一种凡纳滨对虾的体外授精方法与流程

文档序号:17918114发布日期:2019-06-14 23:55

本发明属于水产养殖繁育技术领域,具体涉及一种凡纳滨对虾的体外授精方法。



背景技术:

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei),又称南美白对虾,别名白脚虾、凡纳对虾,原产地中南美太平洋海岸水域,适合在热带、亚热带、暖温带、温带海域养殖。凡纳滨对虾是当前世界上养殖产量最高的三大优良品种之一,它具有对水环境抗逆能力强、营养要求低、生长速度快、虾体含肉量高、离水存活时间长和抗病能力强等特点。由于凡纳滨对虾养殖经济效益显著,现已成为世界上养殖规模最大产量最高的对虾品种。

在凡纳滨对虾的苗种繁育过程中,主要采用精荚移植和体外精卵结合授精的人工授精方式,由于凡纳滨对虾属开放性纳精囊类型,采用精荚移植方式将雄虾的精荚粘附在雌虾的纳精囊位置上时极易发生脱落,不仅操作技术难度大,而且平均授精率低导致人工授精效果不佳,从而影响后续幼体孵化和苗种繁育,所以体外精卵结合授精的人工授精更适合凡纳滨对虾的苗种繁育。随着人工授精和体外受精技术的发展,凡纳滨对虾的精子品质成为影响其苗种繁育效率的重要因素,通过采用合适的精子获能方法,延长精子成活时间,提高精子授精能力,但是现阶段未见有一套完整有效的适合凡纳滨对虾的精子获能方法。

同时在进行凡纳滨对虾的精卵结合受精时,因为凡纳滨对虾的精子具有无鞭毛结构,缺乏运动能力而不能主动接近卵子,增加了精卵结合的难度,影响凡纳滨对虾的授精效率,所以仍需要对凡纳滨对虾的人工受精技术进行研究和改进,实现凡纳滨对虾大规模家系选择育种和养殖。



技术实现要素:

针对上述不足,本发明提供了一种凡纳滨对虾的体外授精方法,针对凡纳滨对虾精子特性,选择合适的获能液培养凡纳滨对虾的精子,提高精子的授精能力,同时在授精过程中,对精卵混合液进行电击刺激,促进凡纳滨对虾的精卵结合,提升人工授精效果。

本发明是采用如下技术方案实现的:

一种凡纳滨对虾的体外授精方法,其包括以下步骤:

(1)凡纳滨对虾亲虾的催熟:将凡纳滨对虾亲虾按13尾/m2的培育密度进行培育,水位60 cm,水温从22℃按照1℃/min的升温速度逐步升至27~28℃,培育开始时用常规的亲虾熟料投喂3天,然后将新鲜鱿鱼、牡蛎和青虫中的任意一种或几种混合作为生物饵料投喂凡纳滨对虾亲虾;每天进行亲虾池吸污,并且排水至水位降低5cm后,再补水至原水位高度;加入1ppm益生菌调控水质,0.5~1ppm泼洒优乐碘消毒杀菌,泼洒0.5ppm营养钙和1ppm氨基葡萄糖酸钙;强化培育20天待亲虾完成第一次蜕壳后进行母虾右侧眼柄切除手术,术后5天开始进行精子收集操作;

(2)精子的获取:采用网挫法或压片法进行精子的获取;所述的网挫法是将凡纳滨对虾的精荚剪成小段放在150目的网布中,逐滴加入海水,同时隔着网布轻轻揉搓精荚,从而获得精子悬液;所述的压片法是将凡纳滨对虾的精子团从精荚中挤出,然后用两个载玻片夹住精子团,使精子涂布在载玻片上,然后用海水冲洗载玻片,收集洗液在转速为500r/min的条件下离心10min,收集上清液,再在转速为2000r/min的条件下离心5min,除去上清液即可获得精子;

(3)精子获能:将步骤(2)中获得的精子悬液或精子与等体积的获能液混合,然后在30℃下水浴培养3h即可得到含有获能精子的混合液A;

(4)精卵共浴:选取凡纳滨对虾未受精刚排出的卵与步骤(3)中得到的混合液A混合,然后用基因导入仪进行瞬间电击刺激,并且在30℃下水浴中培养30min后即可获得凡纳滨对虾的胚胎;

