一种高效创制异源八倍体银鲫的方法与流程

本发明属于鱼类遗传育种领域，具体是涉及一种高效创制异源八倍体银鲫的方法。
背景技术：
：杂交和多倍化能够为物种进化以及优良性状形成提供原始动力和物质基础。从理论上说，由于基因组倍性的增加，往往细胞尺寸会随之增加，多倍体常常表现出比二倍体近亲生长更快，营养器官或个体更大。作为一种经典、且卓有成效的细胞工程育种技术，多倍体育种(polyploidbreeding)已广泛地运用于动植物育种中，包括在养殖鱼类和贝类的品种选育中。在水产养殖动物中，成功的范例有三倍体太平洋牡蛎以及从鲤科和鲑科等天然多倍体鱼类中合成的同源或异源多倍体。因此，优化或发展新的、高效的倍性操作技术，创制优异种质，为新品种培育提供核心育种材料，仍然是水产养殖动物遗传育种的重要方向之一。异育银鲫(carassiusgibeliobloch)是我国重要的大宗淡水养殖种类之一，近几年银鲫和其它鲫鱼一起年总产量已接近300万吨。银鲫能进行天然雌核发育生殖，在由兴国红鲤提供精子人工繁殖的异源银鲫群体中，已经发现了少数(约0.2％)既保持了银鲫全套染色体组同时又整合了一套红鲤染色体组的人工合成异源八倍体银鲫，从而展现了银鲫整合外源基因组的能力。这种独特的能力可为异育银鲫新品种选育创制优异种质。譬如，异育银鲫“中科5号”是从渗入有团头鲂精子微小染色体片段、性状发生明显改变的育种核心群体，经连续十代雌核生殖选育而来；“长丰鲫”是d系银鲫卵子融入了一套兴国红鲤精子的染色体组发育而来。但由于异源的精子进入银鲫卵质后，不解凝且呈固缩状态，所以通过异精雌核生殖自发形成异源八倍体子代数率仅为0.2-0.33％，这也导致在育种中筛选鉴定异源八倍体工作量非常大。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提供一种高效创制异源八倍体银鲫的方法。为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：一种高效创制异源八倍体银鲫的方法，包括人工授精阶段，所述人工授精阶段包括以下操作步骤：步骤1，配置胰蛋白酶溶液：将胰蛋白酶粉末加入到精子保存液中混匀获得胰蛋白酶溶液，每100ml精子保存液中加入所述胰蛋白酶粉末0.9-1.1g；步骤2，精液处理：将白鲫的成熟精液加入到上述胰蛋白酶溶液中并在22-24℃条件下处理13-17min；步骤3，授精孵化：将经过步骤2处理的精液与异育银鲫的成熟卵子进行干法授精，所得受精卵进行孵化获得异源八倍体银鲫。进一步的技术方案：所述精子保存液配方为：nacl7.5-8.5g/l、kcl0.3-0.5g/l、cacl20.12-0.16g/l、mgso4·7h2o0.1-0.3g/l、na2hpo4·h2o0.04-0.08g/l、kh2po40.04-0.08g/l、nahco30.33-0.37g/l、葡萄糖0.9-1.1g/l；所述精子保存液ph＝7.0-7.2。进一步的技术方案：所述孵化方式为将受精卵置于白瓷盘中孵化且每12小时换一半水，或将受精卵置于网片上放入水箱中充氧孵化。