本发明涉及嫁接介导的杂种单子叶植物的生产。
背景技术：
：：嫁接是将两种植物融合在一起，使之生长为一株植物的园艺实践。几乎所有的多年生果园作物和观赏植物(即苹果、樱桃、山核桃、葡萄、玫瑰、橄榄、柑橘、枫树等)以及许多高价值的一年生作物物种都进行了商业嫁接(hartmann等人，2010)。据信，植物嫁接的第一个用途是用于所需植物品种的无性繁殖(mudge等人，2009)。例如，许多果园物种是高度杂合的，这意味着亲本的性状将在后代中分离。因此，从种子生长不是维持所需基因型的可行方法。此外，某些树种，如苹果(苹果属(malussp.))，难以通过插条生根繁殖。取而代之的是，可以将优质树的枝条嫁接到可选种质(accession)的茎(stock)上，以产生克隆。嫁接可以用来改善某些特性，包括抗病性和适应极端温度或土壤因素(如耐盐性)的能力(lee，1994；louws等人，2010；schwarz等人，2010)。在许多情况下，当将抗病根茎嫁接到易感接穗上时，其能够提供针对土传病原体的保护(king等人，2008)。因此，嫁接有助于提高植物的总产量。例如，嫁接的瓜比非嫁接的瓜产量高25-55％(lee等人，2010)，当根茎‘helper‘和‘kagemusia‘用于番茄嫁接时，观察到产量提高了51-54％(chung和lee，2007)。嫁接还可以使一株植物由多个根系支持，或者一个根系支持多株植物作为分支。这可以加快单个接穗的生长，或者允许多个接穗繁殖，以节省空间。这在果园作物育种中特别有用。最后，通过将f1杂种幼苗嫁接到成熟的根茎上，该杂种可比没有嫁接的情况下更早开花很多年(nocker和gardiner，2014)。几乎所有关于嫁接的报道都特别涉及双子叶植物物种，在某些情况下还涉及裸子植物或木兰类植物。单子叶植物的成功嫁接被认为是行不通的，因为它们的茎中缺乏维管形成层组织。确实，文献中目前的共识是，不可能嫁接单子叶植物(melnyk，2017b；j.wang等人，2017；melnyk和meyerowitz，2015；kumar，2011；hyde等人，2015；turnbull，2010；zeevaart，2008；andrews和marquez，1993)。此外，与跨越数千年的双子叶嫁接的众多报道相比，很少有文章主张单子叶植物嫁接(obolensky，1960；muzik和larue，1952；muzik和larue，1954；calderini，1846)，这些报道缺乏对潜在方法的公开，或者他们的发现的有效性值得怀疑，因为它们与当前对性状遗传的理解不一致。无论如何，尽管偶尔有嫁接单子叶植物的报道，但没有人嫁接过香蕉(芭蕉科(musaceae))或棕榈树(棕榈科(arecaceae))，也没有人通过再生嫁接接合处(graftjunction)在单子叶植物中形成杂种。muzik和larue(1952，1954)，均有令人信服的证据表明单子叶植物之间成功的嫁接结合，在植物的节间、叶分支之间的茎接合处嫁接。节间在单子叶植物成熟后期形成，因此节间嫁接排除了在苗期嫁接。这使该过程复杂化，并减少了成年植物中接穗/根茎组合的益处。他们的成功率也很低，平均为3％。calderini(1846)声称已经将稻嫁接到稗草(echinochloacrus-galli)上，但没有提到成功率和种植的植物数量。calderini(1846)指出，通过他的嫁接手段，他已经生产了一种新的具有优良特性的稻品系，并将优良特性传递给下一代。obolensky(1960)报道了将冬小麦的胚乳与春小麦的胚紧密接触。通过这种胚乳/胚交换获得的植物不能被认为是真正的嫁接物，因为这一过程不会导致组织融合。在这种情况下，他报道说，在他们的后代中―观察到了深层的遗传变化”，例如通过―植物杂交”将一个春小麦品种转化为冬小麦品种，这在当时的苏联是一个流行的概念。此外，obolensky(1960)还报道了将玉米胚乳的一部分置于小麦胚乳的一部分旁边，并在同一种子上用玉米中胚轴替换了小麦中胚轴的一部分。所产生的此类植物由来自单个小麦胚的根茎和接穗组成，但由玉米的中胚轴连接。calderini(1846)和obolensky(1960)都没有提供证据证明他们的实验产生了真正的嫁接物，也没有显示植物已经经历了任何基因转移导致嫁接物的可遗传变化。因此，人们怀疑由obolensky(1960)或calderini(1846)生产的嫁接物是否产生了真正的杂种。相反，它们的表型观察结果可能是由表观遗传效应解释的，正如在其他研究中所报道的那样(calarco等人，2012；xu等人，2013；wu等人，2013；molnar等人，2010；brosnan等人，2007；baulcombe，2005；tournier等人，2006；z.liu等人，2006；harada，2010；kanehira等人，2005)。相反，科学界的共识是，似乎由于其维管束的结构，单子叶植物不能嫁接(melnyk，2017b；wang等人，2017；melnyk和meyerowitz，2015；kumar，2011；hyde等人，2015；turnbull，2010；zeevaart，2008；andrews和marquez，1993)。如果没有当时还无法获得的可选择标记物的帮助，这些主张是值得怀疑的。‘营养杂交‘或‘嫁接转化‘具有很大争议，并且他们报道的表型与目前对遗传学和遗传的理解不一致。许多出版物未能证实‘营养杂种‘或‘嫁接杂种‘的存在(sachs，1949；sachs，1951；stubbe，1954；topoleski和janick，1963)。由于发表负面结果的途径很少，goldschmidt(2014)声称可能还有更多未发表的研究在―营养杂交”方面同样失败。在双子叶植物的烟草属(nicotiana)中，已经报道了物种之间在嫁接接合处的dna转移(fuentes等人，2014；bock，2010)。