的溶液。在一些实施方式中，洗涤液是缓冲的。在一些实施方式中，水性溶液是如缓冲盐水或等渗盐水的盐水。示例性的缓冲盐水溶液包括磷酸盐缓冲盐水或krebs-ringer’s溶液。在一些实施方式中，洗涤液与来自受试者的血液的渗透性(osmolarity)是等渗的或近似(approximately)等渗的。洗涤液可包括如氯化钠、氯化钾、氯化镁或氯化钙的盐。在一些实施方式中，洗涤液包括一种或多种如磷酸盐缓冲液(如磷酸钠或磷酸钾)、碳酸钠或hepes的缓冲液。在一些实施方式中，洗涤液包括一种或多种添加剂以进一步调整组织适于固定液。示例性的添加剂包括但不限于离子通道封阻剂、离子受体封阻剂、钙螯合剂、呼吸毒药、突触毒药、血管舒张药、肿胀剂、麻醉剂、血栓溶解剂、抗血小板剂、离子表面活性剂和/或抗凝血剂。

在一些实施方式中，洗涤液的ph在约7和约8之间(如约7.2至约7.8，或约7.4至约7.6)。

在组织保存的固定步骤期间，离子通道可打开或以其他方式被破坏，从而导致大流量的离子跨过细胞膜。该大流量的离子可导致结构变化，如组织中细胞外空间的丧失或线粒体的空泡形成。为了调整准备用于固定液的组织，在一些实施方式中，洗涤液包括离子通道封阻剂或离子受体封阻剂。示例性的离子通道封阻剂或离子受体封阻剂包括但不限于芋螺毒素(如α-芋螺毒素、γ-芋螺毒素、κ-芋螺毒素、ω-芋螺毒素或μ-芋螺毒素，其起到阻断乙酰胆碱通道、钠通道、钾通道和钙通道的作用)、河豚毒素(其起到阻断钠通道的作用)、芋螺睡眠肽(conantokin)(如芋螺睡眠肽-g、芋螺睡眠肽-t、芋螺睡眠肽-r、芋螺睡眠肽-p或芋螺睡眠肽-e，其抑制n-甲基-d-天冬氨酸受体(nmdar))、箭毒(其阻断乙酰胆碱通道)或钡(其阻断钾通道)。在一些实施方式中，在洗涤液中包括约50ng/l或更大(如约100ng/l或更大、约250ng/l或更大、约500ng/l或更大、约1μg/l或更大、约2.5μg/l或更大、约5μg/l或更大、约10μg/l或更大、约25μg/l或更大、约50μg/l或更大、约100μg/l或更大、约250μg/l或更大、约500μg/l或更大、约1mg/l或更大、约2.5mg/l或更大、约5mg/l或更大、约10mg/l或更大、约25mg/l或更大、约50mg/l或更大、约100mg/l或更大或约250mg/l或更大)浓度的离子通道封阻剂或离子受体封阻剂。在一些实施方式中，在洗涤液中包括约500mg/l或更小(如约250mg/l或更小、约100mg/l或更小、约50mg/l或更小、约25mg/l或更小、约10mg/l或更小、约5mg/l或更小、约2.5mg/l或更小、约1mg/l或更小、约500μg/l或更小、约250μg/l或更小、约100μg/l或更小、约50μg/l或更小、约25μg/l或更小、约10μg/l或更小、约5μg/l或更小、约2.5μg/l或更小、约1μg/l或更小、约500ng/l或更小、约250ng/l或更小或约100ng/l或更小)浓度的离子通道封阻剂或离子受体封阻剂。在一些实施方式中，洗涤液包括离子通道封阻剂和/或离子受体封阻剂的组合。仅作为示例，在一些实施方式中，洗涤液包括约50ng/l至约5μg/l浓度的芋螺毒素(如κ-芋螺毒素)、约500ng/l至约25mg/l浓度的河豚毒素、约250ng/l至约10mg/l浓度的芋螺睡眠肽-g和约5mg/l至约50mg/l浓度的箭毒。

在没有调整组织的情况下，将固定液引入组织可引起肌肉收缩(也称为“固定颤动”)，其可导致灌注的中断(例如，通过关闭毛细管或排出灌注套管)或器官的扭曲。参见例如，gage等，wholeanimalperfusionfixationforrodents，j.visualizedexperiments，第65卷，e3564(2012)。为了抑制固定颤动，钙螯合剂可包括在洗涤液中。钙螯合剂还可以用于防止神经元和随钙涌入而自我破坏的其他细胞的缺血级联反应(ischemiccascade)的早期阶段。此外，钙螯合剂可干扰血液凝结，其否则会导致血液冲洗不完全或整个组织灌注不良。示例性的钙螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸(edta)、依他酸(egtazicacid)(egta)、1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-n,n,n′,n′-四乙酸(bapta)或柠檬酸盐。在一些实施方式中，在洗涤液中中包括约0.1g/l或更高(如约0.25g/l或更高、约0.5g/l或更高、约1g/l或更高、约2g/l或更高、约3g/l或更高或约4g/l或更高)浓度的钙螯合剂。在一些实施方式中，在洗涤液中包括约5g/l或更小(如约4g/l或更小、约3g/l或更小、约2g/l或更小、约1g/l或更小、约0.5g/l或更小或约0.25g/l或更小)浓度的钙螯合剂。

许多自溶过程需要能量以发挥功能，因此通过使用呼吸毒药来防止呼吸可以减轻在冲洗期间的自溶衰退(autolyticdeca)或线粒体肿胀。在一些实施方式中，洗涤液包括呼吸毒药。示例性的呼吸毒药包括叠氮化物(如叠氮化钠)或氰化物(如氰化钠)。叠氮化钠和氰化钠抑制细胞色素c氧化酶并防止细胞呼吸。除了最小化自溶变化外，呼吸毒药还防止线粒体空泡形成，其是当线粒体暴露于可以存在于固定液中的某些醛如戊二醛时的常见情况。在一些实施方式中，洗涤液中呼吸毒药的浓度是约0.1g/l或更高(如约0.2g/l或更高、约0.5g/l或更高、约1g/l或更高或约1.5g/l或更高)。在一些实施方式中，洗涤液中呼吸毒药的浓度是约2g/l或更低(如约1.5g/l或更低、约1g/l或更低、约0.5g/l或更低或约0.2g/l或更低)。

将组织暴露于存在于固定液中的醛会导致神经元中锚定的囊泡丢失。锚定的囊泡包含神经递质并且定位成非常接近神经突触。锚定的囊泡提供突触的立即可用库存(stock)的神经递质以影响突触传导。在固定步骤期间，如果组织没有用洗涤液预处理，则这些囊泡可能丢失。在一些实施方式中，在洗涤液中包括突触毒药(如snare抑制剂)。示例性的突触毒药包括肉毒杆菌毒素或破伤风毒素。肉毒杆菌毒素裂解对于锚定的囊泡与乙酰胆碱突触的融合所必需的snare(可溶性nsf附着蛋白受体)蛋白。破伤风毒素使包括在脑组织中的中枢神经系统中的snare蛋白不稳定。在一些实施方式中，在洗涤液中包括肉毒杆菌毒素和破伤风毒素二者。在一些实施方式中，在洗涤液中突触毒药的浓度是约0.1ng/l或更大(如约0.2ng/l或更大、约0.5ng/l或更大、约1ng/l或更大、约2ng/l或更大、约5ng/l或更大、约10ng/l或更大、约25ng/l或更大、约50ng/l或更大、约100ng/l或更大或约150ng/l或更大)。在一些实施方式中，在洗涤液中突触毒药的浓度是约200ng/l或更小(如约150ng/l或更小、约100ng/l或更小、约50ng/l或更小、约25ng/l或更小、约10ng/l或更小、约5ng/l或更小、约2ng/l或更小、约1ng/l或更小、约0.5ng/l或更小或约0.2ng/l或更小)。

