一种利用去离子甲酰胺促进杉木体胚发生的方法与流程

本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种利用去离子甲酰胺(formamidedeionized，fd)促进杉木体胚发生的方法。

背景技术：

杉木(cunninghinalanceolata)隶属于杉科杉木属，是我国重要用材树种之一，其生长快、干形通直圆满，材质轻软细致，易加工，纹理美观，有特殊香气，不翘不裂，抗蛀耐腐，是建筑、家具、桥梁、造船、造纸及木纤维等工业的优良原材料[任海青，黄安民，刘君良，费本华.杉木加工利用研究进展及建议[j].木材工业，2006(01)：25-27.]。目前，主要通过三种途径繁殖杉木种苗：种子、扦插和传统组织培养[温亚锋.基于未成熟合子胚的杉木胚性组织诱导和继代的研究[d].福建农林大学，2011.]，但是良种种子产量、种子播种品质不稳定，第2代以上高级良种供应不足，且种子播种品质差，尤其是种子涩粒多，通常占重量的40％～60％[郑仁华.杉木遗传育种研究进展与对策[j].世界林业研究，2005(03)：63-65.]；而扦插育苗则受到母树穗条的多少、场地空间及生根率等方面的限制，其规模很难满足现代林业生产对杉木种苗的大量需求；此外，传统的组织培养根的诱导较为困难，诱导出的根数量少且弱，在一定程度上影响了苗木质量和造林的成功率。因此建立高效率的杉木未成熟胚的胚胎发生体系，有利于加快杉木速生优苗的产业化发展。

体细胞胚发生属于无性繁殖技术，生产出的种苗遗传背景差异小，苗木整齐。与扦插和传统组织培养相比，其规模更大、成本更低。采用未成熟的合子胚为外植体，进行体细胞胚胎发生的研究，研究表明，当未成熟合子胚处于胚胎选择阶段和优势胚阶段时，能够进行高频的体胚发生[宋春雷.杉木体细胞胚胎发生研究[a].中国林学会林木遗传育种分会.第六届全国林木遗传育种大会论文集[c].中国林学会林木遗传育种分会：，2008：2.]。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种利用去离子甲酰胺促进杉木体胚发生的方法，有效促进杉木体胚发生，缩短体胚发生时间。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种利用去离子甲酰胺促进杉木体胚发生的方法，取继代状态良好的胚性愈伤组织接种到体胚诱导培养基上，于培养箱中进行暗培养，诱导促进杉木体胚发生；其中，体胚诱导培养基：以1/2dcr为基本培养基，附加有浓度不超过0.1134g/l的fd。

所述的利用去离子甲酰胺促进杉木体胚发生的方法，体胚诱导培养基：以1/2dcr为基本培养基，附加有浓度不超过0.1134g/l的fd、5mg/lga、0.45g/l谷氨酰胺、0.2g/l天冬氨酸、0.2g/l脯氨酸、5g/l肌醇、0.5g/l水解洛蛋白、170g/lpeg、2g/l活性炭、2.4g/l水晶洋菜、30g/l麦芽糖，ph为6.0。

所述的利用去离子甲酰胺促进杉木体胚发生的方法，体胚诱导培养基：以1/2dcr为基本培养基，附加有浓度不超过0.1134g/l的fd、6mg/laba、5mg/lga、0.45g/l谷氨酰胺、0.2g/l天冬氨酸、0.2g/l脯氨酸、5g/l肌醇、0.5g/l水解洛蛋白、170g/lpeg、2g/l活性炭、2.4g/l水晶洋菜、30g/l麦芽糖，ph为6.0。

所述的利用去离子甲酰胺促进杉木体胚发生的方法，体胚诱导培养基中附加有浓度为0.1134g/l的fd。

所述的利用去离子甲酰胺促进杉木体胚发生的方法，诱导培养35天以上。

有益效果：与现有技术相比，本发明的用去离子甲酰胺促进杉木体胚发生的方法，试验结果表明低浓度的fd可以加快杉木体胚的发生，高浓度的fd会导致杉木胚性愈伤组织褐化死亡。fd浓度为1.1134g/l和11.34g/l的胚性愈伤组织在接种后两周左右褐化死亡，5周左右，浓度为0.1134g/l的胚性愈伤组织开始长出子叶胚，7周左右，浓度为0.01134g/l的胚性愈伤组织开始长出子叶胚，而不加fd的对照组开始长出子叶胚需要8周左右，可有效缩短体胚发生时间，具有很好的实用性。

