一种生长基质及其制备方法和应用与流程
本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种生长基质及其制备方法和应用。
背景技术：
蚯蚓，俗称地龙、曲蟮，是一种杂食性环节动物，生活在土壤中，其习性为昼伏夜出，偏爱高蛋白物质食物，主要以动物粪便和有机废物垃圾为食。经测定蚯蚓主要由蛋白质、不饱和脂肪酸、碳水化合物、维生素、钙和磷等矿物质元素组成，在医学上具有清热、平肝、止喘、通络的作用，在农业生产中可作为畜、禽、鱼类等养殖的蛋白质饲料，疏松土壤，改善土壤肥力，还可处理城市和农村生产生活中的有机垃圾，化废为肥，改善环境，具有极广的用途和较高的经济价值。因此，蚯蚓养殖已成为一种新兴的产业之一。
目前，食用菌菌渣、醋渣等农业废弃物造成的环境污染问题非常严重。中国是食用菌生产大国，据中国食用菌学会不完全统计，2011年中国食用菌生产总量达到2570万吨，占全球总量的70％以上，产值超过1400亿元。伴随着食用菌产业的发展，采收食用菌子实体后的废弃的固体培养基—菌渣的数量越来越多(卫智涛，周国英，胡清秀等.食用菌菌渣利用现状研究[a].中国食用菌.2010.29(5))。据统计，荷兰菌渣的产生量每年达2.1×106m3，美国菌渣的产生量每年达3.4×106m3。而我国作为食用菌生产量最大的国家，2011年菌渣产生量为8360万吨，数量巨大。目前，食用菌菌渣处理方法主要是被随意丢弃或焚烧(董雪梅，王延锋，孙靖轩等.食用菌菌渣综合利用进展研究[a].中国食用菌.2013.32(6))，少量直接作为肥料回田或作为食用菌二次栽培基料，但对其丢弃或焚烧，不仅造成了资源的浪费，且对环境造成了污染。通过固态发酵处理的方法将废弃的食用菌菌渣转化为蚯蚓生长所需的培养基质则可以有效解决环境污染的问题，并变废为宝。
目前，养殖蚯蚓的基质主要有动物粪便、城市剩余污泥、发酵后的菌渣及其与蚯蚓生长所需要的混合物。常用的蚯蚓养殖的动物粪便主要有猪粪、鸡粪、羊粪和牛粪等，其合适的比例配制基料养殖蚯蚓效果最好；新鲜的城市剩余污泥可直接用于饲养蚯蚓，蚯蚓生长正常；发酵后的菌渣也可用于蚯蚓养殖，其主要有堆沤发酵后的草菇残料、姬菇及双孢菇等，其可显著提高蚯蚓的生长和繁殖能力；菌渣辅以蚯蚓生长所需要的混合物主要有餐厨垃圾及添加剂(尿素和硫酸铵等)等。上述研究为利用金针菇菌渣处理后的产物用于蚯蚓的养殖提供了理论基础，而醋渣用作蚯蚓养殖的基质未见报道，关于金针菇菌渣和醋渣按照一定比例进行多菌发酵获得适合蚯蚓培养的基质的工艺也未见报道。
随着社会和经济的发展，上述如动物粪便等用于蚯蚓养殖的基质已不易获得，且有些基质存在着成分复杂，添加物众多等缺点，影响了蚯蚓养殖的效果。
技术实现要素：
本发明提供一种生长基质及其制备方法和应用，该生长基质用于养殖蚯蚓，本发明针对金针菇菌渣和醋渣等农业废弃物的资源化利用低，高附加值的开发利用少，易造成环境污染等问题，采用金针菇菌渣和醋渣等农业废弃物微生物固态发酵技术，获得适宜蚯蚓生长的基质，为农业废弃物资源化高效利用提供一种新途径，且本发明的生长基质原料为金针菇菌渣和醋渣按比例的混合，价廉易得，组分简单，并可以解决农业废弃物造成的环境污染问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种生长基质的制备方法，包括以下步骤：
原料预处理：将金针菇菌渣和醋渣按比例进行混合及预处理；
原料发酵：将一定接种量的单菌种或多菌种的混合接种到发酵原料上，在一定发酵条件下发酵一段时间后得到生长基质。
上述方案中，所述金针菇菌渣和醋渣按1:7～1:7的重量比进行混合。
优选的，所述金针菇菌渣和醋渣按7∶3的重量比进行混合。
上述方案中，所述菌种为枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母、黄孢原毛平革菌中的一种或多种的混合。
进一步的，所述菌种为枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母、原毛平革菌中的任意两种以1:1的比例混合的混合菌液。
优选的，所述菌种为热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌比例为1∶1∶1的混合菌液。