为了最小化固定期间组织水肿的风险，在一些实施方式中，在洗涤液中包括肿胀剂。示例性肿胀剂包括聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚乙二醇(peg)和羟乙基淀粉(hes)。在洗涤液中包括的peg通常是高分子量peg，例如其具有约20,000da或更高(如约25,000da或更高，或约30,000da或更高)的分子量。

在一些实施方式中，在洗涤液中包括离子表面活性剂(如十二烷基硫酸钠(sds)或十二烷基苯磺酸钠(sdbs))。离子表面活性剂可用于在冷冻保护过程期间防止组织皱缩。在一些实施方式中，在洗涤液中包括约0.001％w/v或更高(如约0.002％w/v或更高、约0.005％w/v或更高或约0.01％w/v或更高)浓度的离子表面活性剂。在一些实施方式中，在洗涤液中包括约0.05％w/v或更低(如约0.04％w/v或更低、约0.02％w/v或更低或约0.01％w/v或更低)浓度的离子表面活性剂。

为了在组织的洗涤期间限制血液凝结，在一些实施方式中，洗涤液包括抗凝血剂，如华法林(warfarin)、肝素、类肝素、xa因子抑制剂或凝血酶抑制剂。在一些实施方式中，洗涤液包括抗血小板剂，如环氧酶抑制剂(如阿司匹林或三氟柳(triflusal))、二磷酸腺苷(adp)受体抑制剂(如氯吡格雷(clopidogrel)、普拉格雷(prasugrel)、替卡格雷(ticagrelor)、噻氯匹啶(ticlopidine))、磷酸二酯酶抑制剂(如西洛他唑(cilostazol))、蛋白酶激活受体-1(par-1)拮抗剂(如沃拉帕沙(vorapaxar))、糖蛋白iib/iiia抑制剂(如阿昔单抗(abciximab)、依替巴肽(eptifibatide)、欣维宁(tirofiban))、腺苷再摄取抑制剂(如双嘧达莫(dipyridamole))或血栓素抑制剂(thromboxaneinhibitor)。

在一些实施方式中，在受试者死亡后或组织中缺血发作后将洗涤液灌注到组织中。然而，在死亡后不久(即约5分钟)至死亡后约8-12小时开始洗涤组织，由于血液凝结、血管周围死后僵直(rigormortis)和“无复流”效应使灌注复杂。这些情况可导致低的流速和不一致的组织保存。在受试者的死亡后或组织中缺血发作后，为了允许洗涤液更有效和完全的灌注，在一些实施方式中，洗涤液包括一种或多种血管舒张药、一种或多种血栓溶解剂和/或三磷酸腺苷(atp)。示例性的血管舒张药包括亚硝酸钠、硝酸甘油、单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯(isosorbidedinitrate)、托西硝乙胺(itramintosilate)、戊四硝酯(pentaerithrityltetranitrate)、丙帕硝酯(propatylnitrate)、替尼曲明(tenitramine)、三乙硝胺(trolnitrate)或吗多明(molsidomine)。在一些实施方式中，在洗涤液中包括约0.1g/l或更大(如约0.2g/l或更大、约0.5g/l或更大或约0.7g/l或更大)浓度的血管舒张药。在一些实施方式中，在洗涤液中包括约1g/l或更小(如约0.7g/l或更小、约0.5g/l或更小或约0.2g/l或更小)浓度的血管舒张药。在一些实施方式中，在洗涤液中包括约1mm或更高(如约2mm或更高、约5mm或更高、约10mm或更高或约25mm或更高浓度)浓度的atp。在一些实施方式中，在洗涤液中包括约50mm或更小(如约25mm或更小、约10mm或更小、约5mm或更小或约2mm或更小)浓度的atp。示例性的血栓溶解剂包括组织纤溶酶原激活剂(tpa)、链激酶、尿激酶或其他血栓疏通剂。在一些实施方式中，洗涤液包括约0.025mg/l或更高浓度(如约0.05mg/l或更高、约0.1mg/l或更高、约0.2mg/l或更高或约0.5mg/l或更高浓度)浓度的血栓溶解剂。在一些实施方式中，洗涤液包括约1mg/l或更小(如约0.5mg/l或更小、约0.2mg/l或更小、约0.1mg/l或更小或约0.05mg/l或更小)浓度的血栓溶解剂。

在一些实施方式中，受试者和/或组织用血栓溶解剂(如组织纤溶酶原激活剂(tpa)、链激酶、尿激酶或其他血栓疏通剂的一种或多种)预处理。例如，血栓溶解剂可以以比在洗涤液中更高的浓度与预洗涤液(其可包括例如盐水)混合并且施用给受试者。在一些实施方式中，代替灌注预洗涤液，预洗涤液通过注射施用。在一些实施方式中，预洗涤液通过心肺按压(即cpr按压)循环。在一些实施方式中，预洗涤液中血栓溶解剂的浓度是约0.1mg/l或更高(如约0.2mg/l或更高、约0.5mg/l或更高、约1mg/l或更高或约1.5mg/l或更高)。在一些实施方式中，预洗涤液中血栓溶解剂的浓度是约2mg/l或更小(如约1.5mg/l或更小、约1mg/l或更小、约0.5mg/l或更小或约0.2mg/l或更小)。

在一些实施方式中，在灌注洗涤液期间受试者被安乐死。在一些实施方式中，洗涤液包括麻醉剂(如氯胺酮)、苯妥英和/或巴比妥酸盐(如戊巴比妥)。

在一些实施方式中，洗涤液以约60mmhg至约140mmhg(如约60mmhg至约80mmhg、约80mmhg至约100mmhg、约100mmhg至约120mmhg或约120mmhg至约140mmhg)的压力被灌注到组织中。

在一些实施方式中，在被灌注到组织中之前，将洗涤液冷却至室温以下。在一些实施方式中，将洗涤液冷却至约20℃或更低(如约15℃或更低或约10℃或更低)。洗涤液应该保持在冰点(freezing)温度以上使得其可以被灌注到组织中。

在一些实施方式中，在灌注之前将洗涤液过滤。在一些实施方式中，在灌注之前将洗涤液无菌过滤。在一些实施方式中，洗涤液用具有约0.5μm或更小如约0.22μm或更小的平均孔径的过滤器过滤。

在一些实施方式中，在灌注到组织中之前，洗涤液被充氧。例如，在一些实施方式中，在被灌注到组织中之前，将氧气鼓泡(bubblethrough)洗涤溶液约10分钟或更多、约15分钟或更多、约30分钟或更多、约45分钟或更多或约1小时更多。

用洗涤液洗涤组织可以在死亡之前、之后或当时开始。在一些实施方式中，组织的洗涤在受试者死亡之后约1分钟或更长(例如，死亡之后约3分钟或更长、约5分钟或更长、约15分钟或更长、约30分钟或更长、约1小时或更长、约2小时或更长、约3小时或更长、约6小时或更长或约8小时或更长)开始。在一些实施方式中，组织的洗涤在死亡之后约24小时或更短(如死亡之后约16小时或更短、约12小时或更短、约8小时或更短、约6小时或更短、约3小时或更短、约2小时或更短、约1小时或更短、约30分钟或更短或约15分钟或更短)开始。

用洗涤液洗涤组织可以在呼吸活动丧失、心跳丧失或脑活动丧失中的一种或多种之前、之后或当时开始。在一些实施方式中，组织的洗涤在受试者的呼吸活动、心跳丧失或脑活动丧失中的一种或多种丧失之后约1分钟或更长(例如，在呼吸活动、心跳丧失或脑活动丧失中的一种或多种丧失之后约3分钟或更长、约5分钟或更长、约15分钟或更长、约30分钟或更长、约1小时或更长、约2小时或更长、约3小时或更长、约6小时或更长或约8小时或更长)开始。在一些实施方式中，组织的洗涤在呼吸活动、心跳丧失或脑活动丧失中的一种或多种丧失之后约24小时或更短(如在呼吸活动、心跳丧失或脑活动丧失中的一种或多种丧失之后约16小时或更短、约12小时或更短、约8小时或更短、约6小时或更短、约3小时或更短、约2小时或更短、约1小时或更短、约30分钟或更短或约15分钟或更短)开始。

