专利名称:农业细菌接种物的制作方法
本发明涉及农业细菌产品，包括根瘤菌接种物以及制造和保存这些农业细菌产品的方法。
众所周知，豆科植物在某些条件下可直接从空气“固氮”并将其转变成含有机氮的化合物，因而将氮提供给植物作蛋白质合成并通过将含氮营养物留在土壤中来使豆科植物周围的土壤变肥供以后的作物之用。当然，在实际上，植物本身并不固氮，但固氮发生在根瘤菌中，该菌是在植物根部所形成的根瘤中与豆科植物共生地存在着。能与根瘤菌形成共生关系的豆科植物的例子为豌豆、蚕豆、紫苜蓿、红三叶草、白三叶草、巢菜、羽扁豆等等。
其他在农业上很重要的非豆科植物如禾本科植物和谷物不能从空气直接固氮。非豆科植物一般完全依赖于土壤中的结合氮，如硝酸盐及铵盐来提供进行蛋白质合成所需的氮。在任一给定的田地上已经种过了一系列这类作物之后，在土壤中的结合氮就被消耗掉。因而常常进行作物轮作，从而固氮植物与非固氮植物轮种以补充土壤中的氮。再者，一些豆科植物特别是大豆、豌豆、蚕豆及紫苜蓿作为作物本身在商业上是很重要的，而且这些作物的生长由于能获得丰富的结合氮而大为便利。
某一固氮植物所需的特定的根瘤菌可能并不普遍存在于土壤之中。不同的根瘤菌种仅适用于在专门的豆科植物中形成根瘤。因而十分普遍的做法是用适当的根瘤菌的培养物对豆科植物的种子接种。人工接种可以在种子上涂上、在种植的种子或作物上撒上接种物或可在种植的豆科种子的沟中撒上接种物来进行。
对豆科种子接种的一种方法是通过将细菌的潮湿培养物与诸如腐殖质或泥炭之类的载体相混合以使根瘤菌培养物维持在活的状态。这种载体维持细菌在潮湿生活状态。然而，这样的活的细菌培养物的货架寿命(贮藏寿命)相对较短，因为在贮存条件下由于在其环境中食物及潮气的相对短缺而使细菌死亡。在授予爱雷克生(Erickhson)的美国专利第2，726，948号中，描述有潮湿类型的接种混合物的例子，其中活性潮湿细菌的培养物是与泥炭、木炭及石灰石的混合物相混合，因而水是在约为混合物总重量的38%的水平上。
另一种制备豆科植物种子接种物的方法是将细菌培养物转变到休眠状态。如在授予斯考特(Scott)等的美国专利第3，168，796号中所描述的那样，用以产生休眠细菌的一种已知方法是冷冻-干燥。在斯考特专利中，将根瘤菌在-35～-70℃的温度范围中进行冷冻-干燥。然后将干燥了的细菌饼进行磨碎，并与粉状载体混合，该载体是一种尺寸小于40微米的非吸湿性的惰性粉末。在斯考特专利中，细菌对载体的重量比为5～400毫克细菌/英两载体。根据斯考特专利，在将细菌与载体进行混合的步骤期间，排除掉水是至关重要的。
尽管在与载体混合之前，冷冻-干燥根瘤菌通常可得到高的起始回收率，但细菌在长保存期间中并不总是保持稳定的。因而提供一种干燥且休眠的细菌接种物是有利的，而且这种接种物可以很容易制备出来并在相当长的保存时间内是很稳定的，且在重新曝露到潮气中后，有活力的根瘤菌的数量也大。
有人已提出看法认为其它的非根瘤菌的细菌可能对一些作物是有利的。许多陆地上的细菌菌种是已知的很可能是由于在植物与细菌之间所形成的共生关系，其中一些细菌对田间作物的栽培是特别有用。结果是这类共生关系被确定了，那么为了利用此共生现象就需有效地将细菌施加到田地之中去。
本发明可概述为一种制造在农业上有用的在惰性粒状载体上含有休眠细菌培养物的干燥的组成物的方法。根瘤菌或其它种细菌的菌落是成批培养的，并将其从培养基中分离出来，在无菌的条件下温度为约0～30℃的范围内，保持约0到96小时。然后将细菌与在化学上呈惰性的多孔的粒状载体相混合，以致使细菌对培养物的重量比是在约0.5～1.5的范围。然后细菌与载体的混合物在无菌条件下，在室温下，空气干燥约2～10天。