然而，由于认为嫁接在单子叶植物中是不可能的，因此在双子叶植物以外的植物中没有证明这一点，在不属于同一属的物种之间也没有证明。技术实现要素：本发明源于这样的发现：事实上，单子叶植物不仅可以被嫁接，而且杂交也可以通过嫁接来实现。单子叶植物之间的嫁接可以在物种之间或物种内部进行。这些嫁接可以在几个系统发育相隔数百万年的单子叶植物科中进行(katayama和ogihara，1996；soltis等人，2018；trias-blasi等人，2015)，这意味着单子叶植物中的嫁接并不局限于特定的科。本文公开了从单子叶植物嫁接接合处再生杂种植物。这种方法对商业开发具有广泛的意义，并提供了一种将dna从作物的一种单子叶植物物种转移到另一种的新机制。事实上，例如黑小麦(triticale)或六倍体大小麦(tritordeum)的实例表明，新的单子叶植物作物可以从基于性别的广泛杂交事件中产生，因此从嫁接接合处再生也提供了产生新类型作物的新方法。在本文中使用不同的组织类型进行嫁接，这导致高得多的成功率。因此，本发明提供了一种接枝中胚轴的方法，即在发芽时或作为幼苗嫁接植物。因此，每一个组织嫁接伴侣(graftingpartner)所带来的好处都是立即显而易见的。此外，观察到嫁接成功率高得多，平均为18-42％，这取决于物种组合。本发明提供了一种产生杂种单子叶植物组织或植株的方法，其包括：(a)提供第一组织，其包含第一单子叶植物植株的：(i)中胚轴和胚根组织；或(ii)中胚轴和胚芽组织，其中所述第一组织在其基因组中包含第一标记物；(b)提供第二组织，其包含第二种不同的单子叶植物植株的：(i)中胚轴和胚根组织；或(ii)中胚轴和胚芽组织，其中所述第二组织在其基因组中包含第二种不同的标记物；(c)使所述第一组织与所述第二组织接触；(d)允许所述第一组织和第二组织融合，从而形成嫁接接合处，其中所述嫁接接合处包含至少一个含有所述第一标记物和第二标记物的杂种细胞；(e)基于所述第一标记物和第二标记物的存在选择所述至少一个杂种细胞；和从所述至少一个杂种细胞中再生杂种单子叶植物组织或植株。本发明还提供了嫁接的杂种单子叶植物组织或植株，其中所述植株包含来自第一组织和第二组织的遗传材料，其中所述杂种单子叶植物组织或植株任选地通过如上定义的方法获得或可获得。附图说明图1.种内小麦嫁接可完全重新连接脉管系统，并在整个生命周期内保持稳定。a)小麦(gus-)对小麦(gus+)胚移植嫁接的初始外观，b)八天后已经发生嫁接融合，c)和d)八天后通过gus染色观察到的根茎和接穗之间的区别，e)经由八天龄植株的嫁接接合处的薄切片-嫁接接合处下面的较暗区域是由于gus报道基因的积累。嫁接上方区域未染色，因此是透明的。f)四月龄的种内小麦嫁接。g)收获时的嫁接结合，h)和i)通过gus染色可见，嫁接接合处完全融合且无缝。箭头指向嫁接接合处。比例尺代表1mm(a-e)、5cm(f)和5mm(g-i)。图2.当嫁接到正常(野生型)根茎上时，重获了独角金内酯激素生物合成缺陷的稻。在土壤中生长60天后的a)野生型至野生型嫁接的外观，b)突变体至突变体嫁接的外观，和c)突变体至野生型嫁接的外观。d)分蘖数，e)最高叶舌的高度，和f)在它的生命周期中测量的每个嫁接植株上最长叶子的长度。误差线表示平均值的一个标准误差(n＝4)。缩写：wt，野生型(正常植物)；mu，突变体。比例尺代表10cm。图3.小麦和珍珠稷种间嫁接。a)小麦和珍珠稷的胚嫁接示意图。b)嫁接植株5周后(左)，通过嫁接接合处的横截面显示根茎和接穗之间的完全重新连接(右)。比例尺代表1.5mm(a)和5mm(b)。图4.嫁接单子叶植物的杂交概述。选择亲本系，本文以小麦和珍珠稷为代表，并用不同的可选择标记物基因转化。这些是嫁接在一起的。融合后，将嫁接接合处切开并置于含有与可选择标记物基因相对应的选择剂的再生培养基上。这就选择了含有双亲基因组的细胞，这些细胞生长成无性繁殖的杂种。图5.从嫁接接合处再生小麦与珍珠稷杂种。a)在选择压力下，将分别对选择性除草剂g418和basta有抗性的小麦和珍珠稷的嫁接接合处在组织培养中再生为芽和愈伤组织，以产生杂种组织。黑色箭头表示嫁接接合处。b)生长2周和2个月后土壤中再生的杂种植物。c)通过流式细胞术测定的小麦和珍珠稷的几个实例杂种的相对基因组大小比较。比例尺代表1mm(a)和5cm(b)。具体实施方式定义种质：植物物种的独特品种。非整倍体：拥有来自一个物种或多个物种的不同的或不完整的染色体组。植物生长素：一类调节细胞和植物生长的植物激素。愈伤组织：在组织培养中再生的未分化的植物细胞；嫁接接合处的增殖组织。栽培种：通过选择性育种而改良的植物种质。它源于栽培种和变种的融合。双子叶植物(dicotyledon)，通常称为双子叶植物(dicot)：一种开花植物，其种子中通常含有两片胚叶、网状脉和主根根系。双子叶植物的实例包括许多农艺和园艺植物，如番茄、胡萝卜、苹果、橡树和大豆。胚乳：植物种子内部的一种组织，其以淀粉、油或蛋白质的形式为胚储存营养能量。内生的：起源于有机体内部的。胚：未成熟的植物，其具有用于叶、根和茎的原始组织。在开花植物中，胚是种子的一部分。外胚层：植物胚中与胚根鞘相连的瓣状突起(flap-likeprojection)。萌发：植物胚开始发芽并长成幼苗的过程。嫁接：两种植物的结合，因此它们长成了一株植物(参见scionandrootstock)。嫁接至：(动词(v.))将植物部分放在一起使它们融合。嫁接接合处：由通过嫁接而结合的两个含中胚轴的组织衍生的组织。杂种：由两个遗传上不同的亲本衍生的第一代子代(f1)植株。种间的：在不同的/分开的物种之间。种内的：在同一物种内的。接合处：嫁接植物中接穗与根茎相会的接触区。标记物：鉴定细胞、组织或植物起源的任何方法。标记物包括内源性状、可选择标记物和视觉标记物。中胚轴：芽(胚芽)和根(胚根)之间的组织。在大多数单子叶植物中，中胚轴很容易被发现，因为它位于外层胚的正下方，外胚层是胚外部的瓣状突起。