在一些实施方式中，在组织的缺血发作之前、之后或当时洗涤组织。在一些实施方式中，组织的洗涤在组织的缺血发作之后约1分钟或更长(例如，在组织的缺血发作之后约3分钟或更长、约5分钟或更长、约15分钟或更长、约30分钟或更长、约1小时或更长、约2小时或更长、约3小时或更长、约6小时或更长或约8小时或更长)开始。在一些实施方式中，组织的洗涤在组织的缺血发作之后约24小时或更短(如在组织的缺血发作之后约16小时或更短、约12小时或更短、约8小时或更短、约6小时或更短、约3小时或更短、约2小时或更短、约1小时或更短、约30分钟或更短或约15分钟或更短)开始。

图1阐明用洗涤液灌注组织的示例性设置。洗涤液由蠕动泵通过一个或多个动脉(例如颈动脉)泵入组织中，并且液体从静脉(例如颈静脉)排出。将洗涤液保持在容器中，并且泵(如蠕动泵)以所需的压力(例如约80mmhg)将洗涤液泵入组织中。在进入受试者之前，液体经过无菌过滤器和热交换器以灭菌和冷却洗涤液。温度计和压力计也可以包括在设置中，以监控灌注到组织中的洗涤液的温度和压力。

在一些实施方式中，用洗涤液灌注组织被监控分布。在一些实施方式中，洗涤液包括染料(如不透射线染料)或造影剂。示例性的造影剂或不透射线染料包括但不限于碘化盐(如碘化钾或碘化钠)、钡盐(例如氯化钡)、与重金属(如铅或金)络合的螯合物或钆。在一些实施方式中，染料在洗涤液中的浓度是约0.1g/l或更高(如约0.2g/l或更高、约0.5g/l或更高、约1g/l或更高、约2g/l或更高、约5g/l或更高或约10g/l或更高)。在一些实施方式中，染料在洗涤液中的浓度是约20g/l或更低(如约10g/l或更低、约5g/l或更低、约2g/l或更低、约1g/l或更低、约0.5g/l或更低或约0.2g/l或更低)。在一些实施方式中，通过ct、microct、x射线或mri监控分布。

固定液和固定组织

在已洗涤组织后，将固定液灌注到组织中。固定液通过在组织内形成交联而固定组织。交联稳定化组织的精细结构以允许保存的组织的分析。一旦组织通过固定液保存，则来自冷冻保护液对组织的影响被最小化。固定液包括在水性溶液中的如醛的固定剂。示例性的包括在固定液中的醛包括甲醛和戊二醛。

在一些实施方式中，固定液包括缓冲液。示例性的缓冲液包括磷酸盐缓冲液(如磷酸钠或磷酸钾)、碳酸钠或hepes。在一些实施方式中，固定液包括一种或多种如氯化钠、氯化钾、氯化镁或氯化钙的盐。在一些实施方式中，固定液的ph是在约7和约8之间(如约7.2至约7.8，或约7.4至约7.6)。

如戊二醛或甲醛的醛可以包括在固定液中。在一些实施方式中，固定液包括约1％(按重量计)或更多(如约1.5％或更多、约2％或更多、约2.5％或更多或约3％更多)的醛。在一些实施方式中，固定液包括约6％或更少的醛(如约5.5％或更少、约5％或更少、约4.5％或更少、约4％或更少、约3.5％或更少、约3％或更少、约2.5％或更少或约2％或更少的醛)。在一些实施方式中，固定液包括约1％(按重量计)或更多(如约1.5％或更多、约2％或更多、约2.5％或更多或约3％更多)的戊二醛。在一些实施方式中，固定液包括约6％或更少的戊二醛(如约5.5％或更少、约5％或更少、约4.5％或更少、约4％或更少、约3.5％或更少、约3％或更少、约2.5％或更少或约2％或更少的醛)。在一些实施方式中，固定液包括约1％(按重量计)或更多(如约1.5％或更多、约2％或更多、约2.5％或更多或约3％更多)的甲醛。在一些实施方式中，固定液包括约6％或更少的甲醛(如约5.5％或更少、约5％或更少、约4.5％或更少、约4％或更少、约3.5％或更少、约3％或更少、约2.5％或更少或约2％或更少的醛)。

在一些实施方式中，固定液包括离子通道封阻剂或离子受体封阻剂。示例性的离子通道封阻剂或离子受体封阻剂包括但不限于芋螺毒素(如α-芋螺毒素、γ-芋螺毒素、κ-芋螺毒素、ω-芋螺毒素或μ-芋螺毒素，其起到阻断乙酰胆碱通道、钠通道、钾通道和钙通道的作用)、河豚毒素(其起阻断钠通道的作用)、芋螺睡眠肽(如芋螺睡眠肽-g、芋螺睡眠肽-t、芋螺睡眠肽-r芋螺睡眠肽-p或芋螺睡眠肽-e，其抑制n-甲基-d-天冬氨酸受体(nmdar))、箭毒(其阻断乙酰胆碱通道)或钡(其阻断钾通道)。在一些实施方式中，在固定液中包括约50ng/l或更大(如约100ng/l或更大、约250ng/l或更大、约500ng/l或更大、约1μg/l或更大、约2.5μg/l或更大、约5μg/l或更大、约10μg/l或更大、约25μg/l或更大、约50μg/l或更大、约100μg/l或更大、约250μg/l或更大、约500μg/l或更大、约1mg/l或更大、约2.5mg/l或更大、约5mg/l或更大、约10mg/l或更大、约25mg/l或更大、约50mg/l或更大、约100mg/l或更大或约250mg/l或更大)浓度的离子通道封阻剂或离子受体封阻剂。在一些实施方式中，在固定液中包括约500mg/l或更小(如约250mg/l或更小、约100mg/l或更小、约50mg/l或更小、约25mg/l或更小、约10mg/l或更小、约5mg/l或更小、约2.5mg/l或更小、约1mg/l或更小、约500μg/l或更小、约250μg/l或更小、约100μg/l或更小、约50μg/l或更小、约25μg/l或更小、约10μg/l或更小、约5μg/l或更小、约2.5μg/l或更小、约1μg/l或更小、约500ng/l或更小、约250ng/l或更小或约100ng/l或更小)浓度的离子通道封阻剂或离子受体封阻剂。在一些实施方式中，固定液包括离子通道封阻剂和/或离子受体封阻剂的组合。仅作为举例，在一些实施方式中，固定液包括约50ng/l至约5μg/l浓度的芋螺毒素(如κ-芋螺毒素)、约500ng/l至约25mg/l浓度的河豚毒素、约250ng/l至约10mg/l浓度的芋螺睡眠肽-g和约5mg/l至约50mg/l浓度的箭毒。

在一些实施方式中，固定液包括钙螯合剂。示例性的钙螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸(edta)、依他酸(egta)、1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-n,n,n′,n′-四乙酸(bapta)或柠檬酸盐。在一些实施方式中，在固定液中包括约0.1g/l或更高(如约0.25g/l或更高、约0.5g/l或更高、约1g/l或更高、约2g/l或更高、约3g/l或更高或约4g/l或更高)浓度的钙螯合剂。在一些实施方式中，在固定液中包括约5g/l或更小(如约4g/l或更小、约3g/l或更小、约2g/l或更小、约1g/l或更小、约0.5g/l或更小或约0.25g/l或更小)浓度的钙螯合剂。