上述方案中，所述菌种的接种量为1～9％，发酵条件为发酵时间1～5天，发酵温度为20～32℃，发酵ph值为5.5～7.5。
优选的，所述菌种的接种量为7％，发酵条件为发酵时间3天，发酵温度为26℃，发酵ph值为7.5。
一种生长基质，所述生长基质为利用所述的生长基质的制备方法制得。
一种根据所述的生长基质的应用，所述生长基质用于蚯蚓的养殖。
有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明所述方法制得的生长基质的发酵原料为金针菇菌渣和醋渣按比例进行混合，价廉易得，组分简单。
2.本发明方法获得的发酵后的生长基质，用于饲养蚯蚓，发现蚯蚓日增重倍数显著高于未发酵组蚯蚓日增重倍数和空白组蚯蚓日增重倍数，且饲养效果优于金针菇菌渣直接饲养及传统饲养方法。
3.本发明利用多种发酵菌协同发酵农业生产废弃物的方法，通过固态发酵处理将废弃的金针菇菌渣和醋渣转化为蚯蚓生长所需的生长基质，工艺简单，适用于生产，并可以解决农业废弃物造成的环境污染问题。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明单菌发酵的发酵基质中粗蛋白质含量变化图。
图2为本发明多菌发酵的发酵基质中粗蛋白质含量变化图。
图3为本发明发酵原料比例对发酵基质粗蛋白质含量的影响曲线图。
图4为本发明混菌接种量对发酵基质粗蛋白质含量的影响曲线图。
图5为本发明发酵温度对发酵基质粗蛋白质含量的影响曲线图。
图6为本发明ph值对发酵基质中粗蛋白质含量的影响曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行详细描述，但本发明的保护范围并不限于此。
本发明所述生长基质的制备方法，包括以下步骤：
原料预处理：将金针菇菌渣和醋渣按比例进行混合及预处理；
原料发酵：将一定接种量的单菌种或多菌种的混合接种到发酵原料上，在一定发酵条件下发酵一段时间后得到生长基质。
所述金针菇菌渣和醋渣按1:7～1:7的重量比进行混合。优选的，所述金针菇菌渣和醋渣按7∶3的重量比进行混合。
所述菌种为枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母、黄孢原毛平革菌中的一种或多种的混合。进一步的所述菌种为枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母比例为1∶1的混合菌液、枯草芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌比例为1∶1的混合菌液、热带假丝酵母和黄孢原毛平革菌比例为1∶1的混合菌液或热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌比例为1∶1∶1的混合菌液。优选的，所述菌种为热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌比例为1∶1∶1的混合菌液。
所述菌种的接种量为1～9％，发酵条件为发酵时间1～5天，发酵温度为20～32℃，发酵ph值为5.5～7.5。优选的，所述菌种的接种量为7％，发酵条件为发酵时间3天，发酵温度为26℃，发酵ph值为7.5。
一种生长基质，所述生长基质为利用所述的生长基质的制备方法制得。
一种根据所述的生长基质的应用，所述生长基质用于蚯蚓的养殖。
本发明养殖蚯蚓的生长基质主要由金针菇菌渣和醋渣组成，固态发酵菌为枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母或黄孢原毛平革菌的一种或多种的混合。具体发酵物预处理、成分分析、菌种培养和蛋白质含量测定方法如下：
1.金针菇菌渣和醋渣的预处理方法，按照下述步骤进行：可以精密称取干燥金针菇菌渣和醋渣各50g，采用粉碎机粉碎，置于通风干燥处，备用。
2.金针菇菌渣和醋渣主要成分的分析方法，可以按照下述步骤进行：
2.1.灰分含量测定
采用灼烧法测定样品中总灰分(gb5009.4—2016)。
2.2脂肪含量的测定