微型繁殖：一种在营养培养基上克隆植物的组织培养方法，通常是无限期的。单子叶植物(monocotyledon)，通常称为单子叶植物(monocot)：一种开花植物，其种子中通常含有一片胚叶、平行脉和须根系。单子叶植物的实例包括许多农作物和观赏植物，例如所有的谷物(即玉米、小麦、稻)、香蕉、棕榈树、兰花、百合和郁金香。单子叶植物的：(形容词(adj.))单子叶植物的。胚芽：植物的胚的芽或叶。在单子叶植物中，胚芽包括胚芽鞘、胚叶和茎尖分生组织。胚根：植物的胚根系。在单子叶植物中，胚根被胚根鞘(一种保护鞘)覆盖。再生：从单个细胞生长成植物的过程。通常，这包括用激素在组织培养中生长植物，以增殖和分化器官。根茎：嫁接植物的含根部分。选择标记物：一种核酸序列，其的表达允许鉴定含有该核酸序列的细胞、组织或植物。选择剂：鉴定表达相应可选择标记物的细胞、组织或植物的任何手段。选择剂包括抗生素、除草剂、毒素、盐和糖。接穗：嫁接植物的含芽部分。组织培养：一套可用于在无菌条件下，在营养培养基上使植物、植物细胞、植物组织和器官生长的技术。使用植物激素可用于从单个植物细胞再生成株植物。植物选择为了启动这个过程，选择了两种植物进行嫁接。任何两种密切相关的植物都可以使用。嫁接优选在相同属的植物之间进行，但也可以在相同科(family)或目(order)的植物之间进行。嫁接可以在不同物种但属于同一属的植物之间进行。嫁接也可以在不同物种但属于同一科的植物之间进行。嫁接还可以在不同物种但相同目的植物之间进行。嫁接可以在同一物种但不同基因型的植物之间进行。嫁接也可以在同一物种但不同种质的植物之间进行。嫁接还可以在同一物种但不同栽培种的植物之间进行。嫁接还可以在同一物种但不同变种的植物之间进行。在一些优选的配对中，包含中胚轴和胚根组织的组织或包含中胚轴和胚芽组织的组织来自c3植物，另一个来自c4植物。优选地，c4光合作用的性状被赋予再生的杂种单子叶植物组织或衍生自这种组织的嫁接的植物。c3植物包括面包小麦(小麦(triticumaestivum))和稻(水稻(oryzasativa))。c4植物包括珍珠稷(珍珠粟(pennisetumglaucum))、高粱属(高粱(sorghumbicolor))和玉蜀黍(玉米(zeamays))。在其他优选的配对中，包含中胚轴和胚根组织的组织或包含中胚轴和胚芽组织的组织来自耐盐植物，而另一种来自不耐盐植物。优选地，耐盐性的性状被赋予再生的杂种单子叶植物组织或衍生自这种组织的嫁接的植物。耐盐植物包括双弧稻(oryzacoarctata)、海大麦草(滨海大麦草(hordeummarinum))和高冰草(长穗偃麦草(thinopyrumponticum)或高冰草(agropyronelongatum))。不耐盐植物包括稻(水稻(oryzasativa))、面包小麦(小麦(triticumaestivum))和大麦(大麦(hordeumvulgare))。在其他优选的配对中，包含中胚轴和胚根组织的组织或包含中胚轴和胚芽组织的组织来自耐盐c4植物，另一种来自耐盐c3植物。优选地，c4光合作用和耐盐性的性状被赋予再生的杂种单子叶植物组织或衍生自这种组织的嫁接的植物。耐盐c4植物包括盐地鼠尾栗(sporobolusvirginicus)、复原草(sporobolusstapfianus)、米草属(spartinasp.)。不耐盐c3植物包括面包小麦(小麦(triticumaestivum))和稻(水稻(oryzasativa))。在其他优选的配对中，包含中胚轴和胚根组织的组织或包含中胚轴和胚芽组织的组织来自耐冷植物，而另一种来自不耐冷植物。优选地，耐冷性的性状被赋予再生的杂种单子叶植物组织或衍生自这种组织的嫁接的植物。耐冷植物包括奇岗(miscanthusxgiganteus)和米草属。不耐冷植物包括玉蜀黍(玉米(zeamays))、高粱属(高粱(sorghumbicolor))和珍珠稷(珍珠粟(pennisetumglaucum))。在其他优选的配对中，包含中胚轴和胚根组织的组织或包含中胚轴和胚芽组织的组织来自耐冻植物，而另一种来自不耐冻植物。优选地，耐冻性的性状被赋予再生的杂种单子叶植物组织或衍生自这种组织的嫁接的植物。耐冻植物包括冬黑麦(黑麦(secalecereale))。耐冻植物包括面包小麦(小麦(triticumaestivum))、大麦(大麦(hordeumvulgare))和稻(水稻(oryzasativa))。在其他优选的配对中，包含中胚轴和胚根组织的组织或包含中胚轴和胚芽组织的组织来自耐旱植物，而另一种来自不耐旱植物。优选地，耐旱性的性状被赋予再生的杂种单子叶植物组织或衍生自这种组织的嫁接的植物。耐旱植物包括结缕草(结缕草(zoysiajaponica))、狗牙根(狗牙根(cynodondactylon))、珍珠稷(珍珠粟(pennisetumglaucum))和复原草。耐旱植物包括面包小麦(小麦(triticumaestivum))、稻(水稻(oryzasativa))和大麦(大麦(hordeumvulgare))。在其他优选的配对中，包含中胚轴和胚根组织的组织或包含中胚轴和胚芽组织的组织来自病原抗性植物或害虫抗性植物，而另一种来自病原易感植物或害虫易感植物。优选地，病原抗性或害虫抗性的性状被赋予再生的杂种单子叶植物组织或植株。例如，在这种配对中，可以使用对病原体禾柄锈菌(pucciniagraminis)(小麦秆锈病(wheatstemrust))具有抗性的植物，包括稻(水稻(oryzasativa))、玉蜀黍(玉米(zeamays))或珍珠稷(珍珠粟(pennisetumglaucum))。种子灭菌为获得最佳效果，应在无菌条件下进行嫁接。获得了两种植物的成熟种子，可以进行表面消毒。可以使用任何合适的灭菌方法。例如，在谷物中，种子可在具有0.01％(v/v)tween-20或类似表面活性剂的1-4％(v/v)次氯酸钠溶液中灭菌20-45分钟。