一种细胞分裂素的制备方法与流程

文档序号:17814279发布日期:2019-06-05 21:25

本发明属于细胞分裂素提取技术领域,特别涉及一种细胞分裂素的制备方法。



背景技术:

细胞分裂素(cytokinin)活性物质包括两类:一是嘌呤型的细胞分裂素(CTK),其结构均为腺嘌呤在N6位置上取代衍生物,如玉米素(ZT)、激动素(KT)等;另一类是苯基脲型的衍生物类细胞分裂素,如N,N'-二苯基脲(DPU)等。天然的细胞分裂素存在于茎尖、根尖、未成熟的种子、萌发中的种子和生长的果实中,其作用是促进细胞分裂,细胞体扩大,使芽分化,解除顶端优势,促进侧芽生长,抑制衰老等,对种子和芽有打破休眠、促使萌发的作用。



技术实现要素:

本发明的目的在于,提供一种从植物根茎中提取玉米素的方法。

为了实现上述目的,本申请采用的技术方案为:

一种细胞分裂素的制备方法,所述细胞分裂素为玉米素,包括如下步骤:

S1、取植物的根或茎,用液氮冷冻后,研磨成粉末,再向粉末中加入提取液,-25℃~-20℃下浸提10h~12h,得到浸提液;

所述提取液为甲醇溶液,所述甲醇溶液中甲醇与水的体积比为4:1;

S2、将浸提液在10000r/min~15000r/min,4℃下离心8min~12min,收集上清液置于离心管并保存于-25℃~-20℃下,残渣再用提取液于-25℃~-20℃提取5h~8h,离心,收集上清液并混合于前一次的上清液,得离心液;

S3、将上述离心液过固相萃取柱,收集滤液后,减压蒸馏至无溶剂蒸出为止,得到浓缩物;

S4、将浓缩物与聚乙烯吡咯烷酮混合,分液后,取上清液;

S5、上清液过硅胶柱,洗脱剂为二氯甲烷和乙酸乙酯,进行梯度洗脱,设定等体积为一个馏分收集,检测并合并相同斑点的馏分后,减压蒸馏,干燥得到玉米素。

进一步的,S1中所述植物的根或茎的质量与所述提取液的体积比为0.5g/mL~1.2g/mL。

进一步的,所述S3的具体步骤为:

用1ml 100%甲醇和1ml 1mol/L甲酸平衡C18固相萃取柱,然后将离心液通过置于真空抽滤装置上的96孔C18固相萃取柱,并连接上真空泵,以1ml/min的速度抽滤,收集滤液。

进一步的,S4中每1mL聚乙烯吡咯烷酮中溶解0.05g浓缩物。

进一步的,S5上清液过硅胶柱为称取适量200目~300目细硅胶装入到玻璃柱中,使硅胶自由沉降,将S4中的上清液上样到细硅胶柱中;

且按照二氯甲烷:乙酸乙酯的体积比为13:1;9:1;7:1;6:1;2:1进行梯度洗脱。

进一步的,S5中设定为15mL为一个馏分收集。

进一步的,S5中的斑点为采用薄层层析色谱检测后得到的斑点。

本发明中的植物为杧果、水稻、油菜、拟南芥、番茄或烟叶等植物。

将减压蒸馏得到的玉米素用色谱级甲醇溶解,用HPLC技术检测。

其中,所述HPLC技术的具体参数如下:

色谱柱:Agilent SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm,上海安捷伦科技有限公司);

流动相A:超纯水;

流动相B:(色谱纯);

紫外检测波长:245nm

流速:0.3mL/min;

柱温:35℃;

流动相洗脱梯度见表1;

表1液相色谱线性梯度洗脱程序

与现有技术相比,本发明的有益效果是:

本发明的纯化方法操作简单,成本低。此外纯化方法中的玉米素的收率高,纯度高达97%。

具体实施方式

为了使本发明的技术手段、创作特征、达到目的与功效易于明白了解,下面将结合本发明的具体实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1

一种细胞分裂素的制备方法,包括如下步骤:

S1、取植物的根或茎,用液氮冷冻后,研磨成粉末,再向粉末中加入提取液,-25℃下浸提10h,得到浸提液;植物的根或茎的质量与所述提取液的体积比为0.5g/mL,所述植物为杧果。

提取液为甲醇溶液,甲醇溶液中甲醇与水的体积比为4:1;

S2、将浸提液在10000r/min,4℃下离心12min,收集上清液置于新管并保存于-25℃下,残渣再用提取液于-25℃提取5h,离心,收集上清液并混合于前一次的上清液,得离心液;

S3、将上述离心液过固相萃取柱,收集滤液后,减压蒸馏至无溶剂蒸出为止,得到浓缩物;

具体步骤为:

用1ml甲醇和1ml 1mol/L甲酸平衡C18固相萃取柱,然后将离心液通过置于真空抽滤装置上的C18固相萃取柱,并连接上真空泵,以1ml/min的速度抽滤,收集滤液。

S4、将浓缩物与聚乙烯吡咯烷酮混合,分液后,取上清液;每1mL聚乙烯吡咯烷酮中溶解0.05g浓缩物;

S5、上清液过硅胶柱,洗脱剂为二氯甲烷和乙酸乙酯,进行梯度洗脱,设定等体积为一个馏分收集,检测并合并相同斑点的馏分后,减压蒸馏,干燥得到玉米素;

具体步骤为

称取200目~300目细硅胶装入到玻璃柱中,使硅胶自由沉降,将S4中的上清液上样到细硅胶柱中;

且按照二氯甲烷:乙酸乙酯的体积比为13:1;9:1;7:1;6:1;2:1进行梯度洗脱。

且设定为15mL为一个馏分收集,斑点为采用薄层层析色谱检测后得到的斑点。

然后将得到的玉米素用色谱级甲醇溶解,用HPLC技术检测,结果显示玉米素标准物质的液相出峰时间为24.11min,在相同条件下,本申请的某一组分出峰时间为24.873min,和玉米素标准品的出峰保留时间相近,于是判断该组分为玉米素。

且经过测定本发明的玉米素的含量为96.7%.