(5)精子成活率检测:

a.取0.25g伊红溶于50 ml海水当中,然后加入1ml浓盐酸,静置12小时,然后过滤,将过滤物放置烤箱内烤干得到干燥物,然后将干燥物溶于100ml质量浓度为95%的乙醇中得到伊红原液备用;

b.取伊红原液加入1~2倍体积的质量浓度为95%的乙醇得到伊红染液,取步骤(3)中的混合液A,按混合液A:伊红染液为(1~5):1的体积比将混合液A和伊红染液混合,然后立即涂片晾干观察。

进一步,步骤(4)中所述的电击刺激是在电压为250v,电阻为500Ω,电容为500u的条件下进行的。

进一步,步骤(3)中所述的获能液是BO液、BWW液、mTBM液和Hank’s液中的任意一种;

所述的BO液是先将6.5453g NaCl,0.2997g KCl,0.1145g NaH2PO4•2H2O,0.1057g MgCl2•6H2O,0.33g CaCl2,2.518g葡萄糖,4mL质量浓度为0.2%的酚红,青霉素1万IU,链霉素1万IU,溶于100mL的海水中,然后用0.22μm过滤器过滤灭菌得到BO储存液;将0.3108g NaHCO3,0.0138g丙酮酸钠,加入至10mL BO储存液中溶解,用海水定容到100mL得到BO工作液;按1mL BO工作液中加入20μg肝素、20mg 牛血清白蛋白的比例配制得到BO液;

所述的BWW液是先将5.54g NaCl,0.356g KCl,0.25g CaCl2•2H2O,0.162g KH2PO4,0.294g MgSO4•7H2O,溶于1000mL的海水中得到BWW储备液;将0.21g NaHCO3,0.37mL质量浓度为60%的乳酸钠,0.003g丙酮酸钠,0.1g葡萄糖,青霉素10万U/mL,链霉素各10万U/mL,0.477g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸,加入至100mLBWW储备液中溶解得到BWW工作液,接着按1mL BWW工作液加入5mg牛血清白蛋白即可得到BWW液;

所述的mTBM液是先将0.6610 g NaCl、0.0224 g KCl、0.1103 g CaCl2•2H2O、0.2422 g 三羟甲基氨基甲烷、0.1982 g 葡萄糖、0.055 g 丙酮酸钠、100μL酚红、0.0065 g 青霉素、0.005 g 链霉素,溶于100mL的海水中,pH为7.6~7.8,平衡12小时后再加入10 mg肝素和200m g牛血清白蛋白即可得到mTBM液;

所述的Hank’s液是用100mL海水溶解0.8g NaCl,0.04g KCl,0.035g NaHCO3,0.016g CaCl2•2H2O,0.02g MgSO4•7H2O,0.006g KH2PO4,0.006g Na2HPO4,0.1g葡萄糖得到的。

进一步,上述的海水是经过常规的紫外线灭菌器灭菌后得到的海水。

本技术方案与现有技术相比较具有以下有益效果:

1、本发明使用海水配制的BO液、BWW液、mTBM液和Hank’s液作为凡纳滨对虾精子的获能液,促进精子获能,提高精子的成活率和受精率;另一方面由于凡纳滨对虾的精子生理渗透压较高,本发明使用的获能液可以避免精子发生渗透损伤,更适合用于凡纳滨对虾精子的培养。

2、本发明针对凡纳滨对虾的生理构造,对精子获取方法进行优化,采用网挫法和压片法获取精子,可以有效提高精子的获得率和成活率。

3、本发明针对凡纳滨对虾精子的特性,配制合适的伊红染液用于精子成活率的测定,同时控制精子悬液与伊红染液混合比例,保证精子成活率测定的准确性。

4、本发明是针对现有技术的不足,结合凡纳滨对虾亲虾的催熟、精子的获取、精子获能和精子成活率检测等步骤,提出一套完整有效的适合凡纳滨对虾的精子获能方法,延长精子成活时间,提高精子授精能力,为后续的凡纳滨对虾的苗种繁育提供技术支持。