在一些实施方式中，固定液包括呼吸毒药。示例性的呼吸毒药包括叠氮化物(如叠氮化钠)或氰化物(如氰化钠)。在一些实施方式中，在固定液中呼吸毒药的浓度为约0.1g/l或更高(如约0.2g/l或更高、约0.5g/l或更高、约1g/l或更高或约1.5g/l或更高)。在一些实施方式中，在固定液中呼吸毒药的浓度为约2g/l或更低(如约1.5g/l或更低、约1g/l或更低、约0.5g/l或更低或约0.2g/l或更低)。

在一些实施方式中，在固定液中包括突触毒药(如snare抑制剂)。示例性的突触毒药包括肉毒杆菌毒素或破伤风毒素。在一些实施方式中，在固定液中包括肉毒杆菌毒素和破伤风毒素二者。在一些实施方式中，在固定液中突触毒药的浓度为约0.1ng/l或更大(如约0.2ng/l或更大、约0.5ng/l或更大、约1ng/l或更大、约2ng/l或更大、约5ng/l或更大、约10ng/l或更大、约25ng/l或更大、约50ng/l或更大、约100ng/l或更大或约150ng/l或更大)。在一些实施方式中，在固定液中突触毒药的浓度为约200ng/l或更小(如约150ng/l或更小、约100ng/l或更小、约50ng/l或更小、约25ng/l或更小、约10ng/l或更小、约5ng/l或更小、约2ng/l或更小、约1ng/l或更小、约0.5ng/l或更小或约0.2ng/l或更小)。

在一些实施方式中，固定液包括血管舒张药。示例性的血管舒张药包括亚硝酸钠、硝酸甘油、单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯、托西硝乙胺、戊四硝酯、丙帕硝酯、替尼曲明、三乙硝胺或吗多明。在一些实施方式中，在固定液中包括约0.1g/l或更大(如约0.2g/l或更大、约0.5g/l或更大或约0.7g/l或更大)浓度的血管舒张药。在一些实施方式中，在固定液中包括约1g/l或更小(如约0.7g/l或更小、约0.5g/l或更小或约0.2g/l或更小)浓度的血管舒张药。

在一些实施方式中，在固定液中包括离子表面活性剂(如十二烷基硫酸钠(sds)或十二烷基苯磺酸钠(sdbs))。离子表面活性剂可用于在冷冻保护过程期间防止组织皱缩。在一些实施方式中，在固定液中包括约0.001％w/v或更高(如约0.002％w/v或更高、约0.005％w/v或更高或约0.01％w/v或更高)浓度的离子表面活性剂。在一些实施方式中，在固定液中包括约0.05％w/v或更低(如约0.04％w/v或更低、约0.02％w/v或更低或约0.01％w/v或更低)浓度的离子表面活性剂。

在一些实施方式中，用固定液灌注组织被动态地监控分布。在一些实施方式中，固定液包括染料(如不透射线染料)或造影剂。示例性的造影剂或不透射线染料包括但不限于碘化盐(如碘化钾或碘化钠)、钡盐(例如氯化钡)、与重金属(如铅或金)络合的螯合物或钆。在一些实施方式中，染料在固定液中的浓度是约0.1g/l或更高(如约0.2g/l或更高、约0.5g/l或更高、约1g/l或更高、约2g/l或更高、约5g/l或更高或约10g/l或更高)。在一些实施方式中，染料在固定液中的浓度是约20g/l或更低(如约10g/l或更低、约5g/l或更低、约2g/l或更低、约1g/l或更低、约0.5g/l或更低或约0.2g/l或更低)。在一些实施方式中，通过ct、microct、x射线或mri监控固定液的分布。

在一些实施方式中，固定液以两个或更多个阶段被灌注到组织中。灌注到组织中的第一阶段固定液可包括添加剂(或不同浓度的添加剂)，其在第二阶段固定液或更后阶段固定液中省略。例如，在一些实施方式中，第一阶段固定液可包括离子通道封阻剂或离子受体封阻剂、呼吸毒药、钙螯合剂、突触毒药和/或血管舒张药，且第二阶段固定液或更后阶段固定液可省略这些化合物中的任一种或多种。所有阶段固定液应包括醛，然而在一些实施方式中醛的浓度可以不同。从任何给定阶段至后期阶段灌注的过渡可以是不连续的(discrete)(即早期阶段固定液灌注到组织中在开始后期阶段固定液灌注到组织中时结束)或可以梯度形式(例如，同时减少早期阶段固定液的相对量和增加后期阶段固定液的相对量，直到用早期阶段固定液灌注组织已经结束)。

在一些实施方式中，固定液以约60mmhg至约140mmhg(如约60mmhg至约80mmhg、约80mmhg至约100mmhg、约100mmhg至约120mmhg或约120mmhg至约140mmhg)的压力灌注到组织中。

在一些实施方式中，在灌注之前将固定液过滤。在一些实施方式中，在灌注之前将固定液无菌过滤。在一些实施方式中，固定液用具有约0.5μm或更小的如约0.22μm或更小的平均孔径的过滤器过滤。

冷冻保护液和组织的冷冻保护

一旦组织已经通过用固定液灌注组织固定，则组织通过用冷冻保护液灌注组织而冷冻保护。冷冻保护液包括玻璃化剂，其在冷却(或玻璃化)组织至零下温度时抑制冰晶形成。冰晶应被最小化以避免在冷却和储存期间破坏组织的显微解剖学结构。在一些实施方式中，冷冻保护剂在冷却(或玻璃化)组织时抑制任何冰晶的形成。

示例性的玻璃化剂包括甘油、二甲亚砜(dmso)、乙二醇和/或聚乙二醇(peg)中的一种或多种。在一些实施方式中，聚乙二醇具有约200至约10,000道尔顿(da)(如约200da至约400da、约400da至约1000da、约1000da至约2000da、约2000da至约4000da或约4000da至约10,000da)的分子量。在一些实施方式中，聚乙二醇具有约200da或更高(如约400da或更高、约1000da或更高、约2000da或更高或约4000da或更高)的分子量。在一些实施方式中，聚乙二醇具有约10,000da或更低(如约4000da或更低、约2000da或更低、约1000da或更低或约400da或更低)的分子量。在一些实施方式中，冷冻保护液包括两种或更多种不同的玻璃化剂。例如，在一些实施方式中，冷冻保护液包括乙二醇、peg200和peg400。在一些实施方式中，在冷冻保护液中任何一种或多种玻璃化剂(如乙二醇或聚乙二醇)的浓度或多种玻璃化剂的总浓度是约0.1％或更高(如约0.5％或更高、约1％或更高、约5％或更高、约10％或更高、约30％或更高、约40％或更高、约50％或更高或约60％或更高)。在一些实施方式中，在冷冻保护液中任何一种或多种玻璃化剂(如乙二醇或聚乙二醇)的浓度或多种玻璃化剂的总浓度是约70％或更低(如约65％或更低、约60％或更低、约50％或更低、约40％或更低、约30％或更低、约20％或更低、约10％或更低、约5％或更低、约1％或更低或约0.5％或更低)。例如，在一些实施方式中，冷冻保护液包括约10％至约30％(如约20％)浓度的乙二醇、约20％至约40％(如约30％)浓度的peg200和约10％至约30％(如约20％)浓度的peg400。

一种或多种玻璃化剂和/或一种或多种玻璃化剂的浓缩物可以基于冷冻保护液的所需的玻璃化温度(也称为玻璃转换温度或tg)选择。例如，peg200具有约0℃的玻璃化温度，并且其可以用于调节冷冻保护液的玻璃化温度。在一些实施方式中，冷冻保护液具有约-195℃至约+50℃(如约-195℃至约-160℃之间、约-160℃至约-120℃之间、约-120℃至约-80℃之间、约-80℃至约-40℃之间、约-40℃至约0℃之间、约0℃至约+25℃之间或约+25℃至约+50℃之间)的玻璃化温度。在一些实施方式中，冷冻保护液具有约-195℃或更高(如约-160℃或更高、约-120℃或更高、约-80℃或更高、约-40℃或更高、约0℃或更高或约+25℃或更高)的玻璃化温度。在一些实施方式中，冷冻保护液具有约+50℃或更低(如约+25℃或更低、约0℃或更低、约-40℃或更低、约-80℃或更低、约-120℃或更低或约-160℃或更低)的玻璃化温度。

