技术领域：
本发明涉及动物繁殖技术领域，具体涉及一种多功能猪精液稀释粉及其应用。
背景技术：
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近些年养猪业在非洲猪瘟影响下，大型集约化养殖场发展迅猛，与此同时养殖成本以及风险大幅提升，尤其2020年7月1日国家下发饲料全面禁抗令，致使给猪群健康带来巨大影响。对公猪影响更为明显，猪精液由于公猪细菌性感染以及精液处理过程污染，被革兰氏阴性菌污染的精液质量大幅降低。人工授精后诱发的母猪子宫炎症，大量精子被嗜中性粒细胞吞噬杀灭，同时被革兰氏阴性菌污染的精液中产生的内毒素会加剧子宫炎症反映，导致精液利用低以及受胎率降低等危害。所以现如今急需一种可抑制子宫炎症，同时可减弱革兰氏阴性菌对猪精子损伤的猪精液稀释粉。故此，发明一种成本低廉、效益明显、安全可靠的能够更好的保护猪精液的猪精液稀释粉是十分必要的。
技术实现要素：
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本发明的目的是为了解决人工授精后诱发子宫炎症对精子的损伤，同时减弱革兰氏阴性菌产生的内毒素对精子的毒害作用，从而提高猪精液的保存时间、质量以及提高母猪受胎率，进而提供一种价格低廉、效益明显、安全可靠具有抑制子宫炎症的猪精液稀释粉及技术方法。
本发明的一种多功能猪精液稀释粉，所述的稀释粉是由下列组分按质量份数比例混合而成：25-30份无水葡萄糖、5-10份三羟甲基氨基甲烷、2-5份柠檬酸、1-3份乙二胺四乙酸四钠、5-10份柠檬酸钠、0.5-2.0份nahco3、0.5-1.0份青霉素、0.5-2.0份链霉素、0.05-0.10份甲基强的松龙和2-6份牛血清白蛋白。
作为本发明的进一步改进，所述的一种多功能猪精液稀释粉，所述的稀释粉是由下列组分按质量份数比例混合而成：27.50份无水葡萄糖、5.65份三羟甲基氨基甲烷、2.90份柠檬酸、2.60份乙二胺四乙酸四钠、6.90份柠檬酸钠、1.00份nahco3、0.60份青霉素、1.00份链霉素、0.05-0.10份甲基强的松龙和4.00份牛血清白蛋白。
所述的一种多功能猪精液稀释粉在猪精液保存和母猪授精中的应用。
一种猪精液的保存方法，具体操作方法如下：
(1)稀释粉溶解：室温下，将稀释粉与水按50-55:1000的质量比例混合均匀，得稀释粉水溶液；
(2)猪精液处理：将人工采集的猪精液经1800r/分钟离心5min后取沉淀物，与步骤(1)所得的稀释粉水溶液混合，将沉积物稀释至1×108-3×108个/ml，得猪精液稀释液；
(3)保存：将步骤(2)制得的猪精液稀释液，置于17℃培养箱保存，每间隔12小时混匀，即可保存3-5天。
作为本发明的进一步改进，所述的一种猪精液的保存方法，具体操作方法如下：
(1)稀释粉溶解：室温下，将稀释粉与水按52:1000的质量比例混合均匀，得稀释粉水溶液；
(2)猪精液处理：将人工采集的猪精液经1800r/分钟离心5min后取猪精子沉淀物，将猪精子沉淀物与步骤(1)所得的稀释粉水溶液混合，将沉积物稀释至2×108个/ml，即获得具有抑制母猪子宫炎症的猪精液稀释液；
(3)保存：将步骤(2)制得的猪精液稀释液，置于17℃培养箱保存，每间隔12小时混匀，即可保存3-5天。
一种母猪的授精方法，利用上述方法所得的猪精液稀释液对母猪进行人工授精，即可抑制了母猪子宫炎症对精子的损伤。