用无菌水冲洗几次即可将溶液完全冲洗干净。例如，种子也可以在2-4％(v/v)植物组培抗菌剂(plantpreservativemixture)tm(ppmtm，apolloscientific，uk)中灭菌一夜或更长时间。ppmtm可用于对所有单子叶植物种子进行灭菌，并可添加到培养基中(0.5％v/v)，以大大减少污染。部分种子萌发种子的萌发可以通过任何合适的方法来引发。例如，在谷物中，种子可以在20-30℃的无菌水中在黑暗中浸泡18-35小时。如果使用ppmtm作为灭菌剂，则可以将种子在萌发阶段保存在该溶液中。浸泡种子会导致吸收水分，这简化了后续的嫁接步骤。浸泡可以在任何合适的时间段内进行。或者，也可以使用干种子。例如，在多年生单子叶植物(如香蕉和棕榈树)中，例如可将种子在28-30℃的黑暗条件下浸泡在赤霉酸(ga3)溶液中3天，其中第一天或更长时间浸泡在用于灭菌的2-4％ppm(v/v)和ga3的混合物中。在香蕉中，0.0002-0.001％(w/v)ga3通常足以引发萌发。在油棕榈树和枣椰树中，0.01-0.1％(w/v)的ga3通常足以引发萌发。植物胚的嫁接取两株植物的种子。种皮可以存在，也可以去除。如果去除种皮，可以通过任何方式去除，例如用剃刀片。种子可以是干燥的或吸涨的(imbibed)。当种子是吸涨的时，它们优选在水中吸涨。当种子在水中吸涨时，它们优选在水中吸涨8至72小时。种子可以改为或另外在黑暗中部分萌发。当种子在黑暗中部分萌发时，它们优选在黑暗中部分萌发2至30天。然后，两粒种子被切割。在一些方面，一粒种子将提供包含中胚轴和胚根组织的组织，而另一粒种子将提供包含中胚轴和胚芽组织的组织。在其他方面，两粒种子都将提供包含中胚轴和胚根组织的组织。在其他方面，两粒种子将提供包含中胚轴和胚芽组织的组织。在每粒种子中，可以在植物胚内的中胚轴(即胚根和胚芽之间的分化点)上进行横向切割。最薄的刀片可以获得更大的成功，因为中胚轴会很窄。例如，可以用厚度为0.1至0.3mm的切割刃切割种子。切割可以用刀片进行，例如剃刀刀片。也可以使用组织打孔器进行切割。优选地，用于该目的的组织打孔器的直径为1.2mm。在一些方面，包含中胚轴和胚芽组织的第一组织可以从两粒种子中切除并在种子之间交换，并且可以与包含中胚轴和胚根组织的第二种不同的组织紧密接触而被压紧。任选地，可将包含相同嫁接伴侣的浸泡胚乳的粘合剂、嫁接蜡或糊剂施加到嫁接接合处的边缘，以保持两种组织粘附。必须小心防止胶水或其他粘合剂渗入两种组织之间的接合处。或者，优选地，可以改用直径为1-1.25mm、配有柱塞的打孔器从干燥或吸涨的种子中交换胚块。打孔器锋利边缘的底部可以放置在种子外胚层的中间，种子外胚层包括第一组织，第一组织包括中胚轴和胚根组织。然后，轻轻向下移动，就可以在种子的胚乳上切出一个洞，将中胚轴一分为二。然后可以切除芽，并通过柱塞将其射出。随后，可以以相同的方式去除另一种子的组织，但是可以将其喷射到第一粒种子中钻出的孔中，以对齐中胚轴的两半，使得它们彼此直接接触。胚片的精确配合通常通过这种方法来实现，因为切割片的直径由打孔器的直径决定。在打孔器的帮助下，技术人员每小时可以嫁接60-100株植物。当仔细嫁接时，胚片在18-42％的时间内表现出完全融合，这取决于组合。无论使用何种方法，然后通常将嫁接的种子在潮湿/湿润的环境中(通常在潮湿的无菌滤纸上)放置2-7天，直到两个组织之间发生融合。融合是指两组织之间形成功能性的脉管连接。优选地，融合步骤包括在硝酸纤维素膜上生长融合的组织。例如，嫁接的种子可以在20-28℃的温度下在黑暗中保存2-4天，然后再光照7天。然后，任选地将任一嫁接幼苗转移到正常生长条件下的土壤中。通过芽移植嫁接嫁接可以在新萌发的幼苗上进行。萌发可以进行到胚芽长度为0.5-1cm。芽在外胚层(见中胚轴)处被切成楔形或圆形，并被放入不同的种子中，其胚芽也以同样的方式被切除。这种方法对于较大的种子特别有用，或者在将不育(sterile)且因此无法制作种子的物种的芽嫁接到非不育受体的初生根根茎上时特别有用。组织培养中的嫁接单子叶植物嫁接可以在组织培养中再生的植物组织上进行。与大多数植物不同，栽培香蕉是不育的，因此缺乏形成种子的能力。这使得从种子中获得胚几乎是不可能的。取而代之的是，新形成的香蕉芽可以在组织培养中微型繁殖，然后嫁接到已经微型繁殖或从胚分离的所需根茎上。保存在含有6-苄基氨基嘌呤(bap，一种人工细胞分裂素植物激素)的营养培养基上的香蕉植株会不断增殖芽。如果bap被去除，那么芽开始形成根。利用这一点，栽培香蕉可以嫁接到所需的根茎上。将bap培养基上的香蕉芽切下并解剖，以保持单个芽与它们再生的愈伤组织相连。这些构成嫁接的接穗。同样，野生香蕉愈伤组织(或来自萌发种子的胚根)用作根茎。一个相同直径但缺少芽的愈伤组织被压入以与接穗愈伤组织的受伤愈伤组织紧密接触。这将转移到不含bap的培养基中。愈伤组织之间发生嫁接融合的时期也允许从底部愈伤组织分化以获得根系。从嫁接接合处再生杂种发明人发现单子叶植物可以在嫁接接合处进行细胞间的dna交换。这种与植物再生相结合的方法已经发展成为单子叶植物的一种新的无性杂交方法。可以嫁接第一单子叶植物和第二种不同的单子叶植物的组织。在一些方面，嫁接包含中胚轴和胚根组织的第一组织和包含中胚轴和胚芽组织的第二组织。在其他方面，嫁接包含中胚轴和胚根组织的第一组织和包含中胚轴和胚根组织的第二组织。在其他方面，嫁接包含中胚轴和胚芽组织的第一组织和包含中胚轴和胚芽组织的第二组织。将第一和第二组织放置成彼此接触并允许融合，从而形成嫁接接合处。被嫁接的任何两个组织优选地包括不同的标记物。在一些方面，第一组织和第二组织包括不同的可选择标记物。在其他方面，第一组织和第二组织包括不同的视觉标记物。在其他方面，第一组织和第二组织包括不同或互补的内源性状。在其他方面，一个组织包括可选择标记物，而另一个组织包括视觉标记物。在其他方面，一个组织包含可选择标记物，另一个组织包含内源性状。