在一些实施方式中，冷冻保护液包括缓冲液。示例性的缓冲液包括磷酸盐缓冲液(如磷酸钠或磷酸钾)、碳酸钠或hepes。在一些实施方式中，冷冻保护液包括一种或多种如氯化钠、氯化钾、氯化镁或氯化钙的盐。在一些实施方式中，冷冻保护液的ph在约7和约8之间(如约7.2至约7.8，或约7.4至约7.6)。

在一些实施方式中，在冷冻保护液中包括如戊二醛或甲醛的醛。在一些实施方式中，冷冻保护液包括约1％(按重量计)或更大(如约1.5％或更大、约2％或更大、约2.5％或更大或约3％或更大)的醛。在一些实施方式中，冷冻保护液包括约6％或更小的醛(如约5.5％或更小、约5％或更小、约4.5％或更小、约4％或更小、约3.5％或更小、约3％或更小、约2.5％或更小或约2％或更小的醛)。在一些实施方式中，冷冻保护液包括约1％(按重量计)或更大(如约1.5％或更大、约2％或更大、约2.5％或更大或约3％或更大)的戊二醛。在一些实施方式中，冷冻保护液包括约6％或更小的戊二醛(如约5.5％或更小、约5％或更小、约4.5％或更小、约4％或更小、约3.5％或更小、约3％或更小、约2.5％或更小或约2％或更小的醛)。在一些实施方式中，冷冻保护液包括约1％(按重量计)或更大(如约1.5％或更大、约2％或更大、约2.5％或更大或约3％或更大)的甲醛。在一些实施方式中，冷冻保护液包括约6％或更小的甲醛(如约5.5％或更小、约5％或更小、约4.5％或更小、约4％或更小、约3.5％或更小、约3％或更小、约2.5％或更小或约2％或更小的醛)。

在一些实施方式中，冷冻保护液包括离子通道封阻剂或离子受体封阻剂。示例性的离子通道封阻剂或离子受体封阻剂包括但不限于芋螺毒素(如α-芋螺毒素、γ-芋螺毒素、κ-芋螺毒素、ω-芋螺毒素或μ-芋螺毒素，其起到阻断乙酰胆碱通道、钠通道、钾通道和钙通道的作用)、河豚毒素(其起到阻断钠通道的作用)、芋螺睡眠肽(如芋螺睡眠肽-g、芋螺睡眠肽-t、芋螺睡眠肽-r芋螺睡眠肽-p或芋螺睡眠肽-e，其抑制n-甲基-d-天冬氨酸受体(nmdar))、箭毒(其阻断乙酰胆碱通道)或钡(其阻断钾通道)。在一些实施方式中，在冷冻保护液中包括约50ng/l或更大(如约100ng/l或更大、约250ng/l或更大、约500ng/l或更大、约1μg/l或更大、约2.5μg/l或更大、约5μg/l或更大、约10μg/l或更大、约25μg/l或更大、约50μg/l或更大、约100μg/l或更大、约250μg/l或更大、约500μg/l或更大、约1mg/l或更大、约2.5mg/l或更大、约5mg/l或更大、约10mg/l或更大、约25mg/l或更大、约50mg/l或更大、约100mg/l或更大或约250mg/l或更大)浓度的离子通道封阻剂或离子受体封阻剂。在一些实施方式中，在冷冻保护液中包括约500mg/l或更小(如约250mg/l或更小、约100mg/l或更小、约50mg/l或更小、约25mg/l或更小、约10mg/l或更小、约5mg/l或更小、约2.5mg/l或更小、约1mg/l或更小、约500μg/l或更小、约250μg/l或更小、约100μg/l或更小、约50μg/l或更小、约25μg/l或更小、约10μg/l或更小、约5μg/l或更小、约2.5μg/l或更小、约1μg/l或更小、约500ng/l或更小、约250ng/l或更小或约100ng/l或更小)浓度的离子通道封阻剂或离子受体封阻剂。在一些实施方式中，冷冻保护液包括离子通道封阻剂和/或离子受体封阻剂的组合。仅作为举例，在一些实施方式中，冷冻保护液包括约50ng/l至约5μg/l浓度的芋螺毒素(如κ-芋螺毒素)、约500ng/l至约25mg/l浓度的河豚毒素、约250ng/lto约10mg/l浓度的浓度的芋螺睡眠肽-g和约5mg/l至约50mg/l浓度的箭毒。

在一些实施方式中，冷冻保护液包括钙螯合剂。示例性的钙螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸(edta)、依他酸(egta)、1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-n,n,n′,n′-四乙酸(bapta)或柠檬酸盐。在一些实施方式中，在固定液中包括约0.1g/l或更高(如约0.25g/l或更高、约0.5g/l或更高、约1g/l或更高、约2g/l或更高、约3g/l或更高或约4g/l或更高)浓度的钙螯合剂。在一些实施方式中，在固定液中包括约5g/l或更小(如约4g/l或更小、约3g/l或更小、约2g/l或更小、约1g/l或更小、约0.5g/l或更小或约0.25g/l或更小)浓度的钙螯合剂。

在一些实施方式中，冷冻保护液包括呼吸毒药。示例性的呼吸毒药包括叠氮化物(如叠氮化钠)或氰化物(如氰化钠)。在一些实施方式中，呼吸毒药在冷冻保护液中的浓度是约0.1g/l或更高(如约0.2g/l或更高、约0.5g/l或更高、约1g/l或更高或约1.5g/l或更高)。在一些实施方式中，呼吸毒药在冷冻保护液中的浓度是约2g/l或更低(如约1.5g/l或更低、约1g/l或更低、约0.5g/l或更低或约0.2g/l或更低)。

在一些实施方式中，在冷冻保护液中包括突触毒药(如snare抑制剂)。示例性的突触毒药包括肉毒杆菌毒素或破伤风毒素。在一些实施方式中，在冷冻保护液中包括肉毒杆菌毒素和破伤风毒素二者。在一些实施方式中，突触毒药在冷冻保护液中的浓度是约0.1ng/l或更大(如约0.2ng/l或更大、约0.5ng/l或更大、约1ng/l或更大、约2ng/l或更大、约5ng/l或更大、约10ng/l或更大、约25ng/l或更大、约50ng/l或更大、约100ng/l或更大或约150ng/l或更大)。在一些实施方式中，突触毒药在冷冻保护液中的浓度是约200ng/l或更小(如约150ng/l或更小、约100ng/l或更小、约50ng/l或更小、约25ng/l或更小、约10ng/l或更小、约5ng/l或更小、约2ng/l或更小、约1ng/l或更小、约0.5ng/l或更小或约0.2ng/l或更小)。

在一些实施方式中，冷冻保护液包括血管舒张药。示例性的血管舒张药包括亚硝酸钠、硝酸甘油、单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯、托西硝乙胺、戊四硝酯、丙帕硝酯、替尼曲明、三乙硝胺或吗多明。在一些实施方式中，在冷冻保护液中包括约0.1g/l或更大(如约0.2g/l或更大、约0.5g/l或更大或约0.7g/l或更大)浓度的血管舒张药。在一些实施方式中，在冷冻保护液中包括约1g/l或更小(如约0.7g/l或更小、约0.5g/l或更小或约0.2g/l或更小)浓度的血管舒张药。