采用索氏提取法测定样品中脂肪的含量(gb5009.6—2016)。
2.3纤维素含量的测定
采用滴定法测定样品中纤维素的含量(gb5009.88—2014)。
2.4元素含量分析
采用元素分析仪和电感耦合等离子质谱仪测定c、n、h和p的含量。
2.5蛋白质含量的测定
采用凯氏定氮法测定金针菇菌渣和醋渣中粗蛋白含量(gb5009.4—2016)。
金针菇菌渣及醋渣的主要成分分析结果如下：
菌渣中水分占44.82％；粗蛋白含量占7.32％；粗脂肪为1.71％；灰分含量为17.87％；纤维素含量为26.53％。醋渣中水分占50.26％；粗蛋白质含量5.35％；粗脂肪含量为1.87％；灰分含量为9.27％；纤维素含量为35.86％。菌渣中c、n、h和p的含量分别为24.40％、2.16％、3.21％和3.2％；醋渣中c、n、h和p的含量分别为43.67％、1.88％、5.87％和6.36％。通过对金针菇菌渣和醋渣主要成分的分析，发现菌渣和醋渣中富含有蚯蚓生长所需的营养物质和活动所需的能量。
3.枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黄孢原毛平革菌的培养方法，可以按照下述步骤进行：
牛肉膏蛋白胨培养基：准确称取牛肉膏3g、蛋白胨10g和nacl5g，1000ml双蒸水完全溶解，采用0.1m的naoh溶液调节ph至7.4-7.6，于121℃高压灭菌锅中，灭菌30min，备用。
马铃薯葡萄糖培养基(pda)：取马铃薯葡萄糖培养基46g，1000ml双蒸水完全溶解，ph自然，与121℃的高压灭菌锅中，灭菌30min，备用。
取500ml的锥形瓶，高压灭菌锅中121℃高压灭菌30min，备用。在无菌条件下将100ml培养基转入锥形瓶中，接种，接种时左手持试管，右手将烧灼过的接种环伸入菌种管，待冷却后，取菌液一环，移入培养基管中，在接近液面的管壁上轻轻研磨，再将试管稍倾斜，并沾取少许液体调和，使菌液混合于培养基中。将接种好的菌放置于37℃，200r的恒温震荡器中，培养24h，取出，备用。其中枯草芽孢杆菌采用牛肉膏蛋白胨培养基进行培养，热带假丝酵母菌和黄孢原毛平革菌则使用pda培养基进行培养。
4.蛋白质含量测定方法，按照2.5法进行。
发酵物中各成分的作用：
金针菇菌渣：为发酵的主要原料和蚯蚓养殖的主要基质。其含有蛋白质、脂肪、纤维素和蚯蚓生存所必须的元素c、n、h和p等物质，可以为蚯蚓提供生存所需的养分。
醋渣：为发酵的主要原料和蚯蚓养殖的主要基质。其含有蛋白质、脂肪、水分以及蚯蚓生存所必须的元素c、n、h和p等物质，其中还含大量纤维素可以为蚯蚓提供其活动所需的能量，同时具有调节ph的作用。
枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黄孢原毛平革菌：为主要发酵菌种。
药品与试剂：
枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母菌和黄孢原毛平革菌均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。硫酸钾、硫酸铜、浓硫酸、氢氧化钠、硼酸和亚甲基蓝指示剂等购自国药集团化学试剂有限公司，纯度为化学纯。
统计方法：
数据用sas6.12统计软件进行处理，结果用
实验方法：
发酵菌种的组成为枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黄孢原毛平革菌，发酵基质为金针菇菌渣和醋渣，共制成100g，发酵基质的组分比例和发酵方法见实施例1～6。
实施例1
发酵原料：金针菇菌渣和醋渣重量比为1∶1；
枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母或黄孢原毛平革菌；
发酵原料总质量为100g，接种量为5％，调节初始ph至7，发酵时间5天，放置于温度为25℃的光照培养箱中进行发酵，在0、1、2、3、4和5天取样，测定其粗蛋白含量，并记录，确定最优的单菌发酵菌种。