猪精液稀释粉各成分主要作用：(1)无水葡萄糖，为精子代谢提供能量；(2)三羟甲基氨基甲烷，是一种碱性缓冲剂，对代谢酸中毒和酶活动反应具有良好的缓冲作用；(3)柠檬酸，在精液中起到缓冲剂、抗氧化等作用；(4)乙二胺四乙酸四钠，用作金属离子螯合剂，消除微量重金属导致的酶催化反应中的抑制作用；(5)柠檬酸钠，在精液中起到缓冲剂、抗氧化等作用；(6)nahco3，在精液中起到酸碱缓冲剂的作用；(7)青霉素和链霉素，起到杀菌的作用；(8)甲基强的松龙，抑制子宫炎症、保护细胞膜、抗内毒素等作用；(9)牛血清白蛋白，起到维持渗透压、ph缓冲、营养以及生理和机械保护等作用。
本发明的有益效果：提供一种价格低廉、效益明显、安全可靠具有抑制子宫炎症的猪精液稀释粉及技术方法。良好的抑制了母猪子宫炎症对精子的损伤，从而提高猪精液的利用率以及提高母猪受胎率，同时稀释粉的抗内毒素作用有效提高猪精液的保存时间和质量，进而提高母猪受胎率。该稀释粉原料来源充足，加工工艺具有简易高效、成本低廉、安全可靠等特点，提高了养猪业的生产效益、优良种猪的利用率以及减缓环境压力，易于大规模地推广和使用。
具体实施方式：
实施例1
一种猪精液的保存方法以及母猪授精的方法，具体操作方法如下：
(1)稀释粉溶解：室温下，将多功能猪精液稀释粉与水按50:1000的质量比例混合均匀，得稀释粉水溶液；
(2)猪精液处理：将人工采集的猪精液经1800r/分钟离心5min后取沉淀物，与步骤(1)所得的稀释粉水溶液混合，将沉积物稀释至1×108个/ml，得猪精液稀释液；
(3)人工授精：利用步骤(2)所得的猪精液稀释液对母猪进行人工授精，即可抑制母猪子宫炎症对精子的损伤。
所述的多功能猪精液稀释粉是由下列组分按质量份数比例混合而成：25-30份无水葡萄糖、5份三羟甲基氨基甲烷、2份柠檬酸、1份乙二胺四乙酸四钠、5份柠檬酸钠、0.5份nahco3、0.5份青霉素、0.5份链霉素、0.05份甲基强的松龙和2份牛血清白蛋白。
实施例2
一种猪精液的保存方法以及母猪授精的方法，具体操作方法如下：
(1)稀释粉溶解：室温下，将多功能猪精液稀释粉与水按55:1000的质量比例混合均匀，得稀释粉水溶液；
(2)猪精液处理：将人工采集的猪精液经1800r/分钟离心5min后取沉淀物，与步骤(1)所得的稀释粉水溶液混合，将沉积物稀释至3×108个/ml，得猪精液稀释液；
(3)保存：将步骤(2)制得的猪精液稀释液，置于17℃培养箱保存，每间隔12小时混匀，保存3天；
(4)人工授精：利用步骤(3)所得的保存3天的猪精液稀释液对母猪进行人工授精，即可抑制母猪子宫炎症对精子的损伤。
所述的多功能猪精液稀释粉是由下列组分按质量份数比例混合而成：30份无水葡萄糖、10份三羟甲基氨基甲烷、5份柠檬酸、3份乙二胺四乙酸四钠、10份柠檬酸钠、2.0份nahco3、1.0份青霉素、2.0份链霉素、0.10份甲基强的松龙和6份牛血清白蛋白。
实施例3
一种猪精液的保存方法以及母猪授精的方法，具体操作方法如下：
(1)稀释粉溶解：室温下，将多功能猪精液稀释粉与水按52:1000的质量比例混合均匀，得稀释粉水溶液；
(2)猪精液处理：将人工采集的猪精液经1800r/分钟离心5min后取猪精子沉淀物，将猪精子沉淀物与步骤(1)所得的稀释粉水溶液混合，将沉积物稀释至2×108个/ml，得猪精液稀释液；
(3)保存：将步骤(2)制得的猪精液稀释液，置于17℃培养箱保存，每间隔12小时混匀，保存5天；
(4)人工授精：将步骤(3)所得的保存5天的猪精液稀释液对母猪进行人工授精，即可抑制母猪子宫炎症对精子的损伤。