在其他方面，一个组织包含视觉标记物，另一个组织包含内源性状。然后，这两种标记物可用于从嫁接接合处选择那些为杂种细胞的细胞，因为这些细胞将包含这两种标记物。嫁接接合处来自两个组织并包含至少一种杂种细胞。一旦发生了嫁接组织的融合，就可以切除嫁接接合处，优选使用无菌刀片。例如，可通过在嫁接接合处上方约5mm和下方约5mm处切割，切除跨越嫁接部位的切片。任选地通过嫁接接合处制作切片，以生成保持根茎和接穗之间接触的切片。例如，可以通过嫁接接合处制作薄的纵向切片，以产生保持接穗和根茎之间结合的横向切片。然后可将切片或刨切的切片(slicedsection)与组织培养基接触以进行再生。通常，切片或刨切的切片在培养基上保留约一个月至约一年。形成杂种组织如多芽或愈伤组织的再生培养基(中胚轴再生(mer)培养基)可包括基础培养基(4.41g·l-1murashige和skoog盐、30g·l-1麦芽糖、1g·l-1n-z胺、500mg·l-1脯氨酸、200mg·l-1肌醇、1mg·l-1硫胺素hcl、1.25mg·l-1硫酸铜和3mg·l-1gelritetm，ph为5.8)，以及作为生长调节剂的植物生长素和细胞分裂素。作为植物生长素的l2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)或4-氨基-3,5,6三氯吡啶甲酸(毒莠定)以及作为细胞分裂素的噻苯隆(tdz)在单子叶植物中胚轴嫁接接合处的再生中提供了良好的效率。例如，这种培养基能够再生小麦、大麦、稻和珍珠稷。优选地，第一标记物和第二标记物是不同的可选择标记物，并且培养基还包含相应的第一和第二选择剂，以选择来自包含两种标记物的杂种细胞的组织。在使用两种不同的可选择标记物的情况下，在双重选择(含有两种选择剂的培养基)下，再生植物通常每两周在新鲜培养基上进行传代培养10至12周，以确保来源于任一亲本(其仅含有一种标记物)的细胞不生长。相反，仅包含两种标记物的细胞(即交换了基因组dna的杂种细胞)然后能够生长。然后，这些细胞可以再生为衍生自嫁接在一起的两种植物物种的杂种植物。例如，抗生素g418和除草剂草铵膦可用作选择剂，但其他也是可用的，包括抗生素(如卡那霉素、潮霉素、巴龙霉素等)、除草剂(如草甘膦、咪唑啉酮、双丙氨膦等)、毒素(如2-脱氧葡萄糖、硫代赖氨酸、甲氨蝶呤、氨腈、次氯酸钠、加巴丘林(gabaculine)、4-甲基色氨酸和甘氨酸甜菜碱醛)和其他化学品(如盐、糖等)。选择剂在再生培养基中的优选工作浓度范围为0.01至1000mg·l-1。为了启动嫁接接合处的再生，可向基础培养基中加入2mg·l-12,4-d和3mg·l-1tdz以形成mer启动(meri)培养基。优选地，使用第一可选择标记物和第二种不同的可选择标记物，并且培养基还包含相应的第一和第二选择剂，以选择来自包含两种标记物的杂种细胞的组织。例如，抗生素g418和除草剂草铵膦可用作选择剂，但其他也是可用的，包括抗生素(如卡那霉素、潮霉素、巴龙霉素等)、除草剂(如草甘膦、咪唑啉酮、双丙氨膦等)、毒素(如2-脱氧葡萄糖、硫代赖氨酸、甲氨蝶呤、氨腈、次氯酸钠、加巴丘林、4-甲基色氨酸和甘氨酸甜菜碱醛)和其他化学品(如盐、糖等)。选择剂在再生培养基中的优选工作浓度范围为0.01至1000mg·l-1。例如，在小麦和珍珠稷中，抗生素g418和除草剂草铵膦在培养基中的使用浓度分别为25mg·l-1和5mg·l-1。为了实现再生为杂种植物，将杂种组织置于生芽培养基上，优选放置1至2个月，使得至少一种杂种芽从所述杂种组织形成。例如，生芽培养基(mer生芽(mers)培养基)可包含具有0.1mg·l-12,4-d和1mg·l-1tdz的mer基础培养基。然后，可将杂种芽或小植株置于生根培养基上，优选放置2至4周，从而形成至少一种包含根形式的杂种单子叶植物。例如，生根培养基(mer生根(merr)培养基)可包含具有0.5mg·l-1iba的mer基础培养基。然后，这种杂种植物可以在正常生长条件下转移到土壤中，并用于通过常规方法将一个物种的所需性状培育或将一个物种的所需性状整合到另一个物种中。标记物和选择剂任何鉴定细胞、组织或植物起源的方法都可用作标记物。因此，标记物包括内源性状。为了用作标记物，内源性状对于被嫁接的两个组织都不应该是内源的。内源性状包括，例如，耐盐性，耐冷性，耐冻性，重金属解毒，爆发性解毒以及代谢甘露糖、木糖或苄基腺嘌呤-n-3-葡糖苷酸的能力。标记物还包括视觉标记物。视觉标记物包括荧光标记物、gus和荧光素酶。标记物也包括可选择标记物。任何其表达允许鉴定含有该核酸序列的细胞、组织或植物的核酸序列都可用作可选择标记物。用于鉴定表达相应选择标记物的细胞、组织或植物的选择剂包括抗生素、除草剂、毒素、盐和糖。抗生素包括，例如，卡那霉素、遗传霉素(g418)、潮霉素、巴龙霉素、新霉素、大观霉素、链霉素、庆大霉素、妥布霉素、安普霉素、博莱霉素、草霉素、链丝菌素和氯霉素。除草剂包括，例如，草甘膦、草铵膦(glufosinate)(或草铵膦(phosphinothricin)/basta)、双丙氨膦、氯磺隆、3-(3,4-二氯苯基)-1,1-二甲基脲(dcmu)、阿特拉津、百草枯(paraquot)、甲基紫精、甲磺隆-甲基、绿草定、3-氨基-1,2,4-三唑(3-at)、磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类、嘧啶基氧代苯甲酸酯类和磺酰氨基羰基三唑啉酮类。毒素包括，例如，2-脱氧葡萄糖、硫代赖氨酸、甲氨蝶呤、氨腈、次氯酸钠、加巴丘林、4-甲基色氨酸和甘氨酸甜菜碱醛。糖包括，例如，甘露糖、木糖和苄基腺嘌呤-n-3-葡糖苷酸。当糖用作选择剂时，它们作为限制性代谢产物起作用。感兴趣的性状然后，本发明的方法可用于将来自一个嫁接伴侣组织的所需性状整合到另一个中。例如，c4光合作用的性状可以赋予再生的杂种单子叶植物组织或植株，其来源于来自c3植物的组织和来自c4植物的组织之间的嫁接物。