在一些实施方式中，用冷冻保护液灌注组织被动态地监控分布。在一些实施方式中，冷冻保护液包括染料(如不透射线染料)或造影剂。示例性的造影剂或不透射线染料包括但不限于碘化盐(如碘化钾或碘化钠)、钡盐(例如氯化钡)、与重金属(如铅或金)络合的螯合物或钆。在一些实施方式中，染料在冷冻保护液中的浓度是约0.1g/l或更高(如约0.2g/l或更高、约0.5g/l或更高、约1g/l或更高、约2g/l或更高、约5g/l或更高或约10g/l或更高)。在一些实施方式中，染料在冷冻保护液中的浓度是约20g/l或更低(如约10g/l或更低、约5g/l或更低、约2g/l或更低、约1g/l或更低、约0.5g/l或更低或约0.2g/l或更低)。在一些实施方式中，通过ct、microct、x射线或mri监控冷冻保护液的分布。

在一些实施方式中，冷冻保护液以约60mmhg至约140mmhg(如约60mmhg至约80mmhg、约80mmhg至约100mmhg、约100mmhg至约120mmhg或约120mmhg至约140mmhg)的压力灌注到组织中。

在一些实施方式中，在灌注之前将冷冻保护液过滤。在一些实施方式中，在灌注之前将冷冻保护液无菌过滤。在一些实施方式中，冷冻保护液用具有约0.5μm或更小如约0.22μm或更小的的平均孔径的过滤器过滤。

在一些实施方式中，将冷冻保护液以不连续的步骤灌注到组织中(即，用固定液灌注组织已经结束后)。在一些实施方式中，冷冻保护液相对于固定液以梯度形式被灌注到组织中。即，随着灌注到组织中固定液的相对量减少，灌注到组织中冷冻保护液的相对量增加直到向组织中灌注固定液已经结束。

图2a-图2f示出保存受试者的组织(如脑)的示例性方法。图2a示出组织被灌注洗涤液。洗涤液被泵送通过过滤器且进入通向组织的动脉。在图2b中示出，在组织已经被洗涤后，将第一阶段固定液泵送通过动脉以灌注组织。将第二阶段固定液通过系统配备(如在图2c中示出)，并且将第二阶段固定液与第一阶段固定液一起泵入组织中，如在图2d中示出。将第二阶段固定液以梯度形式灌注到组织中来以代替第一阶段固定液，当连接至第一阶段固定液的泵变慢时，连接到第二阶段固定液的泵加快。然后，组织可被第二阶段固定液(并且没有第一阶段固定液)灌注，如在图2e中示出。然后，冷冻保护液相对于第二阶段固定液以梯度形式被灌注到组织中，如在图2f中示出。

组织的玻璃化、储存、解冻和分析

一旦冷冻保护液已被灌注到组织中，组织可以被玻璃化。将组织冷却至低于冷冻保护液的玻璃化温度的温度，例如通过将组织以冷藏(coldstorage)放置(例如，机械冷冻机、液氮蒸气冷冻机、等温液氮冷冻机或将组织浸入液氮中)。示例性的冷藏系统是可控等温蒸气储存(controllableisothermalvaporstorage)(civs)装置(21stcenturymedicine,inc.)。在一些实施方式中，组织的温度被玻璃化至约-80℃或更低(如约-100℃或更低、约-120℃或更低、约-140℃或更低或约-160℃或更低)的温度。在玻璃化期间，组织的温度可以通过在组织内或靠近组织插入温度探针来监控。在一些实施方式中，在组织用冷冻保护液灌注之后且组织被玻璃化之前，组织从受试者中移出。

在一些实施方式中，在玻璃化之前组织被活检(biopsies)。组织可以例如在具有低的灌注分布的组织内的位置进行活检，例如通过用包含染料或造影剂的灌注液使组织成像来监控。可以分析活检的样本以提供组织质量的下限以与玻璃化后的组织的比较。

在组织玻璃化后，组织可以在低温(depressedtemperature)下长期储存。在一些实施方式中，将玻璃化的组织储存约24小时或更长(如约48小时或更长、约72小时或更长、约96小时或更长、约7天或更长、约14天或更长、约一个月或更长、约2个月或更长、约3个月或更长、约6个月或更长或约一年或更长)。

玻璃化的组织可以除去冷藏并且解冻用于分析。解冻玻璃化的组织可包括使组织去除冷藏且使组织适应室温或高于冷冻保存液的玻璃化温度的任何其他期望温度。在一些实施方式中，在解冻过程期间将玻璃化的组织浸没在如冷冻保护液或盐水的液体中。

可以制备解冻的、保存的组织用于分析。在一些实施方式中，在进一步分析之前将冷冻保护液从保存的组织移除。在一些实施方式中，将组织切片以准备组织进行分析。在一些实施方式中，在移除冷冻保护液之前将组织切片和在一些实施方式中在切片组织之前将冷冻保护液移除。

在一些实施方式中，通过用冲洗液(例如，固定液(其可以为后期阶段固定液)、缓冲盐水、卡可基酸盐(cacodylate)缓冲溶液或本文所述的洗涤液的任何实施方式)灌注组织来去除冷冻保护液，其可以任选地相对于灌注的冷冻保护液以梯度方式灌注到组织中。在一些实施方式中，冲洗液的ph在约7和约8之间(如约7.2至约7.8，或约7.4至约7.6)。例如，解冻的组织最初用冷冻保护液灌注，并且灌注到解冻组织中的冷冻保护液的相对部分可以随着灌注到解冻组织中的冲洗液的相对部分的增加而减少。一旦完成梯度处理(即，冷冻保护液不再被灌注到组织中)，大量的固定液可继续被灌注到解冻的组织中。在一些实施方式中，将冲洗液以约60mmhg至约140mmhg(如约60mmhg至约80mmhg、约80mmhg至约100mmhg、约100mmhg至约120mmhg或约120mmhg至约140mmhg)的压力灌注到解冻的组织中。在一些实施方式中，在冷冻保护液已经从组织中移除之后，将组织切片用于分析。在一些实施方式中，在将组织切片之前将组织包埋在琼脂中。切片的组织可以被储存在如冲洗缓冲液、缓冲盐水或卡可基酸盐缓冲液的储存缓冲液中。

在一些实施方式中，冷冻保护液通过扩散去除。为了促进冷冻保护液从组织中扩散，在一些实施方式中，在扩散之前将组织切片。在一些实施方式中，在将组织切片之前将组织包埋在琼脂中。琼脂可以包括冷冻保护液中的玻璃化剂，其优选地以与在冷冻保护液中相同的浓度。将组织(其可以是切片的)浸没在冷冻保护液中，并且冷冻保护液通过用储存缓冲液(如固定液、缓冲盐水或卡可基酸盐缓冲液)稀释冷冻保护液而去除。冷冻保护液可以在一段时间内(例如，每5至15分钟用储存缓冲液替换50％)稀释。当冷冻保护液的浓度是约5％或更小(如约4％或更小、约3％或更小、约2％或更小或约1％或更小)时，冷冻保护液可以被认为去除。

在一些实施方式中，例如通过使组织成像或进行组织的显微解剖学分析，或如通过差示扫描量热法、免疫印迹或其他实验室测定法进行块状组织(bulktissue)分析，分析保存的组织。组织可以例如使用光学显微镜、电子显微镜(例如扫描电子显微镜)、聚焦离子束显微镜、扩展显微镜或荧光原位杂交(fish)显微镜(或fish扩展显微镜)进行成像。

fish显微镜检查可包括用例如寡核苷酸(如rna或dna寡核苷酸)或抗体的荧光标记的探针染色组织。在一些实施方式中，将荧光标记的探针灌注到组织中以染色组织。寡核苷酸或抗体可结合至组织中的靶核酸或蛋白质以确定靶核酸或蛋白质的位置。