所述的多功能猪精液稀释粉是由下列组分按质量份数比例混合而成：27.50份无水葡萄糖、5.65份三羟甲基氨基甲烷、2.90份柠檬酸、2.60份乙二胺四乙酸四钠、6.90份柠檬酸钠、1.00份nahco3、0.60份青霉素、1.00份链霉素、0.08份甲基强的松龙、4.00份牛血清白蛋白。
对比例
与实施例3的区别仅在于所述的稀释粉中不含有甲基强的松龙。
对比试验
针对实施例3和对比例中不同稀释粉对猪精液处理方法，分别进行试验操作。在不同的保存天数下，通过迈朗精子全自动分析仪分别测定了猪精液精子活力、精子畸形率、直线速度及抗内毒素能力；精子质膜完整性检测通过sybr-14染料和碘化丙锭(购自invitrogen公司)染色法鉴别，通过荧光显微镜显色，统计精子头部为绿色占精子总数的百分率；总抗氧化能力检测通过t-aoc试剂盒(购自南京建成生物科技有限公司)完成；同时测定了猪精液抑制嗜中性粒细胞活性效果(趋化性、吞噬性)以及窝产仔猪数，其中窝产仔猪数指标通过人工授精待产后统计各母猪产仔猪头数获得。
其中，猪精液抑制嗜中性粒细胞活性效果(趋化性、吞噬性)的检测方法如下：
步骤一、在趋化小室(购自其林贝尔仪器制造有限公司)的下层注入精液200μl，在上层中注入含嗜中性粒细胞(通过血液离心法获得)的稀释液400μl，趋化小室置于培养箱培养。培养后取出趋化膜(购自neuroprobe公司)，对趋化膜染色，通过400倍显微镜观察多个视野区趋化膜上嗜中性粒细胞的个数；
步骤二、在4孔培养皿中注入含嗜中性粒细胞和猪精子的稀释液各50μl，培养皿置于培养箱培养。通过400倍显微镜观察每个样本200个以上嗜中性粒细胞(pmns)的吞噬情况，最后计算嗜中性粒细胞对精子的吞噬率(吞噬精子个数/总数pmns个数＝吞噬率)。
数据分析利用spss(25)软件对试验所测定的各项指标进行方差分析，所有数据均以“平均数±标准差”表示。数据如下表1至7所示(表1至7中，同列数据肩标字母不同差异显著，p<0.05)：
表1.不同稀释粉对猪精子活力的影响
表2.不同稀释粉对精子质膜完整性的影响
表3.不同稀释粉对精子精子畸形率的影响
表4.不同稀释粉对精子总抗氧化能力的影响
表5.不同稀释粉对精子抗内毒素能力的影响
表5.1不同稀释粉对精子活力的影响
表5.2不同稀释粉对精子直线速度的影响
表6.不同稀释粉对嗜中性粒细胞活性的影响
表7.不同稀释粉对窝产仔猪数的影响
从以上数据可以看出，随着猪精液保存时间的延长，表1中实验组精子活力逐渐优于对照组。表2中实验组精子质膜完整性逐渐优于对照组，可良好保护细胞膜结构，维持猪精子正常代谢。而表3中实验组畸形率低于对照组，为正常的受精提供保障。在总抗氧化检测结果表4中显示实验组精液总抗氧化性逐渐优于对照组，原因在于质膜完整性维持了精子的抗氧化能力，延长了保存时间。在抗毒性检测结果中表5显示精子活力和直线速度对照组1低于对照组2，说明内毒素对精子有毒害作用，而实验组2与实验组3无差异且高于对照组1、2，表明本发明稀释粉有良好的抗内毒素效果。在抑制嗜中性粒细胞活性检测结果表6中显示对精子的趋化性和吞噬性实验组低于对照组，说明本发明稀释粉有良好的抑制嗜中性粒细胞活性以及子宫炎症。在窝产仔猪数结果表7中显示实验组高于对照组1.5头，可一定程度提高窝产仔猪数。
通过对上述数据的分析和原理阐释，可以看出本发明稀释粉可有效抑制嗜中性粒细胞活性以及子宫炎症，提高精液质量以及精子抗内毒素能力，同时提高窝产仔猪数1.5头。
上述内容仅为本发明的较佳实施例，并非用于限制本发明的实施方案，本领域普通技术人员根据本发明的主要构思和精神，可以十分方便地进行相应的变通或修改，故本发明的保护范围应以权利要求书所要求的保护范围为准。