图1为接种量为5％，金针菇菌渣和醋渣重量比为1∶1，发酵时间5天，ph值7，发酵温度25℃时，研究枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黄孢原毛平革菌单菌发酵实验对发酵基质粗蛋白质含量的影响。结果表明，三种不同菌种发酵后粗蛋白质含量整体呈先上升后下降的趋势，均在发酵第3天达到峰值，枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黄孢原毛平革菌单菌三种菌在第3天粗蛋白质含量分别为14.1％，13.9％和14.9％。其中黄孢原毛平革菌发酵基质中的粗蛋白质含量最高。因此，以粗蛋白质含量作为蚯蚓饲料的评价标准，选择发酵终点为第3天。
实施例2
发酵原料：金针菇菌渣和醋渣重量比为1∶1；
发酵菌种：枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母比例为1∶1的混合菌液、枯草芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌比例为1∶1的混合菌液、热带假丝酵母和黄孢原毛平革菌比例为1∶1的混合菌液或热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌比例为1∶1∶1的混合菌液。优选的，所述菌种为热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌和黄孢原毛平革菌比例为1∶1∶1的混合菌液。
发酵原料总质量为100g，发酵时间5天，接种量为5％，调节初始ph至7，放置于温度为25℃的光照培养箱中进行发酵，在0、1、2、3、4和5天取样，测定其粗蛋白含量，并记录，确定最优的多菌发酵菌种。
如图2为接种量为5％，金针菇菌渣和醋渣重量比为1∶1，ph值7，发酵时间5天，发酵温度25℃时，研究枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黄孢原毛平革菌多菌发酵实验对发酵基质粗蛋白质含量的影响。结果表明混菌发酵过程中粗蛋白质含量的变化均存在着先上升后下降的趋势，同样在发酵第3天达到峰值，图2中可以看出以黄孢原毛平革菌、热带假丝酵母及枯草芽孢杆菌三菌比例为1∶1∶1的混合菌液发酵物中粗蛋白质含量最高，为18.5％，而热带假丝酵母菌与枯草芽孢杆菌比例为1∶1混合菌液，黄孢原毛平革菌与热带假丝酵母菌比例为1∶1混合菌液及黄孢原毛平革菌与枯草芽孢杆菌比例为1∶1的混合菌液发酵后粗蛋白质含量最高分别为16.4％，16.7％和16.5％。因此确定最优的发酵菌种为黄孢原毛平革菌、热带假丝酵母和枯草芽孢杆菌比例为1∶1∶1的混合菌液。
实施例3
发酵原料：金针菇菌渣和醋渣的重量比为10∶0、7∶3、1∶1、3∶7、0∶10；
发酵菌种：枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黄孢原毛平革菌比例为1∶1∶1的混合菌液；
发酵原料总质量为100g，发酵时间5天，接种量为5％，调节初始ph至7，放置于温度为25℃的光照培养箱中进行发酵，在0、1、2、3、4和5天取样，测定其粗蛋白含量，并记录，确定最优的金针菇菌渣与醋渣的发酵比例。
图3为接种量为5％，金针菇菌渣和醋渣的重量比为10∶0，7∶3，1∶1，3∶7，0∶10发酵时间5天，ph值7，发酵温度为25℃时，研究发酵原料不同比例在多菌发酵实验中对发酵基质粗蛋白质含量的影响。结果表明随着发酵比例中金针菇菌渣含量逐渐减少，食醋醋渣含量的逐渐增加，发酵产物中所含粗蛋白质含量呈先略微上升后持续下降的趋势，并且在菌渣与醋渣的比例在7∶3时达到了峰值，此时的粗蛋白质含量为16.7％，因此选择发酵原料最佳比例为菌渣：醋渣为7∶3。
实施例4
发酵原料：金针菇菌渣和醋渣的重量比为7∶3；
发酵菌种：枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黄孢原毛平革菌比例为1∶1∶1的混合菌液；
发酵原料总质量为100g，发酵时间5天，接种量为1、3、5、7或9％，调节初始ph值为7，放置于温度为25℃的光照培养箱中进行发酵，在0、1、2、3、4和5天取样，测定其粗蛋白含量，并记录，确定最优的多菌接种比例。
