葶苈子挥发油的新用途的制作方法

本发明涉及葶苈子挥发油的用途，尤其涉及葶苈子挥发油对中药材或作物根腐病及对中药材或作物地上部多种病害的防治作用，属于生物农药技术领域。

背景技术：

化学药剂是对微生物有抑制作用的药剂，根据作用性质可将化学药剂分杀菌剂和抑菌剂，抑菌剂并不破坏微生物的原生质，而只是阻抑新细胞物质的合成，使微生物不能增殖；微生物种类、化学药剂处理微生物的时间长短、温度高低以及微生物所处环境等，都影响着化学药剂杀菌或抑菌的能力和效果；化学药剂的过量使用不仅在经济上造成浪费，大大增加了农民的投入成本，更严重污染了土壤和降低了药材品质，存在“3r”(残留、抗药性和再生)问题；

植物挥发油是存在于植物中的一类具有芳香气味、可随水蒸气蒸馏出来而又与水不相混溶的挥发性油状成分，挥发油为一混合物，其组份较为复杂，挥发油成分中以萜类成分多见，另外，尚含有小分子脂肪族化合物和小分子芳香族化合物；植物挥发油不仅用于传统医药、食品、烟草、酒精和烟草，还可用于植物保护(杀虫、抑菌、除草等)，植物挥发油作为植物源农药应用于植物保护领域，与建议的无公害农药理念一致。从这个意义上说，植物挥发油也可以被归类为第三代农药。

葶苈子是十字花科植物，独行菜lepidiumapetalumwilld.的干燥成熟种子，习称“北葶苈子”，具有泻肺降气，祛痰平喘，利水消肿，泄热逐邪之功效。

目前，未见与本发明技术方案相关的文献公开。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种葶苈子挥发油的新用途，即其在防治中药材或作物根腐病中的应用；所述致病菌为尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、腐皮镰刀菌(fusariumsolani)、腐霉(pythiumaphanidermatum)、毁坏柱孢霉(cylindrocarpondestructans)等

本发明葶苈子挥发油还可应用在防治导致中药材或作物地上部发生病害的致病菌中；所述致病菌为灰霉菌(botrytiscinerea)、胶孢炭疽菌(colletotrichumgloeosporioides)、立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)等。

本发明所述的葶苈子挥发油的用途，是将葶苈子挥发油用作制备防治中药材或作物根腐病或者防治引起中药材或作物地上部发生病害的致病菌的制剂，即以葶苈子挥发油为活性成分，在制备防治致病菌制剂中的应用。

本发明所述防治致病菌制剂的成分(或有效成分)为葶苈子挥发油，还可以加入一种或多种中药和农作物病害防治制剂上可接受的辅料，或者与其他活性成分复配发挥协同抑菌作用。

葶苈子挥发油可以通过现有技术设备制备成各种剂型的农药或各种形态的化肥。

本发明中葶苈子挥发油是通过常规水蒸气蒸馏法提取，无水硫酸钠干燥挥发油而制得，该制备方法简单，所需试剂成本低，有利于大量生产。

葶苈子挥发油作为一种天然的杀菌活性物质，在使用后其活性消失或被微生物分解，对环境无污染，对人畜安全；由于葶苈子挥发油是植物源提取物，其有效成分复杂多样，对病原菌为多成分多靶点的作用机制，使得靶标生物不易产生对某种或某几种成分产生抗药性，从而获得持久的防治效果；与化学合成农药相比，葶苈子挥发油的有效成分易挥发、易降解，抑菌而不杀菌，因此不易对其它有益微生物造成危害，改善土壤微生态结构，促进植物与微生物协同进化，保护生态环境，提高中药材或作物的品质。