在一些实施方式中，在分析之前，例如使用亚铁氰化钾和四氧化锇染色组织用于电子显微镜检查或扩展显微镜检查。其他示例性的染色剂包括钼酸铵、乙酸双氧铀、甲酸双氧铀、磷钨酸和auroglucothionate。在一些实施方式中，染色剂包括甲酰胺(例如，约1m至约3m的甲酰胺、如约2m至约3m的甲酰胺或约2.5m的甲酰胺)，其可以用于更好地将染色剂渗透到组织中。在一些实施方式中，染色剂被灌注通过组织。

在一些实施方式中，组织(如一个或多个组织切片)被包埋到塑料中用于分析，例如通过电子显微镜成像。

在一些实施方式中，在不切片组织的情况下分析组织(例如，在通过用冲洗液灌注组织从组织中移除冷冻保护液之后)。用于分析如整个脑的整个组织的技术是众所周知的。参见例如，mikula等，high-resolutionwhole-brainstainingforelectronmicroscopiccircuitreconstruction，nat.methods，第12卷，第541页-第546页(2015)描述了用邻苯三酚介导的扩增的脑宽减小的锇染色(brain-widereducedosmiumstainingwithpyrogallol-mediatedamplification)(bropa)的方法。其他方法包括在chung等，structuralandmolecularinterrogationofintactbiologicalsystems，nature，第497卷，第332页-第337页(2013)中描述的clarity方法和在chen等，expansionmicroscopy，science，第347卷，第543页-第548页(2015)中描述的扩展显微镜。扩展显微镜允许扩展组织的尺寸(例如原始尺寸的约10倍至约20倍)和使组织成像以允许组织的高分辨率。

试剂盒

在一个方面中，提供一种包括如本文所述的洗涤液、固定液和冷冻保护液的试剂盒。洗涤液、固定液和冷冻保护液可以以浓缩形式包括在试剂盒中，其可以例如用水稀释。在一些实施方式中，以可操作的浓度包括洗涤液、固定液和冷冻保护液。液体(或浓缩物)可包含在合适的容器内，如小瓶(vial)、瓶子(bottle)、广口瓶、软包装(例如密封的聚酯薄膜(mylar)或塑料袋)等。在一些实施方式中，试剂盒包括使用说明书。在一些实施方式中，使用说明书包括根据本文所述的任何方法保存组织的说明书。

示例性实施方式

以下实施方式是示例性的并且不意在限制本文所述的发明的范围。

实施方式1.一种保存受试者的组织的方法，其包括：

通过用包括水性溶液的洗涤液灌注所述组织来洗涤所述组织；

通过用包括醛的固定液灌注所述组织来固定所述组织；以及

通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注所述组织来冷冻保存所述组织；

其中所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液包括染料或造影剂。

实施方式2.一种保存受试者组织的方法，其包括：

通过用包括水性溶液的洗涤液灌注所述组织来洗涤所述组织；

通过用包括醛的固定液灌注所述组织来固定所述组织；以及

通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注所述组织来冷冻保存所述组织，所述冷冻保护液具有约-80℃或更高的玻璃化温度。

实施方式3.一种保存受试者的组织的方法，其包括：

通过用包括(1)水性溶液和(2)离子通道封阻剂、钙螯合剂、血栓溶解剂、抗血小板药、呼吸毒药或突触毒药中的任何一种或多种的洗涤液灌注所述组织来洗涤所述组织；

通过用包括醛的固定液灌注所述组织来固定所述组织；以及

通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注所述组织来冷冻保存所述组织。

实施方式4.一种保存受试者的组织的方法，其包括：

通过用包括水性溶液的洗涤液灌注所述组织来洗涤所述组织；

通过用包括醛的固定液灌注所述组织来固定所述组织；以及

通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注所述组织来冷冻保存所述组织；

其中在所述组织中缺血发作后开始所述洗涤。

实施方式5.根据实施方式2-4中任一项所述的方法，其中所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液包括染料或造影剂。

实施方式6.根据实施方式1或实施方式5中所述的方法，其中所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液包括不透射线染料。

实施方式7.根据实施方式1-6中任一项所述的方法，进一步包括通过使在所述组织中的所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液的分布成像进行监控。

实施方式8.一种保存受试者的组织的方法，其包括

通过用包括水性溶液的洗涤液灌注所述组织来洗涤所述组织；

通过用包括醛的固定液灌注所述组织来固定所述组织；

通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注所述组织来冷冻保存所述组织；以及

通过使在所述组织中所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液的分布成像进行监控。

实施方式9.根据实施方式7或8所述的方法，其中通过计算机断层扫描(ct)、微计算机断层扫描(microct)、x-射线或mri进行所述监控。

实施方式10.根据实施方式1-9中任一项所述的方法，其中根据灌注方案进行用所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液灌注所述组织，其中所述灌注方案基于监控的所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液的分布改进。

实施方式11.根据实施方式1-10中任一项所述的方法，进一步包括玻璃化所述组织。

实施方式12.根据实施方式1-11中任一项所述的方法，其中所述组织被玻璃化至约-100℃或更冷的温度。

实施方式13.根据实施方式11或实施方式12所述的方法，其包括储存玻璃化的组织约72小时或更长。

实施方式14.根据实施方式11-13中任一项所述的方法，其包括解冻玻璃化的组织。

实施方式15.根据实施方式1-14中任一项所述的方法，其包括使保存的组织的至少一部分成像。

实施方式16.根据实施方式1-15中任一项所述的方法，其包括通过显微解剖学分析表征保存的组织的至少一部分。

实施方式17.根据实施方式1-16中任一项所述的方法，其中保存的组织的至少一部分使用电子显微镜、扩展显微镜或荧光原位杂交(fish)扩展显微镜成像。

实施方式18.一种分析来自受试者的保存的组织的方法，其包括使保存的组织成像或对所述保存的组织进行显微解剖学分析，所述组织已通过以下被保存：

通过用包括水性溶液的洗涤液灌注所述组织来洗涤所述组织；

通过用包括醛的固定液灌注所述组织来固定所述组织；

通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注所述组织来冷冻保存所述组织；以及

监控在所述组织的灌注期间所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液的分布。

实施方式19.一种分析来自受试者的保存的组织的方法，其包括使保存的组织成像或对所述保存的组织进行显微解剖学分析，所述组织已通过以下被保存：

通过用包括水性溶液的洗涤液灌注所述组织来洗涤所述组织；

通过用包括醛的固定液灌注所述组织来固定所述组织；以及

通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注所述组织来冷冻保存所述组织，所述冷冻保护液具有约-80℃或更高的玻璃化温度。

实施方式20.一种分析来自受试者的保存的组织的方法，其包括使保存的组织成像或对所述保存的组织进行显微解剖学分析，所述组织已通过以下被保存：

通过用包括(1)水性溶液和(2)离子通道封阻剂、钙螯合剂、血栓溶解剂、抗血小板药、呼吸毒药或突触毒药中的任何一种或多种的洗涤液灌注所述组织来洗涤所述组织；

通过用包括醛的固定液灌注所述组织来固定所述组织；以及

通过用包括玻璃化剂的冷冻保护液灌注所述组织来冷冻保存所述组织。

实施方式21.根据实施方式19或20所述的方法，其中在所述组织的灌注期间监控所述组织中的所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液的分布。

实施方式22.实施方式18或实施方式21所述的方法，其中使用ct、microct、x-射线或mri监控所述组织的灌注。

实施方式23.根据实施方式18-22中任一项所述的方法，其包括解冻所述保存的组织。

实施方式24.根据实施方式18-23中任一项所述的方法，其中使保存的组织成像或对所述保存的组织进行显微解剖学分析包括使用电子显微镜、扩展显微镜或荧光原位杂交(fish)显微镜使所述保存的组织成像。

实施方式25.根据实施方式16-24中任一项所述的方法，其中根据灌注方案进行用所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液灌注所述组织，其中所述灌注方案基于所述组织的灌注期间的所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液的分布改进。

