本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种荷花无菌苗走茎快速增殖方法。
背景技术：
荷花(nelumbonuciferagaertn.)为莲科莲属多年生水生花卉,是中国十大传统名花之一，具有很高的观赏价值、经济价值和独特的文化内涵，深受人们喜爱。
荷花繁殖及保存方法主要采用传统的分藕和大面积缸栽或池植。但是，以常规的方法繁殖不仅繁殖系数较低，用种量大，而且由于病毒病等病害常发造成植株严重减产，品质变劣，这个问题已成为限制荷花种植业发展的主要障碍。而组培的方法可以解决繁殖系数低和脱毒的问题。国内已有不少研究者开始采取组织培养的方法来解决这些问题。浙江省农科院园艺所以荷花的茎尖作为外植体来进行组织培养；武汉市蔬菜科学研究所水生蔬菜研究室在进行试管藕的研究；福建省农业科学院省农业遗传工程重点实验室也在探索莲藕的微繁殖技术。但在前人及我们的实践中发现，荷花无菌苗在不结藕的情况下，即使已生根，出瓶后基本无法成活。因此，必须在组培瓶内诱导出大量的走茎(根状茎)，才能进一步诱导其膨大结藕，保证出瓶后的成活率。
目前，荷花的组织培养技术并不完善，现在常用的技术存在产生不了走茎，增殖效率低，污染率大，成活率也比较低的缺陷。我们采用荷花胚进行组织培养试验，筛选出较为合适的大量产生走茎的培养基，以期获得大量荷花组培苗，提高组培苗的出瓶成活率。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种荷花无菌苗走茎快速增殖的构建方法，以解决现有技术培育过程不易产生走茎，增殖效率低，污染率高，成活率低的问题。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种荷花无菌苗走茎快速增殖方法，选荷花叶柄、叶片均为青绿色的无菌苗芽,在无菌条件下接入无菌增殖培养基,然后添加无菌水1-2cm，封口放入组培室；每天光照时间为14-16小时，光照强度1500-2500lx，控温25-28℃，培养40-45天后获得大量走茎苗；所述的增殖培养基以ms作为基本培养基，加入6-ba1-1.5mg/l+iba0.5-1mg/l+ga30.05-1.0mg/l+蔗糖60g/l,琼脂9.5g/l,ph＝5.8。
所述的增殖培养基优选以ms作为基本培养基，加入6-ba1.0mg/l+iba0.5mg/l+ga30.05mg/l+蔗糖60g/l,琼脂9.5g/l,ph＝5.8。
所述的增殖培养基优选配制好之后放入120℃高温灭菌锅之中进行高温灭菌，灭菌完成后取出，轻轻晃动培养瓶使培养液均匀，把瓶盖再次拧紧，静置，待凝固后备用。
所述的无菌水优选将纯水放入培养瓶之中，高压灭菌后取出，放冷备用。加无菌水可以减少无菌苗叶柄枯萎的现象。
所述的荷花无菌苗走茎快速增殖方法，优选把筛选好的初代无菌芽及提前灭好的培养基及无菌水放入无菌操作台，紫外灭菌30min，通风15min，用镊子把无菌芽接入培养基，然后添加高温灭菌后的无菌水1-2cm，封口放入组培室。
本发明方法中，在增殖培养时，由于无菌苗芽会有受菌的污染情况，应该把受污染的苗挑选出来扔掉，此种无菌苗增殖培养时污染风险很大，在增殖培养前，将此种无菌苗挑出，挑选出青绿色无污染的初代无菌苗芽进行增殖可以很好的降低污染率。
本发明方法中所需要的实验材料无菌水、培养基、无菌芽，以及需要的器材镊子，解剖刀均需要先灭菌。
本发明方法中光照和温度要控制在合理的范围内，温度过高或过低均影响其正常生长，光照过高或时间过长均会造成无菌苗黄化或死苗。
本发明的有益效果：
本发明采用最优的激素配比和增加培养基中蔗糖的含量以及利用固液双层培养的方法，有效的克服了无菌苗走茎产生速度较慢，走茎增殖率低和污染率高及枯苗的难题，显著的提高了无菌苗的利用率和成活率，并且把污染率、损耗率降至最低。
进一步的，增殖培养基中蔗糖的含量提高到60g/l，因为这样可以使接种芽快速壮苗生长，极大的减轻移接后因糖分不足导致增殖苗叶片发黄，叶柄细黄的现象，使增殖芽更好的茁壮生长，增殖速度更快。