葶苈子挥发油可通过抑制病原菌孢子萌发和菌丝生长来降低植物发病率和病情指数。

配制50mg/ml的葶苈子挥发油溶液，溶剂为含有体积浓度1％的dmso和体积浓度0.1％的吐温80的水溶液，测试葶苈子挥发油对三七根腐病发生的4种主要致病菌尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、腐皮镰刀菌(fusariumsolani)、腐霉(pythiumaphanidermatum)和毁坏柱孢霉(cylindrocarpondestructans)的作用，以及导致三七地上部病害发生的3种致病菌灰霉菌(botrytiscinerea)、胶孢炭疽菌(colletotrichumgloeosporioides)、立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)菌丝生长的作用；结果显示葶苈子挥发油对7种病原菌具有广谱的抑菌作用且抑菌率高，无论对地上部分真菌还是地下部分真菌抑制率都达到了100％，对孢子萌发和菌丝生长有抑制作用，活体实验结果显示挥发油能有效抑制三七植株上的尖孢镰刀菌的生长。

本发明葶苈子挥发油具有投入低、制备方法简单、使用方便、效率高、易挥发、低毒、低残留的特点；在国家大力发展有机农业的大背景下，葶苈子发油是比较理想的克服三七病害的化学药剂替代品，对农业的可持续发展具有重要意义，在农业生产中有较广阔的应用前景。

附图说明

图1是葶苈子挥发油对三七病原菌尖孢镰刀菌(1)、腐皮镰刀菌(2)、毁坏柱孢霉(3)、腐霉(4)、灰霉菌(5)、胶孢炭疽菌(6)、立枯丝核菌(7)生长的抑制作用结果；

图2是葶苈子挥发油以及恶霉灵对三七七种病原菌菌落生长的抑制率结果；

图3为葶苈子挥发油活体试验中三七幼苗长势图，其中a为葶苈子挥发油处理组；b为阳性对照组；c为阴性对照。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1：葶苈子挥发油的制备

(1)在100g切碎的葶苈子皮中添加其质量8倍的水，浸泡2h，采用加热蒸馏的方式，利用水蒸气提取葶苈子中的挥发油，提取时间为6h，冷凝收集溜出液；

(2)提取出来的溜出液用无水硫酸钠干燥，除去所含水分，即得葶苈子挥发油，放进棕色样品瓶里，密封，-20℃保存待用。

实施例2：致病菌的活化

(1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼20g、蒸馏水1000ml；

(2)对分离自三七根部和地上部的致病菌进行纯化鉴定，鉴定为尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、腐皮镰刀菌(fusariumsolani)、腐霉(pythiumaphanidermatum)、毁坏柱孢霉(cylindrocarpondestructans)、灰霉菌(botrytiscinerea)、胶孢炭疽菌(colletotrichumgloeosporioides)和立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)，将上述菌种接种在pda培养基上进行活化，接种3～4次后，取生长旺盛的菌株备用。

实施例3：gc-ms测定葶苈子挥发油的化学组分

(1)gc条件：仪器型号：agilengttechnologies7890b-5977b；色谱柱：hp-5ms30m×250μm×0.25μm；

(2)ei源电离源温度：230℃；四级杆温度：150℃；扫描范围：30～500m/z；进样口温度：285℃；分流比10:1；进样量：1μl；电子能量：70ev；柱温箱升温程序：50℃保持4min，5℃/min升温至120℃，1℃/min升温至180℃，10℃/min升温至280℃保持16min；其中ri值根据正构烷烃连续碳(c9-c25)的保留时间计算得到，将化合物的保留时间和质谱与nist17.l数据库进行数据比对，确定最终化合物，检测结果见下表；

实施例4：测定葶苈子挥发油对实施例2中7种致病菌菌丝生长的影响

(1)无菌操作条件下，在每个培养皿中倒入15mlpda培养基，待冷却凝固后，取实施例2中在pda培养基上培养7d的致病菌，用直径5mm的打孔器沿菌落边缘打取菌块，接种于培养基中央；