5、本发明先将凡纳滨对虾的精子进行获能,然后将其与刚排出的卵子共浴并且进行电击刺激,有利于精子和卵子在海水分散,促进精卵结合,提升凡纳滨对虾的人工授精效果。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明,但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法,所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1:

一种凡纳滨对虾精子获能方法,其包括以下步骤:

(1)凡纳滨对虾亲虾的催熟:将凡纳滨对虾亲虾按13尾/m2的培育密度进行培育,水位60 cm,水温从22℃按照1℃/min的升温速度逐步升至27~28℃,培育开始时用常规的亲虾熟料投喂3天,然后将新鲜鱿鱼、牡蛎和青虫中的任意一种或几种混合作为生物饵料投喂凡纳滨对虾亲虾;每天进行亲虾池吸污,并且排水至水位降低5cm后,再补水至原水位高度;加入1ppm益生菌调控水质,0.5ppm泼洒优乐碘消毒杀菌,泼洒0.5ppm营养钙和1ppm氨基葡萄糖酸钙;强化培育20天待亲虾完成第一次蜕壳后进行母虾右侧眼柄切除手术,术后5天开始进行精子收集操作;

(2)精子的获取:采用网挫法进行精子的获取;所述的网挫法是将凡纳滨对虾的精荚剪成小段放在150目的网布中,逐滴加入海水,同时隔着网布轻轻揉搓精荚,从而获得精子悬液;

(3)精子获能:将步骤(2)中获得的精子悬液或精子与等体积的获能液混合,然后在30℃下水浴培养3h即可得到含有获能精子的混合液A;所述的获能液是BO液,其制备方法是先将6.5453g NaCl,0.2997g KCl,0.1145g NaH2PO4•2H2O,0.1057g MgCl2•6H2O,0.33g CaCl2,2.518g葡萄糖,4mL质量浓度为0.2%的酚红,青霉素1万IU,链霉素1万IU,溶于100mL的海水中,然后用0.22μm过滤器过滤灭菌得到BO储存液;将0.3108g NaHCO3,0.0138g丙酮酸钠,加入至10mL BO储存液中溶解,用海水定容到100mL得到BO工作液;按1mL BO工作液中加入20μg肝素、20mg 牛血清白蛋白的比例配制得到BO液;

(4)精卵共浴:选取凡纳滨对虾未受精刚排出的卵与步骤(3)中得到的混合液A混合,然后用基因导入仪进行瞬间电击刺激,并且在30℃下水浴中培养30min后即可获得凡纳滨对虾的胚胎;所述的电击刺激是在电压为250v,电阻为500Ω,电容为500u的条件下进行的;

(5)精子成活率检测:

a.取0.25g伊红溶于50 ml海水当中,然后加入1ml浓盐酸,静置12小时,然后过滤,将过滤物放置烤箱内烤干得到干燥物,然后将干燥物溶于100ml质量浓度为95%的乙醇中得到伊红原液备用;

b.取伊红原液加入1倍体积的质量浓度为95%的乙醇得到伊红染液,取步骤(3)中的混合液A,按混合液A:伊红染液为4:1的体积比将混合液A和伊红染液混合,然后立即涂片晾干观察。

上述的海水均是经过常规的紫外线灭菌器灭菌后得到的海水。

实施例2:

一种凡纳滨对虾精子获能方法,其包括以下步骤:

(1)凡纳滨对虾亲虾的催熟:将凡纳滨对虾亲虾按13尾/m2的培育密度进行培育,水位60 cm,水温从22℃按照1℃/min的升温速度逐步升至27~28℃,培育开始时用常规的亲虾熟料投喂3天,然后将新鲜鱿鱼、牡蛎和青虫中的任意一种或几种混合作为生物饵料投喂凡纳滨对虾亲虾;每天进行亲虾池吸污,并且排水至水位降低5cm后,再补水至原水位高度;加入1ppm益生菌调控水质,1ppm泼洒优乐碘消毒杀菌,泼洒0.5ppm营养钙和1ppm氨基葡萄糖酸钙;强化培育20天待亲虾完成第一次蜕壳后进行母虾右侧眼柄切除手术,术后5天开始进行精子收集操作;