进一步的技术方案：该方法还包括异育银鲫亲本培育与繁殖阶段，所述异育银鲫亲本培育与繁殖阶段包括以下步骤：步骤1，下塘准备：在冬季，亲本下塘前先对亲本培育塘进行干塘消毒，杀灭杂鱼，然后向亲本培育塘重新灌入新水，同时在亲本培育塘进水口设置隔离网套以防止杂鱼混入培育塘；步骤2，亲本培育：亲本下塘前进行雌雄筛选，淘汰雄鱼；开春后将亲本培育塘水深提高至1.5-2.0米；亲本培育过程中饲料的投喂量按照亲本体重总量的2-4％计算；亲本培育过程中向亲本培育塘中泼洒腐熟的有机肥每次3000-4500kg/hm2或发酵的em菌溶液1200毫升/亩/7-15天，降低水体溶解氧至2-4mg/l；在亲本培育塘水温在16-22℃时，采用拉网的形式促进亲本产卵，拉网时避免对亲本造成伤害，拉网捕获的亲本通过成熟度辨认，对卵巢发育至四期中期以及之后的亲本立即进行催产，对卵巢发育至四期初期的亲本转养至室内做催产繁殖准备；步骤3，催产：采用1ug/kg地欧酮+1mg/kg脑垂体+500国际单位/kg人绒毛膜促性腺激素+5ug/kg促排卵素的混合液对亲本进行注射催产，注射催产后的亲本放入室内恒温21℃流水的缸内等待产卵。进一步的技术方案：该方法还包括孵化后子代的倍性检测方式，所述倍性检测方式包括以下步骤：步骤1，取血：针对长度达到1.5cm的鱼苗采用断尾取血0.1μl，针对达到六月龄的鱼苗采用剪鳍取血0.1μl；步骤2，检测：将所采新鲜血液置于200μl经4℃预冷的cystaindna1step溶液中混匀后，放置冰上，并利用流式细胞仪进行dna含量检测。进一步的技术方案：白鲫父本按上述混合液三分之一的剂量注射催产，所述白鲫父本为2龄以上健壮个体，体重在300-500g。进一步的技术方案：所述亲本培育过程中，针对3月会出现温度骤升地区，则在气温16-20℃时将亲本分缸暂养在室内18-22℃循环水体内，再进行后续催产。本发明的有益效果在于：(1)本发明通过精子保存液，同时用胰蛋白酶处理精子，使精子解凝，实现异源精子(白鲫)成功整合到异育银鲫卵子中，形成异源八倍体，并通过设置适宜的胰蛋白酶浓度和处理时间，从而进一步获得高比例的异源八倍体银鲫，本发明异源八倍体形成率高达16.8％，异源八倍体银鲫的成活率为2.4±0.7％。(2)本发明所述精子保存液用灭菌h2o配置，该精子保存液配方经调制后既可以用于保存精子，又可以使胰蛋白酶发挥活性。(3)关于孵化方式：所述网片为不锈钢框架，正反两面均为密眼网片，材质一般为聚乙烯。鱼卵粘附在网片上后，将网片放入水箱中，充氧孵化。该操作的优点是孵化水体大，孵化过程不用换水。所述白瓷盘为医用实验盘，将鱼卵铺在白瓷盘中，加水孵化，每隔12小时换一半水。该孵化方法的优点是：可以随时观察到鱼卵的发育形态，定时将死卵剔除出去，以免败坏水质影响正常鱼卵的孵化。(4)本发明所述异育银鲫亲本培育与繁殖阶段是获得高比例的异源八倍体银鲫的基础，其中每个步骤的优点如下：在养殖塘进水口设置隔离网套，主要是防止杂鱼混入培育塘，从而避免繁殖季节杂鱼精子刺激异育银鲫亲本造成流产。亲本下塘前进行雌雄筛选的作用在于淘汰雄鱼，以免雄鱼在春季刺激雌鱼，导致雌鱼流产。开春后将亲本培育塘水深提高至1.5-2.0米的作用在于避免水温上升过快而导致亲本流产。向亲本培育塘中泼洒腐熟的有机肥或em菌溶液可以保证养殖塘水中有丰富的活体饵料。关于降低水体溶解氧的控制既保证了亲本性腺发育的需要，又不会使得亲本提早流产。拉网能够促进亲本产卵，但是拉网时采用“上层拉网，不睬底线”的方式，避免对亲本造成刺激而导致流产。