本发明涉及植物组织培养
技术领域：
，更具体的说是涉及一种肾蕨种苗的圆球体组织培养方法。
背景技术：
：我国有2600多种蕨类，其中中国特有500到600种，是世界上蕨类品种最多的国家。我国虽然拥有悠久的蕨类种植历史，但真正意义上现代化大规模种植蕨类植物，基本上是自2000年后的最近十几年开始的。目前市场上畅销的蕨类植物，分为肾蕨类、鸟巢蕨类、铁线蕨类。这三大蕨类所有品种的种苗几乎全部都是进口的。因为鸟巢蕨类、铁线蕨类很容易产生孢子，所以国内已经有许多公司能够繁殖这两类种苗。但由于肾蕨很难产生孢子，即使产生了孢子，也很难用播种孢子的方法大批的生产种苗，所以国内外肾蕨种苗的生产者都用组培的方法生产肾蕨种苗。目前国内多数肾蕨种苗生产者还是采用芽切芽的方式组培繁殖，这种繁殖方式的繁殖系数是4左右，系数低繁殖速度慢，生产周期长；且繁殖6代之后就会产生内生菌，需要重新采集外植体更新。因此，提供一种肾蕨种苗的圆球体组织培养方法，实现肾蕨种苗大规模产业化，提高肾蕨种苗的生产技术，是本领域技术人员亟需解决的问题。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种肾蕨种苗的圆球体组织培养方法，繁殖系数高，繁殖速度快，生产周期短，生产成本低。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种肾蕨种苗的圆球体组织培养方法，具体步骤如下：(1)处理接种外植体a、采集健康肾蕨匍匐茎尖端3厘米，将茎尖的绒毛用牙刷刷洗干净备用；b、将步骤a洗净的外植体用流水冲洗30-40分钟；c、切取1到2厘米长的茎尖，置于超净工作台中，用75％的酒精浸泡1-2分钟，无菌水冲洗一次；d、将步骤c冲洗后的外植体转入消毒水中浸泡2-3分钟，用无菌水冲洗4-6次；e、将步骤d冲洗后的外植体平铺到1号培养基中；(2)收集圆球体a、将外植体培养30-40天，愈伤组织开始生长，在愈伤组织周围逐渐长出来绿色的类似于孢子发芽形成的原叶体一样的小球，这些小球就是圆球体；继续培养20-25天，绿色小球增多变大；b、收集圆球体，接种到2号培养基，每培养瓶接种4到6粒；c、在2号培养基中继续培养30-40天，培养瓶中长满一层圆球体；d、将步骤c获得的圆球体分开接种到2号培养基中，每培养瓶接种4到6粒，继续繁殖圆球体母瓶，收集圆球体；(3)小苗生根待母瓶中的圆球体达到一定的数量，拿出80％用作生根处理，其余20％继续在2号培养基中作为母瓶扩繁；将80％的圆球体接种到3号培养基中，每培养瓶接种12个圆球体，培养30-40天，开始长出叶片和褐色的根系；培养至根系长好，株高达到3到5厘米，出瓶移栽到土壤基质中。进一步，步骤(1)所述消毒水由无菌水和84消毒水按照体积比4:1的比例配制而成。进一步，步骤(1)所述1号培养基为ms+ba2.0mg/l+naa0.5mg/l+活性炭1.0mg/l。进一步，步骤(2)所述2号培养基为ms+ba1.0mg/l+naa0.3mg/l+活性炭1.0mg/l。进一步，步骤(3)所述3号培养基为1/2ms+iba0.4mg/l+活性炭1.0mg/l。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种肾蕨种苗的圆球体组织培养方法，繁殖系数高达12，繁殖16代之后还没有产生内生菌；且繁殖速度快，生产周期短，生产成本大大降低，省时高效简单易操作，易于大规模生产，值得大力推广。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1一种肾蕨种苗的圆球体组织培养方法，具体步骤如下：(1)处理接种外植体a、采集健康肾蕨匍匐茎尖端3厘米，将茎尖的绒毛用牙刷刷洗干净备用；b、将步骤a洗净的外植体用流水冲洗30分钟；c、切取1到2厘米长的茎尖，置于超净工作台中，用75％的酒精浸泡1分钟，无菌水冲洗一次；d、将步骤c冲洗后的外植体转入消毒水中浸泡3分钟，用无菌水冲洗5次；其中消毒水由无菌水和84消毒水按照体积比4:1的比例配制而成；e、将步骤d冲洗后的外植体平铺到1号培养基中；其中1号培养基为ms+ba2.0mg/l+naa0.5mg/l+活性炭1.0mg/l；(2)收集圆球体a、将外植体培养30天，愈伤组织开始生长，在愈伤组织周围逐渐长出来绿色的类似于孢子发芽形成的原叶体一样的小球，这些小球就是圆球体；继续培养25天，绿色小球增多变大；b、收集圆球体，接种到2号培养基，每培养瓶接种4到6粒；c、在2号培养基中继续培养30天，培养瓶中长满一层圆球体；d、将步骤c获得的圆球体分开接种到2号培养基中，每培养瓶接种4到6粒，继续繁殖圆球体母瓶，收集圆球体；其中2号培养基为ms+ba1.0mg/l+naa0.3mg/l+活性炭1.0mg/l；(3)小苗生根待母瓶中的圆球体达到一定的数量，拿出80％用作生根处理，其余20％继续在2号培养基中作为母瓶扩繁；将80％的圆球体接种到3号培养基中，每培养瓶接种12个圆球体，培养30天，开始长出叶片和褐色的根系；培养至根系长好，株高达到3到5厘米，出瓶移栽到土壤基质中；其中3号培养基为1/2ms+iba0.4mg/l+活性炭1.0mg/l。