(2)精子的获取:采用压片法进行精子的获取;所述的压片法是将凡纳滨对虾的精子团从精荚中挤出,然后用两个载玻片夹住精子团,使精子涂布在载玻片上,然后用海水冲洗载玻片,收集洗液在转速为500r/min的条件下离心10min,收集上清液,再在转速为2000r/min的条件下离心5min,除去上清液即可获得精子;

(3)精子获能:将步骤(2)中获得的精子悬液或精子与等体积的获能液混合,然后在30℃下水浴培养3h即可得到含有获能精子的混合液A;所述的获能液是BWW液,其制备方法是先将5.54g NaCl,0.356g KCl,0.25g CaCl2•2H2O,0.162g KH2PO4,0.294g MgSO4•7H2O,溶于1000mL的海水中得到BWW储备液;将0.21g NaHCO3,0.37mL质量浓度为60%的乳酸钠,0.003g丙酮酸钠,0.1g葡萄糖,青霉素10万U/mL,链霉素各10万U/mL,0.477g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸,加入至100mLBWW储备液中溶解得到BWW工作液,接着按1mL BWW工作液加入5mg牛血清白蛋白即可得到BWW液;

(4)精卵共浴:选取凡纳滨对虾未受精刚排出的卵与步骤(3)中得到的混合液A混合,然后用基因导入仪进行瞬间电击刺激,并且在30℃下水浴中培养30min后即可获得凡纳滨对虾的胚胎;所述的电击刺激是在电压为250v,电阻为500Ω,电容为500u的条件下进行的;

(5)精子成活率检测:

a.取0.25g伊红溶于50 ml海水当中,然后加入1ml浓盐酸,静置12小时,然后过滤,将过滤物放置烤箱内烤干得到干燥物,然后将干燥物溶于100ml质量浓度为95%的乙醇中得到伊红原液备用;

b.取伊红原液加入2倍体积的质量浓度为95%的乙醇得到伊红染液,取步骤(3)中的混合液A,按混合液A:伊红染液为3:1的体积比将混合液A和伊红染液混合,然后立即涂片晾干观察。

上述的海水均是经过常规的紫外线灭菌器灭菌后得到的海水。

实施例3:

一种凡纳滨对虾精子获能方法,其包括以下步骤:

(1)凡纳滨对虾亲虾的催熟:将凡纳滨对虾亲虾按13尾/m2的培育密度进行培育,水位60 cm,水温从22℃按照1℃/min的升温速度逐步升至27~28℃,培育开始时用常规的亲虾熟料投喂3天,然后将新鲜鱿鱼、牡蛎和青虫中的任意一种或几种混合作为生物饵料投喂凡纳滨对虾亲虾;每天进行亲虾池吸污,并且排水至水位降低5cm后,再补水至原水位高度;加入1ppm益生菌调控水质,0.8ppm泼洒优乐碘消毒杀菌,泼洒0.5ppm营养钙和1ppm氨基葡萄糖酸钙;强化培育20天待亲虾完成第一次蜕壳后进行母虾右侧眼柄切除手术,术后5天开始进行精子收集操作;

(2)精子的获取:采用压片法进行精子的获取;所述的压片法是将凡纳滨对虾的精子团从精荚中挤出,然后用两个载玻片夹住精子团,使精子涂布在载玻片上,然后用海水冲洗载玻片,收集洗液在转速为500r/min的条件下离心10min,收集上清液,再在转速为2000r/min的条件下离心5min,除去上清液即可获得精子;

(3)精子获能:将步骤(2)中获得的精子悬液或精子与等体积的获能液混合,然后在30℃下水浴培养3h即可得到含有获能精子的混合液A;所述的获能液是mTBM液,其制备方法是先将0.6610 g NaCl、0.0224 g KCl、0.1103 g CaCl2•2H2O、0.2422 g 三羟甲基氨基甲烷、0.1982 g 葡萄糖、0.055 g 丙酮酸钠、100μL酚红、0.0065 g 青霉素、0.005 g 链霉素,溶于100mL的海水中,pH为7.6~7.8,平衡12小时后再加入10 mg肝素和200m g牛血清白蛋白即可得到mTBM液;