实施例2

一种细胞分裂素的制备方法,所述细胞分裂素为玉米素,包括如下步骤:

S1、取植物的根或茎,用液氮冷冻后,研磨成粉末,再向粉末中加入提取液,-20℃下浸提12h,得到浸提液;植物的根或茎的质量与提取液的体积比为1.2g/mL,所述置物为水稻;

提取液为甲醇溶液,甲醇溶液中甲醇与水的体积比为4:1;

S2、将浸提液在15000r/min,4℃下离心8min,收集上清液置于离心管并保存于-20℃下,残渣再用提取液于-20℃提取8h,离心,收集上清液并混合于前一次的上清液,得离心液;

S3、将上述离心液过固相萃取柱,收集滤液后,减压蒸馏至无溶剂蒸出为止,得到浓缩物;

具体步骤为:

用1ml甲醇和1ml 1mol/L甲酸平衡C18固相萃取柱,然后将离心液通过置于真空抽滤装置上的C18固相萃取柱,并连接上真空泵,以1ml/min的速度抽滤,收集滤液。

S4、将浓缩物与聚乙烯吡咯烷酮混合,分液后,取上清液;每1mL聚乙烯吡咯烷酮中溶解0.05g浓缩物;

S5、上清液过硅胶柱,洗脱剂为二氯甲烷和乙酸乙酯,进行梯度洗脱,设定等体积为一个馏分收集,检测并合并相同斑点的馏分后,减压蒸馏,干燥得到玉米素。

S5上清液过硅胶柱为称取200目~300目细硅胶装入到玻璃柱中,使硅胶自由沉降,将S4中的上清液上样到细硅胶柱中;

且按照二氯甲烷:乙酸乙酯的体积比为13:1;9:1;7:1;6:1;2:1进行梯度洗脱。

且设定为15mL为一个馏分收集,斑点为采用薄层层析色谱检测后得到的斑点。

将减压蒸馏得到的玉米素用色谱级甲醇溶解,用HPLC技术检测,结果显示玉米素标准物质的液相出峰时间为24.11min,在相同条件下,本申请的某一组分出峰时间为25.015min,和玉米素标准品的出峰保留时间相近,于是判断该组分为玉米素。

且经过测定本发明的玉米素的含量为96.9%。

实施例3

一种细胞分裂素的制备方法,细胞分裂素为玉米素,包括如下步骤:

S1、取植物的根或茎,用液氮冷冻后,研磨成粉末,再向粉末中加入提取液,-22℃下浸提11h,得到浸提液;

所述提取液为甲醇溶液,所述甲醇溶液中甲醇与水的体积比为4:1;植物的根或茎的质量与所述提取液的体积比为0.9g/mL,所述植物为烟叶。

S2、将浸提液在12000r/min,4℃下离心10min,收集上清液置于离心并保存于-22℃下,残渣再用提取液于-22℃提取7h,离心,收集上清液并混合于前一次的上清液,得离心液;

S3、将上述离心液过固相萃取柱,收集滤液后,减压蒸馏至无溶剂蒸出为止,得到浓缩物;

具体步骤为:

用1ml甲醇和1ml 1mol/L甲酸平衡C18固相萃取柱,然后将离心液通过置于真空抽滤装置上的C18固相萃取柱,并连接上真空泵,以1ml/min的速度抽滤,收集滤液。

S4、将浓缩物与聚乙烯吡咯烷酮混合,分液后,取上清液;每1mL聚乙烯吡咯烷酮中溶解0.05g浓缩物;

S5、上清液过硅胶柱,洗脱剂为二氯甲烷和乙酸乙酯,进行梯度洗脱,设定等体积为一个馏分收集,检测并合并相同斑点的馏分后,减压蒸馏,干燥得到玉米素。

具体步骤为称取200目~300目细硅胶装入到玻璃柱中,使硅胶自由沉降,将S4中的上清液上样到细硅胶柱中;

且按照二氯甲烷:乙酸乙酯的体积比为13:1;9:1;7:1;6:1;2:1进行梯度洗脱。

且设定为15mL为一个馏分收集,斑点为采用薄层层析色谱检测后得到的斑点。

然后将得到的玉米素用色谱级甲醇溶解,用HPLC技术检测,结果显示玉米素标准物质的液相出峰时间为24.11min,在相同条件下,本申请的某一组分出峰时间为24.908min,和玉米素标准品的出峰保留时间相近,于是判断该组分为玉米素。

且经过测定本发明的玉米素的含量为97%。

综上所述,本发明的纯化方法操作简单,成本低。此外纯化方法中的玉米素的收率高,纯度高达97%。

以上公开的仅为本发明的较佳实施例,但是,本发明实施例并非局限于此,任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

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