附图说明

图1是杉木继代愈伤组织图；图中，a：01a1的胚性愈伤组织；图b：01a1胚性愈伤组织的胚性胚柄团结构；

图2是fd处理下的愈伤组织在不同时间的段的状态图；

图3是fd处理下的愈伤组织在不同时间段的胚性胚柄团结构图；

图4是fd处理下的体胚状态图(56天)；

图5是fd添加处理下诱导出的体胚状况图；注：不同字母表示在α＝0.05时的水平差异显著。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下实施例中所使用的材料，如图1所示，为生长良好的杉木继代愈伤组织(基因型为01a1的球果来源于福建洋口林场)，胚性愈伤组织大部分为白色透明、表面晶亮有光泽、质地松软粘连，表面具有明显早期原胚(图1a)，倒置显微镜观察其胚性胚柄团结构具有明显致密胚头结构和疏松胚柄结构(图1b)。

实施例1

体胚诱导培养基：以1/2dcr为基本培养基，附加不同浓度的fd(0g/l、0.01134g/l、0.1134g/l、1.134g/l、11.34g/l)、5mg/lga、0.45g/l谷氨酰胺、0.2g/l天冬氨酸、0.2g/l脯氨酸、5g/l肌醇、0.5g/l水解洛蛋白、170g/lpeg、2g/l活性炭、2.4g/l水晶洋菜、30g/l麦芽糖，并调ph为6.0。取继代20天左右状态良好的胚性愈伤组织接种到培养基上，每种浓度接种杉木愈伤组织3-6皿，即3-6个重复，每皿6块愈伤。于23℃培养箱中进行暗培养。在体胚诱导不同时间点对胚性胚柄团进行形态学观察，并统计体胚诱导个数。

统计每皿的体胚发生数目进行分析，使用graphpadprismversion6.0(graphpadsoftware，lajolla，ca，usa)对试验数据进行统计处理并制表作图，并进行单因素方差分析(onewayanova)检验各处理组数据与对照组的差异，平均值的比较采用duncan多重比较检验，显著性水平设为α＝0.05一个水平，图表中所示数据均为重复测定的平均值和标准误差。

将继代培养的胚性愈伤组织01a1转接到体胚诱导培养基上，7天左右胚性愈伤组织微微变黄，胚性胚柄团结构无明显变化；14天左右愈伤组织在颜色和形态上差异较大，颜色逐渐变黄，质地变密，胚性胚柄团胚头开始变得致密。fd浓度为1.134g/l和11.34g/l的愈伤组织在21天左右趋于死亡，而fd浓度在0g/l～0.1134g/l的范围内，胚性胚柄团结构致密程度越来越高。但是愈伤存活逐渐变少。fd浓度为0.1134g/l的愈伤在35天左右长出子叶胚；0.01134g/l处于子叶胚前期；0g/l胚性胚柄团胚头拉长，十分致密(图2、图3)。

fd浓度为0.1134g/l的愈伤在35天长出子叶胚；同时fd浓度为0.01134g/l的愈伤处于子叶胚前期；49天左右，fd浓度为0.01134g/l的愈伤长出子叶胚，同时，未添加fd的愈伤处于子叶胚前期；56天左右，未添加fd的愈伤开始长出子叶胚(图4)。

实施例2

体胚诱导培养基：以1/2dcr为基本培养基，附加不同浓度的fd(0g/l、0.01134g/l、0.1134g/l、1.134g/l、11.34g/l)、6mg/laba、5mg/lga、0.45g/l谷氨酰胺、0.2g/l天冬氨酸、0.2g/l脯氨酸、5g/l肌醇、0.5g/l水解洛蛋白、170g/lpeg、2g/l活性炭、2.4g/l水晶洋菜、30g/l麦芽糖，并调ph为6.0。取继代20天左右状态良好的胚性愈伤组织接种到培养基上，每种浓度接种杉木愈伤组织3-6皿，即3-6个重复，每皿6块愈伤。于23℃培养箱中进行暗培养。在体胚诱导不同时间点对胚性胚柄团进行形态学观察，并统计体胚诱导个数。

统计不同浓度的fd处理的体胚诱导数目，对于fd浓度为0g/l、0.01134g/l、0.1134g/l均能诱导出一定浓度的体胚，而fd浓度为1.1134g/l、11.34g/l时，胚性愈伤组织在三周左右趋于死亡，不能诱导出体胚。当浓度为0g/l时，平均每皿诱导出体胚20个(60天)，当浓度为0.01134g/l时，平均每皿诱导出体胚16.5个(50天)，当浓度为0.1134g/l时，平均每皿诱导出体胚10.8个(35天)。差异显著性分析结果如图5所示，在α＝0.05的显著性水平上，fd浓度为0g/l和0.01134g/l时，体胚发生数目没有显著差异，而fd浓度为0g/l和0.01134g/l与fd浓度为0.1134g/l的体胚发生数目有显著差异(图5)。

在0g/l～0.1134g/l的范围内，随着fd浓度的增加，体胚发生的速度明显加快，即fd具有明显促进杉木体胚的发生。在0g/l～0.1134g/l的范围内，随着fd浓度的增加，体胚发生的数量也明显下降，但诱导出体胚的时间明显缩短。当fd的浓度大于1.134g/l时，两周后，体胚逐渐褐化死亡。