(4)精卵共浴:选取凡纳滨对虾未受精刚排出的卵与步骤(3)中得到的混合液A混合,然后用基因导入仪进行瞬间电击刺激,并且在30℃下水浴中培养30min后即可获得凡纳滨对虾的胚胎;所述的电击刺激是在电压为250v,电阻为500Ω,电容为500u的条件下进行的;

(5)精子成活率检测:

a.取0.25g伊红溶于50 ml海水当中,然后加入1ml浓盐酸,静置12小时,然后过滤,将过滤物放置烤箱内烤干得到干燥物,然后将干燥物溶于100ml质量浓度为95%的乙醇中得到伊红原液备用;

b.取伊红原液加入1.5倍体积的质量浓度为95%的乙醇得到伊红染液,取步骤(3)中的混合液A,按混合液A:伊红染液为1:1的体积比将混合液A和伊红染液混合,然后立即涂片晾干观察。

上述的海水均是经过常规的紫外线灭菌器灭菌后得到的海水。

实施例4:

一种凡纳滨对虾精子获能方法,其包括以下步骤:

(1)凡纳滨对虾亲虾的催熟:将凡纳滨对虾亲虾按13尾/m2的培育密度进行培育,水位60 cm,水温从22℃按照1℃/min的升温速度逐步升至27~28℃,培育开始时用常规的亲虾熟料投喂3天,然后将新鲜鱿鱼、牡蛎和青虫中的任意一种或几种混合作为生物饵料投喂凡纳滨对虾亲虾;每天进行亲虾池吸污,并且排水至水位降低5cm后,再补水至原水位高度;加入1ppm益生菌调控水质,0.7ppm泼洒优乐碘消毒杀菌,泼洒0.5ppm营养钙和1ppm氨基葡萄糖酸钙;强化培育20天待亲虾完成第一次蜕壳后进行母虾右侧眼柄切除手术,术后5天开始进行精子收集操作;

(2)精子的获取:采用网挫法进行精子的获取;所述的网挫法是将凡纳滨对虾的精荚剪成小段放在150目的网布中,逐滴加入海水,同时隔着网布轻轻揉搓精荚,从而获得精子悬液;

(3)精子获能:将步骤(2)中获得的精子悬液或精子与等体积的获能液混合,然后在30℃下水浴培养3h即可得到含有获能精子的混合液A;所述的获能液是Hank’s液,其制备方法是用100mL海水溶解0.8g NaCl,0.04g KCl,0.035g NaHCO3,0.016g CaCl2•2H2O,0.02g MgSO4•7H2O,0.006g KH2PO4,0.006g Na2HPO4,0.1g葡萄糖得到的;

(4)精卵共浴:选取凡纳滨对虾未受精刚排出的卵与步骤(3)中得到的混合液A混合,然后用基因导入仪进行瞬间电击刺激,并且在30℃下水浴中培养30min后即可获得凡纳滨对虾的胚胎;所述的电击刺激是在电压为250v,电阻为500Ω,电容为500u的条件下进行的;

(5)精子成活率检测:

a.取0.25g伊红溶于50 ml海水当中,然后加入1ml浓盐酸,静置12小时,然后过滤,将过滤物放置烤箱内烤干得到干燥物,然后将干燥物溶于100ml质量浓度为95%的乙醇中得到伊红原液备用;

b.取伊红原液加入1倍体积的质量浓度为95%的乙醇得到伊红染液,取步骤(3)中的混合液A,按混合液A:伊红染液为2:1的体积比将混合液A和伊红染液混合,然后立即涂片晾干观察。

上述的海水均是经过常规的紫外线灭菌器灭菌后得到的海水。

实施例5:

一种凡纳滨对虾精子获能方法,其包括以下步骤:

(1)凡纳滨对虾亲虾的催熟:将凡纳滨对虾亲虾按13尾/m2的培育密度进行培育,水位60 cm,水温从22℃按照1℃/min的升温速度逐步升至27~28℃,培育开始时用常规的亲虾熟料投喂3天,然后将新鲜鱿鱼、牡蛎和青虫中的任意一种或几种混合作为生物饵料投喂凡纳滨对虾亲虾;每天进行亲虾池吸污,并且排水至水位降低5cm后,再补水至原水位高度;加入1ppm益生菌调控水质,0.6ppm泼洒优乐碘消毒杀菌,泼洒0.5ppm营养钙和1ppm氨基葡萄糖酸钙;强化培育20天待亲虾完成第一次蜕壳后进行母虾右侧眼柄切除手术,术后5天开始进行精子收集操作;

(2)精子的获取:采用压片法进行精子的获取;所述的压片法是将凡纳滨对虾的精子团从精荚中挤出,然后用两个载玻片夹住精子团,使精子涂布在载玻片上,然后用海水冲洗载玻片,收集洗液在转速为500r/min的条件下离心10min,收集上清液,再在转速为2000r/min的条件下离心5min,除去上清液即可获得精子;

(3)精子获能:将步骤(2)中获得的精子悬液或精子与等体积的获能液混合,然后在30℃下水浴培养3h即可得到含有获能精子的混合液A;所述的获能液是BO液,其制备方法是先将6.5453g NaCl,0.2997g KCl,0.1145g NaH2PO4•2H2O,0.1057g MgCl2•6H2O,0.33g CaCl2,2.518g葡萄糖,4mL质量浓度为0.2%的酚红,青霉素1万IU,链霉素1万IU,溶于100mL的海水中,然后用0.22μm过滤器过滤灭菌得到BO储存液;将0.3108g NaHCO3,0.0138g丙酮酸钠,加入至10mL BO储存液中溶解,用海水定容到100mL得到BO工作液;按1mL BO工作液中加入20μg肝素、20mg 牛血清白蛋白的比例配制得到BO液;

(4)精卵共浴:选取凡纳滨对虾未受精刚排出的卵与上述的混合液B混合,然后用基因导入仪进行瞬间电击刺激,并且在30℃下水浴中培养30min后即可获得凡纳滨对虾的胚胎;所述的电击刺激是在电压为250v,电阻为500Ω,电容为500u的条件下进行的;

(5)精子成活率检测:

c.取0.25g伊红溶于50 ml海水当中,然后加入1ml浓盐酸,静置12小时,然后过滤,将过滤物放置烤箱内烤干得到干燥物,然后将干燥物溶于100ml质量浓度为95%的乙醇中得到伊红原液备用;

d.取伊红原液加入2倍体积的质量浓度为95%的乙醇得到伊红染液,取步骤(3)中的混合液A,按混合液A:伊红染液为5:1的体积比将混合液A和伊红染液混合,然后立即涂片晾干观察。

上述的海水均是经过常规的紫外线灭菌器灭菌后得到的海水。

对比例1:

使用Fish Ringer’s液作为获能液,然后按照实施例1所述的方法进行凡纳滨对虾的体外授精操作;所述的Fish Ringer’s液是用100mL海水溶解1.35g NaCl,0.06g KCl,0.025g CaCl2,0.035g MgCl2,0.02g NaHCO3,0.03g NaH2PO4后得到的。

对比例2:

使用Mounib’s液作为获能液,然后按照实施例2所述的方法进行凡纳滨对虾的精子体外授精操作;所述的Mounib’s液是用100mL海水溶解0.439g NaCl,0.521g KCl,0.022g CaCl2,0.012g MgSO4,0.655g Tris后得到的。

按照实施例1~5和对比例1~2中所述的方法进行凡纳滨对虾的体外授精操作,检测精子获能后的成活率,同时采用CBB染色检测方法检测获能精子的顶体反应,统计顶体反应率;上述实验得到的具体结果见表1。

表1 获能精子的成活率和顶体反应率

由上述实验数据可知,应用本发明方法的实施例1~5与对比例1~2相比较,虽然精子获能后的成活率有所下降,但是却大幅提高了顶体反应率,因为顶体反应是精子获能后发生的重要生理过程,是受精的先决条件,只有完成顶体反应的精子才能与卵母细胞融合实现受精,所以使用本发明方法能够提高凡纳滨对虾精子的顶体反应率,促进精卵结合,进一步提高人工授精效率。

此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

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