可赋予再生杂种单子叶植物组织或植株的其他性状包括耐盐性，耐冷性，耐冻性，耐旱性，多年生性，除草剂抗性，病原抗性，昆虫抗性，螨虫抗性，线虫抗性，寄生植物抗性，草食抗性，固氮作用，耐热性，耐风性，耐重金属性，耐涝性和耐缺氧应激性，耐臭氧性，较高的产量，抗倒伏性，更大的机械化促进性，抗荚果或种子破碎性，改变的株高和高度(stature)，增加的生物量，较低的肥料利用率，较快的生命周期，较高的营养含量，改善的烘焙、碾磨和麦芽制造品质，改善的味道，改善的颜色和延长的保质期。实施例实施例1-嫁接方法每种种质的种子都经过表面消毒。它们可以在水中吸涨过夜(8-16小时)或保持干燥。使用直径为1.2mm、切割刃厚为0.1-0.3mm的组织打孔器钻出整个胚芽和中胚轴的一半——中胚轴被一分为二，使得其一半仍然与胚芽连接，剩余的一半仍然与吸涨的种子的胚根连接。切口直接穿过种皮(即种皮没有预先除去)。或者，0.1-0.3mm厚的剃刀/解剖刀刀片可用作切除胚芽的替代工具。移除的胚芽被来自不同种子(来自相同或不同物种)的一个胚芽所取代，该种子可以是干燥的或吸涨的。干燥的胚芽插入物似乎从导致它们膨胀的吸涨的种子中吸收水分，这产生了与插入胚芽的中胚轴(接穗源)和种子中的胚根(根茎源)的牢固接触，以形成嫁接结合。让嫁接物在硝酸纤维素膜上在20-28℃的黑暗中萌芽，该硝酸纤维素膜置于有高盖的陪替氏平皿中的湿滤纸上面。膜防止根嵌入滤纸中，而高盖减少了一旦芽伸长并压在容器顶部时嫁接接合处被推开的机会。在黑暗中孵育2至4天后，将种子暴露在光照下。嫁接融合后的一段黑暗期促进了中胚轴伸长，从而导致更好的融合和更大程度的成功。一旦发生嫁接融合，通常在7天后，将其转移至组织培养条件下或任选转移至土壤中。实施例2-嫁接介导的杂交在选择用于杂交的物种或种质之间形成嫁接后，通过在接合处上方约5mm和下方约5mm处切割，切除跨越嫁接部位的切片。然后用0.1mm厚的解剖刀通过接合处制作纵向切片，以产生维持接穗和根茎之间结合的横向切片。将切片在meri培养基上放置一个月。在中胚轴再生(mer)培养基上开始从中胚轴嫁接接合处再生多芽或形成愈伤组织，该培养基由下列物质组成：基础培养基(4.41g·l-1murashige和skoog盐、30g·l-1麦芽糖、1g·l-1n-z胺、500mg·l-1脯氨酸、200mg·l-1肌醇、1mg·l-1硫胺素hcl、1.25mg·l-1硫酸铜和3g·l-1gelritetm，ph5.8)，作为生长调节剂的植物生长素(2,4-d)以及细胞分裂素(tdz)。为了启动嫁接接合处的再生，向基础培养基中加入2mg·l-12,4-d和3mg·l-1tdz以形成mer启动(meri)培养基。将培养基分装在直径为9cm的灭菌陪替氏平皿中，并用封口膜密封。mer培养基还含有合适浓度的可选择剂。对于小麦和珍珠稷，分别为25mg·l-1和5mg·l-1的抗生素g418和除草剂草铵膦。mer培养基能够再生小麦、大麦、稻和珍珠稷。在mer上测试了多个小麦品种的再生，效率相似。因此，mer不仅可以以基因型独立的方式再生物种内的种质，还可以再生不同的单子叶植物物种。光强度维持在80μmol光子(photos)m-2·s-1，光周期设定为16小时光照和8小时黑暗，温度分别为25.5℃和23.5℃。每两周将组织传代培养到新鲜mer培养基上，进行约10-12周的双重选择(培养基含有两种选择剂，如抗生素g418和除草剂草铵膦)。双重选择确保仅来自一个亲本(仅包含一种可选择标记物)的细胞不会生长。相反，只有包含两种可选择标记物(即，交换了基因组dna的杂种细胞)的细胞能够生长。芽从在2至4周期间对两种可选择标记物都有抗性的愈伤组织中出现。这些细胞再生为来源于两个物种嫁接在一起的杂种植物。除了g418和草铵膦，还有更多的可选择剂是可用的，包括抗生素(如卡那霉素、潮霉素、巴龙霉素等)、除草剂(如草甘膦、咪唑啉酮、双丙氨膦等)、毒素(如2-脱氧葡萄糖、硫代赖氨酸、甲氨蝶呤、氨腈、次氯酸钠、加巴丘林、4-甲基色氨酸和甘氨酸甜菜碱醛)或其他化学品(如盐、糖等)。选择剂在再生培养基中的优选工作浓度范围为0.01至1000mg·l-1。在此阶段之后，将再生芽置于mer生芽(mers)培养基上，该培养基由含有0.1mg·l-12，4-d和1mg·l-1tdz的mer基础培养基组成，另外放置1至2个月。一旦在mers培养基上形成了小植株，就将其在由含有0.5mg·l-1iba的mer基础培养基组成的mer生根(merr)培养基上生根。生根通常发生在2到4周内。一旦再生植株形成根，这些根在正常生长条件下被转移到土壤中。然后，杂种植物可用于通过常规方法将来自一个物种的所需的性状培育或整合到另一个物种中。实施例3-将小麦嫁接到小麦上(种内嫁接)通过胚移植将含有β-葡萄糖醛酸酶(gus)基因(其在x-gluc存在下将植物组织染成蓝色)的转基因小麦嫁接到野生型小麦(非转基因)上。2-4天后，开始发生融合，得到总有效率约为32％(n＝330)。8天后，用x-gluc对嫁接植株进行染色，以显示嫁接接合处。植物的接触层(嫁接接合处)在嫁接融合过程的早期表现为黑线，但在脉管重新连接过程中会逐渐消失。嫁接的植物在整个生命周期中，甚至在开花和结实之后都能够存活。四个月后通过gus染色嫁接植物的切片显示，接触层已形成完整的脉管重新连接。实施例4-将稻嫁接到稻上(种内嫁接)将激素合成能力缺陷的稻进行嫁接。独角金内酯是一种植物激素，其控制分蘖(分枝)，并影响有益真菌在其根中定殖的能力。由于独角金内酯可在整个植物中循环，因此预计独角金内酯生产突变体如果成功嫁接到正常(野生型)根茎上，会重获正常分枝。将类胡萝卜素裂解双加氧酶8(ccd8)基因的突变体稻嫁接到野生型(非突变体)稻根茎上。正如预期，突变体至突变体嫁接物表现出较大程度的分枝，但突变体至野生型嫁接物具有与野生型至野生型嫁接物相同的分枝习性。