在长江中下游地区，经常会在3月中下旬出现连续几天的突然升温，会导致亲本的流产。所以为了保证亲本的充分成熟并避免流产现象发生，在气温16-20℃时将亲本分缸暂养在室内18-22℃恒温循环水体内。由于亲本培育时，丰富活体饵料给予了足够的营养，低容氧量又不足以过度成熟，从而使得亲本在室内暂养一个半月时间，仍可以进行催产繁殖。本发明对亲本实施催产实现亲本产卵的同步性，从而利于开展大规模的苗种繁殖。本发明注射催产后的亲本放入室内恒温21℃流水的缸内的效应期为10小时左右，便于后续繁殖操做的安排。本发明所述催产剂量以及催产温度的优点：避免了水温对效应期的影响，易于把握产卵时间，好合理安排后续繁殖操作；该催产药物配伍，能够使得亲本卵子的成熟度均匀，为繁殖提供了优质的卵子。(5)本发明倍性检测方式取血量少，剪鳍条取血的方法操作方便，而且能够不杀死检测得到的八倍体鱼。本发明将混合好的检测样品放置在冰上，可以存放六个小时，这为取样检测提供了充足的时间支撑，同时放置在冰上能够提高仪器的检查成功率，从而大大提高了检测效率。附图说明图1中a部分为母本异育银鲫a+系、父本白鲫和银鲫新八倍体的形态图。图1中b部分为母本异育银鲫a+系、父本白鲫和银鲫异源八倍体外周血dna含量直方图。图1中c部分为母本异育银鲫a+系、父本白鲫和银鲫异源八倍体有丝分裂中期分裂相图。具体实施方式下面结合实施例对本发明技术方案做出更为具体的说明：本发明高效创制异源八倍体银鲫的方法，包括异育银鲫亲本培育与繁殖阶段、人工授精阶段以及孵化后子代的倍性检测方式。关于异育银鲫亲本培育与繁殖阶段：实施例1步骤1，下塘准备：在冬季，亲本(品种：异育银鲫a+系)下塘前先对亲本培育塘进行干塘消毒，杀灭杂鱼，然后向亲本培育塘重新灌入新水，同时在亲本培育塘进水口设置隔离网套以防止杂鱼混入培育塘；步骤2，亲本培育：亲本下塘前进行雌雄筛选，淘汰雄鱼；开春后将亲本培育塘水深提高至1.8米；亲本培育过程中饲料的投喂量按照亲本体重总量的3％计算；亲本培育过程中向亲本培育塘中泼洒腐熟的有机肥每次4000kg/hm2，降低水体溶解氧至3mg/l；在亲本培育塘水温在20℃时，采用拉网的形式促进亲本产卵，拉网时避免对亲本造成伤害，拉网捕获的亲本通过成熟度辨认，对卵巢发育至四期中期以及之后的亲本立即进行催产，对卵巢发育至四期初期的亲本转养至室内做催产繁殖准备；步骤3，催产：采用1ug/kg地欧酮+1mg/kg脑垂体+500国际单位/kg人绒毛膜促性腺激素+5ug/kg促排卵素的混合液对亲本进行注射催产，注射催产后的亲本放入室内恒温21℃流水的缸内等待产卵。白鲫父本(选自南宁地区)按上述混合液三分之一的剂量注射催产，所述白鲫父本为2龄以上健壮个体，体重在400g左右。实施例2步骤1，下塘准备：在冬季，亲本(品种：异育银鲫a+系)下塘前先对亲本培育塘进行干塘消毒，杀灭杂鱼，然后向亲本培育塘重新灌入新水，同时在亲本培育塘进水口设置隔离网套以防止杂鱼混入培育塘；步骤2，亲本培育：亲本下塘前进行雌雄筛选，淘汰雄鱼；开春后将亲本培育塘水深提高至1.5米；亲本培育过程中饲料的投喂量按照亲本体重总量的2％计算；亲本培育过程中向亲本培育塘中泼洒腐熟的有机肥每次3000kg/hm2，降低水体溶解氧至4mg/l；在亲本培育塘水温在16℃时，采用拉网的形式促进亲本产卵，拉网时避免对亲本造成伤害，拉网捕获的亲本通过成熟度辨认，对卵巢发育至四期中期以及之后的亲本立即进行催产，对卵巢发育至四期初期的亲本转养至室内做催产繁殖准备；步骤3，催产：采用1ug/kg地欧酮+1mg/kg脑垂体+500国际单位/kg人绒毛膜促性腺激素+5ug/kg促排卵素的混合液对亲本进行注射催产，注射催产后的亲本放入室内恒温21℃流水的缸内等待产卵。