图4为金针菇菌渣和醋渣的重量比为7∶3，发酵时间5天，发酵温度为25℃时，ph值7，接种量为1％、3％、5％、7％和9％时，研究不同接种量在发酵实验中对发酵基质粗蛋白质含量的影响。结果表明随着接种量的升高，发酵基质中的蛋白质含量呈先升高再下降的趋势，在接种量为7％达到了峰值，此时的粗蛋白质含量是16.6％。因此确定最佳的接种量为7％。
实施例5
发酵原料：金针菇菌渣和醋渣重量比为7∶3；
发酵菌种：枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黄孢原毛平革菌比例为1∶1∶1的混合菌液；
发酵原料总质量为100g，发酵时间5天，接种量为5％，调节初始ph值为7，放置于温度为20、23、26、29或32℃的光照培养箱中进行发酵，在0、1、2、3、4和5天取样，测定其粗蛋白含量，并记录，确定最优的发酵温度。
图5为金针菇菌渣和醋渣重量比为7:3，发酵时间5天，混菌的接种量7％，ph值7，发酵温度控制在20、23、26、29和32℃时，研究不同温度在发酵实验中对发酵基质中的粗蛋白质含量的影响。结果表明随着发酵温度的升高，发酵基质中的粗蛋白质含量呈先上升后下降的趋势，并且在发酵温度在26℃时达到了峰值，此时的粗蛋白质含量是17.0％。因此确定最佳的发酵温度为26℃。
实施例6
发酵原料：金针菇菌渣和醋渣重量比为7∶3；
发酵菌种：枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黄孢原毛平革菌的比例为1∶1∶1的混合菌液；
发酵原料总质量为100g，发酵时间5天，接种量为5％，调节初始ph在5.5、6、6.5、7或7.5，放置于温度为25℃的光照培养箱中进行发酵，在0、1、2、3、4和5天取样，测定其粗蛋白含量，并记录，确定最优的发酵ph值。
图6为金针菇菌渣和醋渣重量比为7:3，发酵时间5天，混菌的接种量为7％，发酵温度控制在26℃，调节ph值为5.5、6、6.5、7和7.5时，研究不同ph值在发酵实验中对发酵基质中的粗蛋白质含量的影响。结果表明随着ph值的增加，发酵基质中的粗蛋白质含量随着ph的升高呈逐渐上升的趋势并且在ph值到7至7.5时趋于平缓，并且在ph在7.5时发酵产物粗蛋白质的含量最高为16.8％。因此选择最佳发酵值ph值为7.5。
实施例7
发酵基质用于蚯蚓养殖实验：
本实施例7以大平2号蚯蚓为实验对象，将10条蚯蚓投入到养殖器皿中，其中预先放置约1/3新鲜湿润的泥土，分别加入上述实验发酵产物即采用本发明所述方法制得的生长基质、未发酵的原料和普通泥土为蚯蚓饲料以干重50g，每组3个平行，保持湿度在60％，养殖温度在25℃，用孔径小于0.5mm的纱布封住养殖器皿口，防止蚯蚓逃脱，养殖9天，考察不同发酵产物对蚯蚓日增重、日繁殖数的影响，每隔3d记录成蚓数、幼蚓数和蚓茧数。同时以蚯蚓养殖业常用蚯蚓养殖饲料橘子果皮及青菜叶茎等作阳性对照。
根据实验结果发现，发酵基质组蚯蚓日增重倍数显著高于未发酵组蚯蚓日增重倍数和空白组蚯蚓日增重倍数(p＜0.05)，其发酵基质组蚯蚓日增重倍数为0.0463±0.0040，未发酵组蚯蚓日增重倍数为0.0264±0.0020，空白组蚯蚓日增重倍数为0.0301±0.0005。因此经过发酵后的金针菇菌渣和醋渣可用于饲养蚯蚓，并且效果优于金针菇菌渣直接饲养及传统饲养方法。
结论：
多菌发酵实验和不同发酵比例实验发现，最佳发酵菌种为黄孢原毛平革菌、热带假丝酵母和枯草芽孢杆菌的三菌液以1∶1∶1的比例混合，发酵原料金针菇菌渣∶醋渣的最佳比例为7∶3，最佳发酵时间为3天。
单因素试验获得固态发酵的最佳条件为：接种量7％，温度26℃，ph值7.5。
在上述最佳条件下获得粗蛋白质较高的发酵产物及生长基质，用于饲养蚯蚓，发现其日增重倍数显著高于未发酵组蚯蚓日增重倍数和空白组蚯蚓日增重倍数，且饲养效果优于金针菇菌渣直接饲养及传统饲养方法。
应当理解，虽然本说明书是按照各个实施例描述的，但并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
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