本发明所用的水必须为高温灭菌过的纯水，因为这样可以最大程度上减少外界带来的污染，最大程度的降低各种菌污染，把污染率、损耗率降至最低。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。
筛选增殖培养基过程：
1.首先，进行激素配比的筛选：共设计了三种不同的激素配比
(1)ms+1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+0.05mg/lga3+9g琼脂+30g蔗糖
(2)ms+1.5mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+0.05mg/lga3+9g琼脂+30g蔗糖
(3)ms+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+0.05mg/lga3+9g琼脂+30g蔗糖
经实验发现第一种培养基在增殖系数，及苗的生长势最好。
2.接着，进行生长素效果的比较，分别用naa和iba两种生长素进行实验
(1)ms+1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+0.05mg/lga3+9g琼脂+30g蔗糖
(2)ms+1.0mg/l6-ba+0.5mg/liba+0.05mg/lga3+9g琼脂+30g蔗糖
用相同浓度的iba和naa作筛选，通过观察发现iba更适合组培苗的生长
3.其次，进行蔗糖浓度的筛选，分别设计了4种不同这糖含量的培养基即：30g/l、40g/l、60g/l、80g/l、观察结果发现，蔗糖浓度在60g/l时苗的生长势最好，无菌苗叶柄粗绿，叶片完全舒展。
4.最后进行培养方式实验，分别用固液培养基和固体培养基进行培养
(1)固液培养方式
增殖培养基为：ms+1.0mg/l6-ba+0.5mg/liba+0.05mg/lga3+9g琼脂+60g蔗糖；无菌芽移入后将无菌水打开倒入1-2㎝形成固液双层培养基，然后把培养瓶放在酒精瓶附近灼烧消毒，最后盖上培养盖重新放入组培室内进行培养。
(2)固体培养方式
增殖培养基为：ms+1.0mg/l6-ba+0.5mg/liba+0.05mg/lga3+9g琼脂+60g蔗糖，无菌芽移入后不加无菌水，把培养瓶放在酒精瓶附近灼烧消毒，最后盖上培养盖重新放入组培室内进行培养。
观察结果发现，在培养基中加水无菌苗叶色浓绿，枯黄率最少。
实施例1
一种荷花无菌苗走茎快速增殖的构建方法，按以下步骤进行：
以微山湖红莲初代组培苗芽为材料：选用ms作为基本培养基，设置4个实验组，设置4个实验组，分别使用两种培养方式和加入两种蔗糖含量的培养基:固液培养：实验组1：ms+6-ba1.0mg/l+iba0.5mg/l+ga3mg/l+9.5g/l琼脂+60g/l蔗糖，ph＝5.8；实验组2：ms+6-ba1.0mg/l+iba0.5mg/l+0.05ga3mg/l+9.5g/l琼脂+30g/l蔗糖，ph＝5.8；固体培养：实验组3：ms+6-ba1.0mg/l+iba0.5mg/l+ga3mg/l+9.5g/l琼脂+60g/l蔗糖，ph＝5.8；实验组4：ms+6-ba1.0mg/l+iba0.5mg/l+0.05ga3mg/l+9.5g/l琼脂+30g/l蔗糖，ph＝5.8；配制好之后放入120℃高温灭菌锅之中进行高温灭菌，灭菌完成后取出，轻轻晃动培养瓶使培养液均匀，把瓶盖再次拧紧，静置，待凝固后备用。同时，接取无菌纯水放入培养瓶之中，高压灭菌后取出，备用。
将超净工作台，初代无菌芽，无菌水，酒精，滤纸，培养基，废液瓶等紫外灭菌。增殖时先筛选出叶柄、叶片均为青绿色的无菌苗芽。将取出的初代无菌苗芽作为增殖材料接种于走茎培养基中，每瓶接2-3个丛生芽，将无菌苗芽移植前先把根部褐化及老化部分用操作刀去除，然后移入增殖培养基之中。实验组1和2待无菌芽移入后将无菌水打开倒入1-2㎝形成固液双层培养基，然后把培养瓶放在酒精瓶附近灼烧消毒，最后盖上培养盖重新放入组培室内进行培养，40天左右便会得到大量产生走茎的无菌苗。实验组3和4则为固体培养，不加入无菌水，直接增殖培养基固体培养。其中，无菌苗的培养条件：每天光照时间为14h，光照强度1500-2500lx，控温25℃。统计增殖苗增殖系数，成活率和污染率。