尽管含有ccd8基因突变，但这些植物仍保持正常的外观。这表明不仅嫁接结合具有功能性，并且随着时间的推移是稳定的，而且接穗和根茎能够交换内源物质，包括激素。实施例5-将小麦嫁接到珍珠稷(种间嫁接)小麦是全球主要作物，其约占人类食物供应的20％(水稻占类似数量)，但其使用效率低下的光合co2固定途径(称为c3光合作用)。如果将更有效的c4光合途径转移到小麦中，在不需要额外的土地、水和肥料的情况下，产量预计将增加50％。通过胚移植，发现小麦和珍珠稷形成功能性嫁接重新连接，成功率约为25％(n＝1423)。然后再生嫁接接合处以获得杂种植株。小麦和珍珠稷在mer培养基上再生。将对除草剂/抗生素g418有抗性的小麦嫁接到对除草剂草铵膦有抗性的珍珠稷上(图5)。在含有g418(17.5mg·l-1)和草铵膦(3.5mg·l-1)的mer培养基上再生这两个抗性种质之间的嫁接接合处。几周后愈伤组织形成，10-14周内植株完全再生。通过流式细胞术进行的基因组大小估计表明，通过这种方法再生的杂种介于小麦和珍珠稷之间。这表明再生的植物至少存在两种物种中的一些(非整倍体杂种)。这些植物类似于珍珠稷，但具有小麦的特征。这些植物是自育的，其种子萌发正常。其中一些还具有中间碳同位素组成，这表明光合机制介于c3和c4之间。重获了似乎具有小麦和珍珠稷的基因组的全互补物的植物，这表明嫁接和杂交方法可以导致形成育种系，以引入重要的作物改良性状。一般来说，这些植物大多与小麦相似，它们的后代将小麦和珍珠稷的基因组保存到后代。这表明dna可以跨越嫁接接合处转移，并经过多代稳定整合到性不相容的物种中。参考文献andrews,p.k.andc.s.marquez(1993).graftincompatibility.hort.rev.15,183-232baulcombe,d.(2005).rnasilencing.trendsbiochemsci30,290–293bockr.(2010)thegive-and-takeofdna:horizontalgenetransferinplants.trendsinplantscience1,11-22brosnan,c.a.,n.mitter,m.christie,n.a.smith,p.m.waterhouseandb.j.carroll(2007).nucleargenesilencingdirectsreceptionoflong-distancemrnasilencinginarabidopsis.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica104,14741–14746calarco,j.p.,f.borges,m.t.donoghue,f.vanex,p.e.jullien,t.lopes,r.gardner,f.berger,j.a.feij′o,j.d.beckerandr.a.martienssen(2012).reprogrammingofdnamethylationinpollenguidesepigeneticinheritanceviasmallrna.cell151,194–205calderini,i.m.(1846).essaid‘exp′eriencessurlagraffedesgramin′ees.ann.sci.nat.bot.iii,131–133chung,h.d.andj.-m.lee(2007).rootstocksforgrafting.horticultureinkorea.koreansocietyforhorticulturalscience,162–167dransfield,j.,n.w.uhlandkewroyalbotanicgardens(2008).generapalmarum:theevolutionandclassificationofpalms.kewpub.732fuentes,i.,s.stegemann,h.golczyk,d.karcherandr.bock(2014).horizontalgenometransferasanasexualpathtotheformationofnewspecies.nature511,232–235goldschmidt,e.e.(2014).plantgrafting:newmechanisms,evolutionaryimplications.frontiersinplantsci.,5,727harada,t.(2010).graftingandrnatransportviaphloemtissueinhorticulturalplants.scientiahorticulturae125,545–550hartmann,h.t.,d.e.kester,f.t.j.daviesandr.l.geneve(2010).plantpropagation:principlesandpractices.8th.prenticehall/pearson,928hyde,r.a.,m.y.ishikawa,r.c.petroski,d.b.tuckerman,t.a.weaver,v.y.h.woodandl.l.wood(2015).harvestingandgraftingoftrees.u.s.patentapplicationser.no.14/069,079kanehira,a.,k.yamada,t.iwaya,r.tsuwamoto,a.kasai,m.nakazonoandt.harada(2005).applephloemcellscontainsomemrnastransportedoverlongdistances.treegeneticsandgenomes6,635–642katayama,h.andy.ogihara(1996).phylogeneticaffinitiesofthegrassestoothermonocotsasrevealedbymolecularanalysisofchloroplastdna.currentgenetics29,572–581king,s.r.,a.r.davis,w.liuanda.levi(2008).graftingfordiseaseresistance.hortscience43,1673–1676kumar,g.n.m.