实施方式26.根据实施方式1-25中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护液相对于所述固定液以梯度方式被灌注到组织中。

实施方式27.根据实施方式1-26中任一项所述的方法，其中所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液包括离子通道封阻剂或者离子受体封阻剂。

实施方式28.根据实施方式1-27中任一项所述的方法，其中所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液包括钙螯合剂。

实施方式29.根据实施方式1-28中任一项所述的方法，其中所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液包括呼吸毒药。

实施方式30.根据实施方式1-29中任一项所述的方法，其中所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液包括突触毒药。

实施方式31.根据实施方式1-30中任一项所述的方法，其中所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液包括血管舒张药。

实施方式32.根据实施方式1-31中任一项所述的方法，其中所述洗涤液、所述固定液或所述冷冻保护液包括肿胀剂。

实施方式33.根据实施方式1-32中任一项所述的方法，其中所述洗涤液或所述固定液包括离子表面活性剂。

实施方式34.根据实施方式1-33中任一项所述的方法，其中所述洗涤液包括麻醉剂。

实施方式35.根据实施方式1-34中任一项所述的方法，其中所述洗涤液包括血栓溶解剂。

实施方式36.根据实施方式1-35中任一项所述的方法，其中所述洗涤液包括抗凝血剂。

实施方式37.根据实施方式1-36中任一项所述的方法，其中所述洗涤液包括抗血小板剂。

实施方式38.根据实施方式1-37中任一项所述的方法，其中所述固定液包括甲醛或戊二醛。

实施方式39.根据实施方式1-38中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护液包括醛。

实施方式40.根据实施方式1-39中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护液包括乙二醇、二甲亚砜、甘油或聚乙二醇。

实施方式41.根据实施方式1-40中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护液具有约-195℃至约+50℃的玻璃化温度。

实施方式42.根据实施方式1-41中任一项所述的方法，其中在所述受试者死亡的8小时内保存所述组织。

实施方式43.根据实施方式1-42中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。

实施方式44.根据实施方式1-42中任一项所述的方法，其中所述受试者是非人类动物。

实施方式45.根据实施方式44所述的方法，其中所述非人类动物是啮齿动物。

实施方式46.根据实施方式1-45中任一项所述的方法，其中所述组织是器官或其部分。

实施方式47.根据实施方式1-46中任一项所述的方法，其中所述组织是脑或其部分。

实施方式48.根据实施方式1-47中任一项所述的方法，其中所述组织的体积是约100cm³或更大。

实施方式49.根据实施方式1-48中任一项所述的方法，其中所述洗涤液的水性溶液是盐水溶液。

实施方式50.根据实施方式1-49中任一项所述的方法，其中所述洗涤液的水性溶液是缓冲的盐水溶液。

实施方式51.一种根据实施方式1-17和26-50中任一项所述的方法形成的保存的组织。

实施方式52.一种用于通过灌注固定组织的固定液，其包括(1)醛和(2)染料或造影剂。

实施方式53.根据实施方式52所述的固定液，其中所述醛是甲醛或戊二醛。

实施方式54.一种用于冷冻保存组织的冷冻保护液，其包括(1)玻璃化剂和(2)染料或造影剂。

实施方式55.根据实施方式54所述的冷冻保护液，其中所述冷冻保护液包括醛。

实施方式56.根据实施方式54或55所述的冷冻保护液，其中所述冷冻保护液包括乙二醇、甘油、二甲亚砜、聚乙二醇。

实施方式57.根据实施方式54-56中任一项所述的冷冻保护液，其中所述冷冻保护液具有约-195℃至约+50℃的玻璃化温度。

实施例

如下制备13升的每种洗涤溶液(washoutsolution)、固定溶液和冷冻保护溶液。洗涤溶液包含11,666.5g蒸馏水和1026.3g的10x洗涤溶液。10x洗涤溶液包含1026.3g氯化钠、234.7g二水合磷酸氢二钠、35.8g二水合磷酸二氢钠、43.3g氯化钾和12,503.4g蒸馏水。固定液包含2747.9g的5x磷酸盐缓冲液、845.0g的50％戊二醛溶液、1.3g的十二烷基硫酸钠(sds)和9646.0g蒸馏水。5x磷酸盐缓冲液包含952.2g二水合磷酸氢二钠、179.4g二水合磷酸二氢钠、6.0g叠氮化钠和12,584.0g蒸馏水。冷冻保护液包含2747.9g5x磷酸盐缓冲液、845.0g戊二醛、8450.0乙二醇和2134.6g蒸馏水。

组装了类似于图1中示出的设备的大型灌注机。该设备包括灌注液容器、蠕动泵(带有i/p易装头(#7529-20)的masterflex蠕动泵(#7549-30))、配备293mm0.22微米尼龙过滤器的millipore293mm过滤器支架、数字压力传感器(honeywell#sscdant030pasa5)和用于通过arduino控制器操作设备的膝上型计算机。该设备进一步包含使用y型接头和管子连接到蠕动泵的防腐套管。

在将套管连接到捐赠的来自86岁人类女性的脑的颈动脉之前，允许洗涤液流过套管以除去系统中的气泡。在死亡后2小时45分钟开始对脑进行工作。使用标准颅骨切开术将脑从颅骨中取出。保存程序的时间安排如下：手术设置约15分钟；用洗涤溶液灌注约20分钟；用固定液灌注约1小时；从固定液至冷冻保护剂溶液梯度渐变(gradientramp)约6小时；和用冷冻保护剂溶液灌注约1小时。戊二醛固定并用乙二醇浸润后，脑组织示出褐变的颜色变化。

将脑切成0.5英寸(～1.3cm)冠状厚片(coronalslabs)。灌注延迟2小时45分钟阻止了脑某些区域(尤其是小脑)的完全灌注，这是因为存在多个阻碍流动的血块(bloodclot)。来自丘脑、海马体和皮层的样本使用振动切片机获得并且用电子显微镜或聚焦离子束显微镜处理。样本使用graham-knott等，focussedionbeammillingandscanningelectronmicroscopyofbraintissue，j.visualizedexperiments，第53卷，第e2588页(2011)中描述的技术处理。

电子显微镜以前所未有的程度示范了脑组织的纳米级保存。图3a示出来自皮层样本的倒置反差图像，其示出核质(a)和髓磷脂(b，c)的良好的保存和高的保留。图3b是皮层样本的电子显微镜图像，示出血管(a)、多个突起(即神经元的多个分支)(b)和良好保存的基质(c)。一些损坏(d)也是可见的。图3c示出具有保存良好的突触(a)、有髓突起(b)、无髓突起(c)和一些损坏区域(d，e)的皮层样本的另外的电子显微镜图像。图3d是示出多个锥体细胞(a)和多个有髓突起(b)的电子显微镜图像。图3e示出使用扫描电子显微镜获得的醋酸铀染色的皮层样本内的多个突触(a、b、c)。图3f是扁桃腺的电子显微镜图像，其示出多个突触(a)和细小突起以及几个展开的线粒体(b)。图3g是铣削以揭示脑组织的用20微米树脂层涂覆的皮层样本的聚焦离子束铣削图像。图3h是铣削以揭示脑组织的用树脂层涂覆的胼胝体样本的聚焦离子束铣削图像。图3i是示出髓磷脂和部分破裂的切迹(a、b、c)的醋酸铀染色的皮层的电子显微镜图像。图3j是示出良好保存的有髓突起(a，b)的海马体样本的聚焦离子束扫描电子显微镜(fib-sem)图像。图3k示出来自树脂块内的皮层样本的图像。尽管脑组织的保存比先前的研究更好，但是观察到对脑超微结构的损坏。例如，在图3j中，观察到细胞内成分的一些损失(c)。图3l是示出几个平行突起中破裂的髓磷脂(a)以及正常的髓磷脂(b)的醋酸铀染色的皮层样本的电子显微镜图像。