(2)将4个无菌牛津杯距离真菌块25mm处等距离放置；

(3)将实施例1干燥后的葶苈子挥发油用含有体积浓度1％的dmso和体积浓度0.1％的吐温80的水溶液溶解，制得浓度为50mg/ml葶苈子挥发油液体；

(4)在每个牛津杯中加入200μl步骤(3)的50mg/ml葶苈子挥发油液体(事先用0.22μm有机系滤头过滤除菌)，于微生物培养箱中28℃恒温培养，以不加葶苈子挥发油的含有体积浓度1％的dmso和体积浓度0.1％的吐温80的水溶液为阴性对照，恶霉灵为阳性对照，每个处理设5个重复；

(5)培养箱中培养7d后，采用“十字交叉法”测量菌落直径；

结果见图1、2，从图1、2中可以看出葶苈子挥发油对这7种病原菌具有广谱的抑菌作用且抑菌率高，无论对地上部分真菌还是地下部分真菌抑制率都达到了100％。

实施例5：葶苈子挥发油mic测定

(1)将实施例1干燥后的葶苈子挥发油用含有体积浓度2％的dmso和体积浓度1％的吐温80的水溶液溶解，用二倍稀释法配制浓度范围为2500.00-1.22μg/ml的多个浓度梯度液体，阳性药恶霉灵、单体化合物异硫氰酸酯醛用同样方法配置成浓度范围为2500.00-1.22μg/ml的液体；

(2)实施例2中生长7d的病原菌，用20ml1/4pda液体培养基(不添加琼脂，马铃薯和葡萄糖的量为常规培养基的1/4)冲洗培养基，制成孢子浓度为1×10⁴个/ml的孢子悬浮液；

(3)在96孔板中加入0.22μm微孔滤膜过滤除菌的50μl葶苈子挥发油和150μl步骤(2)中制成的孢子悬浮液；

(4)空白对照是50μl含有体积浓度2％dmso和体积浓度1％吐温80的水溶液以及150μl1/4pda液体培养基；阳性对照为50μl含有体积浓度2％dmso和体积浓度1％吐温80的水溶液以及150μl步骤(2)中的孢子悬浮液；

(5)96孔板28℃恒温培养36h，然后检查孔内真菌生长情况；在595nm处用酶标仪(thermo1510)测量每个孔的吸光度，结果见下表；

最小抑菌浓度(mic)的结果(mg/ml)

注：不同字母表示同一列中不同处理对同一菌株的最小抑菌浓度具有显著性差异p<0.05；

从表中我们可以看到，葶苈子挥发油对6种真菌的mic为0.27-0.7mg/ml；恶霉灵对6种真菌的mic为0.03-0.31mg/ml。

实施例6：葶苈子挥发油的活体试验

(1)在由蛭石和石英砂(体积比为2:1)组成的无菌培养基质中加入葶苈子挥发油，得到含有挥发油的培养基质(0.1mg/g)，自封袋密封保存；

(2)将含有挥发油的培养基质熏蒸5天后，按每盆250克的量装盆；

(3)用1×10⁷个孢子/ml的尖孢镰刀菌孢子悬液浸泡三七幼苗3h后，每盆栽种10株，作为葶苈子挥发油处理组，阴性对照组为浸泡无菌水，同时以不经挥发油处理的蛭石和石英砂(体积比为2:1)组成的无菌培养基质种植孢子悬液浸泡的三七幼苗作为阳性对照组；每组5个重复；

(4)培养15天后，当阳性对照组幼苗出现明显的病害症状时，对每个组三七植株的根系、茎秆、叶片的鲜重和干重以及株高进行测量，并计算各组的发病率及病情指数，结果见下表及图3；

注：不同字母表示同一列中不同处理对同一菌株的最小抑菌浓度具有显著性差异p<0.05；

由上表可知，葶苈子挥发油处理组与阴性对照组在发病率方面没有显著性差异但与仅接种f.oxysporum的阳性对照组存在显著性差异，说明使用葶苈子挥发油处理对于f.oxysporum导致的三七病害有一定的抑制作用。