实施例2一种肾蕨种苗的圆球体组织培养方法，具体步骤如下：(1)处理接种外植体a、采集健康肾蕨匍匐茎尖端3厘米，将茎尖的绒毛用牙刷刷洗干净备用；b、将步骤a洗净的外植体用流水冲洗40分钟；c、切取1到2厘米长的茎尖，置于超净工作台中，用75％的酒精浸泡2分钟，无菌水冲洗一次；d、将步骤c冲洗后的外植体转入消毒水中浸泡2分钟，用无菌水冲洗6次；其中消毒水由无菌水和84消毒水按照体积比4:1的比例配制而成；e、将步骤d冲洗后的外植体平铺到1号培养基中；其中1号培养基为ms+ba2.0mg/l+naa0.5mg/l+活性炭1.0mg/l；(2)收集圆球体a、将外植体培养40天，愈伤组织开始生长，在愈伤组织周围逐渐长出来绿色的类似于孢子发芽形成的原叶体一样的小球，这些小球就是圆球体；继续培养20天，绿色小球增多变大；b、收集圆球体，接种到2号培养基，每培养瓶接种4到6粒；c、在2号培养基中继续培养40天，培养瓶中长满一层圆球体；d、将步骤c获得的圆球体分开接种到2号培养基中，每培养瓶接种4到6粒，继续繁殖圆球体母瓶，收集圆球体；其中2号培养基为ms+ba1.0mg/l+naa0.3mg/l+活性炭1.0mg/l；(3)小苗生根待母瓶中的圆球体达到一定的数量，拿出80％用作生根处理，其余20％继续在2号培养基中作为母瓶扩繁；将80％的圆球体接种到3号培养基中，每培养瓶接种12个圆球体，培养40天，开始长出叶片和褐色的根系；培养至根系长好，株高达到3到5厘米，出瓶移栽到土壤基质中；其中3号培养基为1/2ms+iba0.4mg/l+活性炭1.0mg/l。实施例3比较本发明圆球体组培法与普通芽切芽组培方法的繁殖系数和内生菌的发生情况。(1)试验主要在增殖阶段，选取已经完成外植体阶段，进入母瓶增殖阶段的母瓶，每个组随机选取60瓶母瓶进行对照试验。(2)两种方法采用同一个配方：ms+ba1.0mg/l+naa0.3mg/l+活性炭1.0mg/l。(3)通过采用不同批次的母瓶接种到子瓶的数量，试验出两个不同方法的最大繁殖系数。(4)每繁殖一代随机抽取每个繁殖方法的100个子瓶观察，观察内生菌的发生情况；内生菌的发生率＝内生菌发生瓶数/抽查总数。a、繁殖系数试验结果接种30天后观察两种方法的子瓶生长情况，结果如表1和表2所示；其中繁殖系数＝子瓶数/母瓶数。表1芽切芽繁殖方法的繁殖系数统计试验组母瓶数子瓶数量繁殖系数30天后生长情况试验组110203良好试验组210404良好试验组310505良好试验组410606良好试验组510707较弱试验组610808很弱表2圆球体繁殖方法的繁殖系数统计试验组母瓶数子瓶数量繁殖系数30天后生长情况试验组110204良好试验组210408良好试验组3105010良好试验组4106012良好试验组5107014较弱试验组6108016很弱通过表1的统计数据分析，芽切芽组培繁殖方法的最佳繁殖系数是6；通过表2的统计数据分析，圆球体组培繁殖方法的最佳繁殖系数是12；表明本发明圆球体繁殖方法的繁殖系数远大于普通芽切芽繁殖方法。b、内生菌发生情况试验观察结果接种20到45天之间观察子瓶中内生菌的发生情况，随机抽取100瓶观察，发现开始有内生菌情况时开始记录，内生菌发生率是发生内生菌的瓶数除以所抽取的瓶数。表3是两种方法的内生菌发生情况统计，由于两种方法在前5代都没有发现内生菌，所以表3中只从第5代开始记录。表3芽切芽组培方法和圆球体组培方法内生菌发生情况统计表通过对表3的统计数据分析，两种方法的前5代都没有发生内生菌；从第6代开始芽切芽组培繁殖方法的子瓶中开出现内生菌，到第8代时已经达到30％，已经没有商业生产价值，但为了继续观察，一直坚持到第11代达到100％时不再接种。本发明圆球体繁殖方法从第17代子瓶中开始出现内生菌，到第19代时已经达到30％，已经没有商业生产价值。结果表明，本发明的圆球体繁殖方法，其内生菌发生时间远远晚于普通芽切芽的发生代数。上述结果表明，本发明肾蕨圆球体组培繁殖方法的繁殖系数高，较高的繁殖系数提高了每一次接种的生产效率；本发明肾蕨圆球体组培繁殖方法的内生菌发生时间远远晚于普通芽切芽的发生代数，内生菌在16代之后才出现，降低了反复采集外植体的频率，降低了消耗；表明圆球体繁殖肾蕨是比芽切芽繁殖好的一种组培方法，是一种非常有商业价值的繁殖方法。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。当前第1页12