增殖系数＝增殖后的芽数/接种芽数
成活率＝成活的初代无菌苗数/总接入的初代无菌苗×100％
污染率＝污染无菌苗数/总接种数×100％。
枯黄率＝枯黄数/总接入数
固液培养：
实验组1：90瓶中仅有6瓶污染，2瓶枯黄。污染率仅6.6％，枯黄率为2.2％，成活率100％，苗生长势最好，叶柄粗绿，增殖系数为6-7.5。
实验组2：90瓶中仅有11瓶污染，10瓶枯黄。污染率仅12.2％，枯黄率为11.1％，成活率100％，苗生长势比蔗糖含量60g/l时弱，枯黄率较高，增殖系数为5.5-6.0。
固体培养：
实验组3：90瓶中仅有8瓶污染，15瓶枯黄。污染率8.8％，枯黄率为16.6％，成活率100％，增殖系数为4。
实验组4：90瓶中有19瓶污染，31瓶枯黄。污染率仅21.1％，枯黄率为34.4％，成活率100％苗生长势比蔗糖含量60g/l时弱，枯黄率高，，叶柄细黄，增殖系数为3.7。
实施例2
一种荷花无菌苗走茎快速增殖的构建方法，按以下步骤进行：
以微山湖红莲初代组培苗芽为材料：选用ms作为基本培养基，设置4个实验组，分别使用两种培养方式和加入两种蔗糖含量的培养基:1.固液培养：实验组1：ms+6-ba1.0mg/l+iba0.5mg/l+ga3mg/l+9.5g/l琼脂+60g/l蔗糖，ph＝5.8；实验组2：ms+6-ba1.0mg/l+iba0.5mg/l+0.05ga3mg/l+9.5g/l琼脂+30g/l蔗糖，ph＝5.8；2.固体培养：实验组3：ms+6-ba1.0mg/l+iba0.5mg/l+ga3mg/l+9.5g/l琼脂+60g/l蔗糖，ph＝5.8；实验组4：ms+6-ba1.0mg/l+iba0.5mg/l+0.05ga3mg/l+9.5g/l琼脂+30g/l蔗糖，ph＝5.8，配制好之后放入120℃高温灭菌锅之中进行高温灭菌，灭菌完成后取出，轻轻晃动培养瓶使培养液均匀，把瓶盖再次拧紧，静置，待凝固后备用。同时，接取无菌纯水放入培养瓶之中，高压灭菌后取出，备用。
将超净工作台，初代无菌芽，无菌水，酒精，滤纸，培养基，废液瓶等紫外灭菌。增殖时先筛选出叶柄、叶片均为青绿色的无菌苗芽。将取出的初代无菌苗芽作为增殖材料接种于走茎培养基中，每瓶接2-3个丛生芽，将无菌苗芽移植前先把根部褐化及老化部分用操作刀去除，然后移入增殖培养基之中。实验组1和2为固液培养待无菌芽移入后将无菌水打开倒入1-2㎝，然后把培养瓶放在酒精瓶附近灼烧消毒，最后盖上培养盖重新放入组培室内进行培养，40天左右便会得到大量产生走茎的无菌苗。实验组3和4为固体培养，不加入无菌水，直接增殖培养基固体培养。无菌苗的培养条件为：每天光照时间为14h，光照强度1500-2500lx，控温25℃。统计增殖苗增殖系数，成活率和污染率。
增殖系数＝增殖后的芽数/接种芽数
成活率＝成活的初代无菌苗数/总接入的初代无菌苗×100％
污染率＝污染无菌苗数/总接种数×100％。
枯黄率＝枯黄数/总接入数
固液培养：
实验组1：:60瓶中仅有3瓶污染，1瓶枯黄。污染率仅5％，枯黄率为1.7％，成活率100％，苗生长势最好，叶柄粗绿，增殖系数为6.5。
实验组2：60瓶中仅有3瓶污染，6瓶枯黄。污染率仅5％，枯黄率为10％，成活率100％，苗生长势比蔗糖含量60g/l时弱，枯黄率较高，增殖系数为6.3。
固体培养：
实验组3::60瓶中仅有15瓶污染，15瓶枯黄。污染率25％，枯黄率为25％，成活率100％，增殖系数为4.7。
实验组4：60瓶中仅有17瓶污染，32瓶枯黄。污染率仅28.3％，枯黄率为53.3％，成活率100％苗生长势比蔗糖含量60g/l时弱，枯黄率高，，叶柄细黄，增殖系数为6.5。