白鲫父本按上述混合液三分之一的剂量注射催产，所述白鲫父本为2龄以上健壮个体，体重在300g左右。实施例3步骤1，下塘准备：在冬季，亲本(品种：异育银鲫a+系)下塘前先对亲本培育塘进行干塘消毒，杀灭杂鱼，然后向亲本培育塘重新灌入新水，同时在亲本培育塘进水口设置隔离网套以防止杂鱼混入培育塘；步骤2，亲本培育：亲本下塘前进行雌雄筛选，淘汰雄鱼；开春后将亲本培育塘水深提高至2.0米；亲本培育过程中饲料的投喂量按照亲本体重总量的4％计算；亲本培育过程中向亲本培育塘中泼洒发酵的em菌溶液1200毫升/亩/10天，降低水体溶解氧至2mg/l；本实施例实施在长江中下游地区，3月中下旬出现了温度骤升，则在气温18℃左右时将亲本分缸暂养在室内18-22℃循环水体内，再进行后续催产。步骤3，催产：采用1ug/kg地欧酮+1mg/kg脑垂体+500国际单位/kg人绒毛膜促性腺激素+5ug/kg促排卵素的混合液对亲本进行注射催产，注射催产后的亲本放入室内恒温21℃流水的缸内等待产卵。白鲫父本按上述混合液三分之一的剂量注射催产，所述白鲫父本为2龄以上健壮个体，体重在500g左右。关于催产前亲本成熟度的判断标准如下：异育银鲫亲本(母本)一般腹部柔软，膨大，卵巢轮廓清晰，生殖孔微红，而生殖孔很红的亲本已经自行流产，应该剔除掉。有时需要更加准确地鉴别异育银鲫亲本的成熟度，可采用挖卵器挖卵检查。将取卵器缓缓插入生殖孔内，然后向左或右偏少许，旋转几下轻轻抽出，即可取出少量卵粒，然后加入少量固定透明液，浸泡2-3分钟后观察卵核位置。若全部或大部分卵粒的核位偏心或极化，则表明亲本成熟度好，适合马上进行催产繁殖；若白色的细胞核居中央位置，则该亲本性成熟差，还需进一步培育成熟；若大部分卵粒无白色的核出现，则多为退化卵，不适合再进行繁殖。本发明对母本成熟度的判定标准为：轻挤母本生殖孔附近的腹部，若挤出的四期卵母细胞是分离的、一粒一粒的(表明母本卵巢发育至四期中期以及之后)，即可催产；若挤出的是未分离的成团的(表明母本卵巢发育至四期初期)，则还需再饲养7-15天。本发明的父本，选自南宁的白鲫，为2龄以上，体重300-500克，个体健壮的纯系品种。成熟的白鲫亲本一般在胸鳍、腹鳍和鳃盖有明显的“追星”，生殖孔略凹下，轻压腹部时，有乳白色稠状精液流出，表明雄鱼成熟度较好。所述人工授精阶段包括以下操作步骤：实施例4步骤1，配置胰蛋白酶溶液：将胰蛋白酶粉末加入到精子保存液中混匀获得胰蛋白酶溶液，每100ml精子保存液中加入所述胰蛋白酶粉末1.0g；所述精子保存液配方为：nacl8.0g/l、kcl0.4g/l、cacl20.14g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、na2hpo4·h2o0.06g/l、kh2po40.06g/l、nahco30.35g/l、葡萄糖1.0g/l；所述精子保存液ph＝7.1。