(2011).propagationofplantsbygraftingandbudding.revisededition.washington:horticulturalandlandscapearchitecture,washingtonstateuniversity,16lee,j.-m.(1994).cultivationofgraftedvegetablesi.currentstatus,graftingmethods,andbenefits.hortscience29,235–239lee,j.-m.,c.kubota,s.j.tsao,z.bie,p.hoyosechevarria,l.morraandm.odag.a.honorary(2010).currentstatusofvegetablegrafting:diffusion,graftingtechniques,automation.scientiahorticulturae127,93–105liu,z.,y.-l.yuan,s.-q.liu,x.-n.yuandl.-q.rao(2006).screeningforhigh-temperaturetolerantcottoncultivarsbytestinginvitropollengermination,pollentubegrowthandbollretention.journalofintegrativeplantbiology48,706–714louws,f.j.,c.l.rivardandc.kubota(2010).graftingfruitingvegetablestomanagesoilbornepathogens,foliarpathogens,arthropodsandweeds.scientiahorticulturae127,127–146melnyk,c.w.ande.m.meyerowitz(2015).plantgrafting.currentbiology25,r183–r188melnyk,c.w.(2017b).plantgrafting:insightsintotissueregeneration.regeneration4,3–14molnar,a.,c.w.melnyk,a.bassett,t.j.hardcastle,r.dunnandd.c.baulcombe(2010).smallsilencingrnasinplantsaremobileanddirectepigeneticmodificationinrecipientcells.science328,872–875mudge,k.,j.janick,s.scofieldande.e.goldschmidt(2009).ahistoryofgrafting.horticulturalreviews35,437–493muzik,t.j.andc.d.larue(1952).thegraftingoflargemonocotyledonousplants.science116,589–591muzik,t.j.andc.d.larue(1954).furtherstudiesonthegraftingofmonocotyledonousplants.americanjournalofbotany,448–455nocker,s.vanands.e.gardiner(2014).breedingbettercultivars,faster:applicationsofnewtechnologiesfortherapiddeploymentofsuperiorhorticulturaltreecrops.horticultureresearch1,14022obolensky,g.(1960).graftingofplantembryosandtheuseofultrasonics.qualitasplantarumetmateriaevegetabiles7,273–288sachs,l.(1949).‘vegetativehybridization‘.nature164,1009sachs,l.(1951).‘vegetativehybridization‘inthetomato.nature167,282schwarz,d.,y.rouphaelandj.h.venema(2010).graftingasatooltoimprovetoleranceofvegetablestoabioticstresses:thermalstress,waterstressandorganicpollutants.scientiahorticulturae127,162–171soltis,d.e.,p.s.soltis,p.k.endress,m.w.chase,s.r.manchester,w.s.judd,l.c.majureande.mavrodiev(2018).phylogenyandevolutionoftheangiosperms.universityofchicagopress580stubbe,h.(1954).u¨berdievegetativehybridisierungvonpfl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