步骤2，精液处理：将白鲫的成熟精液加入到上述胰蛋白酶溶液中并在20℃条件下处理15min；步骤3，授精孵化：将经过步骤2处理的精液(来源于实施例1中白鲫)与异育银鲫的成熟卵子(来源于实施例1中“异育银鲫a+系”)进行干法授精，所得受精卵进行孵化获得异源八倍体银鲫。所述孵化方式为将受精卵置于白瓷盘中孵化且每12小时换一半水。实施例5步骤1，配置胰蛋白酶溶液：将胰蛋白酶粉末加入到精子保存液中混匀获得胰蛋白酶溶液，每100ml精子保存液中加入所述胰蛋白酶粉末0.9g；所述精子保存液配方为：nacl7.5g/l、kcl0.3g/l、cacl20.12g/l、mgso4·7h2o0.1g/l、na2hpo4·h2o0.04g/l、kh2po40.04g/l、nahco30.33g/l、葡萄糖0.9g/l；所述精子保存液ph＝7.0。步骤2，精液处理：将白鲫的成熟精液加入到上述胰蛋白酶溶液中并在22℃条件下处理13min；步骤3，授精孵化：将经过步骤2处理的精液(来源于实施例2中白鲫)与异育银鲫的成熟卵子(来源于实施例2中“异育银鲫a+系”)进行干法授精，所得受精卵进行孵化获得异源八倍体银鲫。所述孵化方式为将受精卵置于网片上放入水箱中充氧孵化。实施例6步骤1，配置胰蛋白酶溶液：将胰蛋白酶粉末加入到精子保存液中混匀获得胰蛋白酶溶液，每100ml精子保存液中加入所述胰蛋白酶粉末1.1g；所述精子保存液配方为：nacl8.5g/l、kcl0.5g/l、cacl20.16g/l、mgso4·7h2o0.3g/l、na2hpo4·h2o0.08g/l、kh2po40.08g/l、nahco30.37g/l、葡萄糖1.1g/l；所述精子保存液ph＝7.2。步骤2，精液处理：将白鲫的成熟精液加入到上述胰蛋白酶溶液中并在24℃条件下处理17min；步骤3，授精孵化：将经过步骤2处理的精液(来源于实施例3中白鲫)与异育银鲫的成熟卵子(来源于实施例3中“异育银鲫a+系”)进行干法授精，所得受精卵进行孵化获得异源八倍体银鲫。所述孵化方式为将受精卵置于白瓷盘中孵化且每12小时换一半水。对于上述胰蛋白酶溶液浓度以及精液处理时间，由相关的平行实验来确定获得。本发明通过实验发现过高或过低的胰蛋白酶溶液浓度以及过长或过短的精液处理时间，会同时对鱼苗成活率以及异源八倍体数率指标带来不良影响，而本发明提供的胰蛋白酶溶液浓度以及精液处理时间则是同时有利于获得理想的鱼苗成活率与异源八倍体数率指标。实施例7关于倍性检测方式：步骤1，取血：针对长度达到1.5cm的鱼苗采用断尾取血0.1μl，针对达到六月龄的鱼苗采用剪鳍取血0.1μl；步骤2，检测：将所采新鲜血液置于200μl经4℃预冷的cystaindna1step(来源：德国partec)溶液中混匀后，放置冰上，并利用流式细胞仪进行dna含量检测。本发明对实施例4、5、6中孵化所得子代进行倍性检测的结果以及获得的八倍体鱼苗的成活率的结果如下：组别实施例4实施例5实施例6成活率3.i2.82.4异源八倍体数率16.816.516.3备注：成活率＝(开始摄食时正常的鱼苗尾数/总授精鱼卵数)×100％异源八倍体数率＝(八倍体鱼苗数/所检测的总鱼苗尾数)×100％当前第1页12