本发明的目的是提供一种制造在农业上有用的包括有活力的休眠细菌(或是根瘤菌或其他有用的细菌菌种)的组成物的方法。
本发明的进一步目的是为豆科植物提供一种种子涂层，该涂层包括根瘤菌接种物，其中涂层与种子在长的保存期间内将是稳定的。
本发明的另一目的是提供一种细菌接种物，其中细菌是休眠的容易处理，而且在持久的保存期间，细菌将是稳定和活的。
本发明的其他目的、优点及特征从下面的详细说明中可很明显地看出。
本发明揭示了一种制造在农业上有用的包含有活力的细菌成分(根瘤菌特别有用)的组成物的方法。细菌培养物本身可以有效地在半固体支持物如AMA-琼脂上或在液态(AMA-液体)中生长(AMA为美国医学协会)。在大量的适当的所要的根瘤菌或其他细菌的菌种被培养以后，从培养基中收获细菌。适合的根瘤细菌菌种包括用于大豆的大豆根瘤细菌(R.japonicum)，用于三叶草的三叶草根瘤细菌(R.trifolii)用于紫苜蓿和草木犀的苜蓿根瘤细菌(R.meliloti)，用于豌豆及巢菜的豌豆根瘤细菌(R.leguminosarum)，用于菜豆的菜豆的根瘤细菌(R.phascoli)及用于羽扁豆的羽扁豆根瘤细菌(R.Lupini)。此外也可以用各自的根瘤菌种的混合物。所选择的收获方法视使用的培养物的类型而定。例如，如果采用半固体支持物如AMA-琼脂那么可从琼脂顶上刮下培养物来收获细菌。如果采用液体培养物则可用离心法从其培养基中分离细菌。
一旦根瘤菌已基本上从培养基分离出来后;细菌在无菌条件下在温度为约0～30℃的范围内保持约0～96小时。最好是细菌悬浮液在无菌条件下温度在约22～30℃(即正常室温)的范围内保持约3到25小时，接着在无菌条件下温度在约0～15℃的范围内，进一步把细菌悬浮液保持约3～20小时。在此步骤时细菌要保持浓缩的液体悬浮。在此阶段，在大量液体培养基被去掉之后，细菌不再能很活跃地生长。对于根瘤细菌来说，细菌密度应为107～1012个细菌/毫升的数量级。浓缩的细菌悬浮液看起来应更像粘糊的稠密的液体。
然后，将浓缩的细菌悬浮液与多孔的化学上呈惰性的粒状载体相混合，且使浓缩的细菌悬浮液对干燥载体的重量比为约0.5～1.5的范围内，最好约为1.0。适合的载体的例子包括蛭石，珍珠岩和活性炭。如用活性炭则那饱和的糖溶液最好从蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨糖醇及阿东糖醇所组成的一组中选用，并在细菌保持在0～30℃的步骤之前，将该溶液加到细菌悬浮液之中。加到细菌悬浮液的饱和糖溶液的重量是按重量应为在约0，5～1.5的范围内的比例，最好约为1.0。活性炭载体是有利的，对于某些应用来说是更好的，因为活性炭可以吸收对根瘤细菌有毒的化合物，如生物碱和木质素化合物，它们是在发芽期间由许多豆科植物种子自然地放出的物质。
下一步是将细菌-载体混合物慢慢地干燥，最好在无菌条件下在空气中在大约为室温即22～30℃下干燥约2到10天。准确的时间周期当然是随在液体培养物中细菌的浓度的变化而变化。干燥应继续到细菌与载体的混合物看起来全部为干燥为止。干燥了的混合物的剩余含水量应接近于环境的相对湿度。
在完成干燥之后所得到的组成物包括在松饼中干燥的休眠的，但有活力的根瘤菌和多孔的粒状载体。该松饼是易碎的以便提供成块的粗粒状产品。这种粒状产品可以不可以重新磨成更细的粉末形状决定于所用的特定运输方式。
因而，根据所用的运输方法，然后可将细菌与载体的混合物磨成相对地细的粉末，可用粘合剂或不用粘合剂使该粉末直接撒在或涂在豆科植物的种子上或者可在种植前或种植时撒在田地上。对较粗的粒状的细菌载体混合物可以不磨碎，然后在种植时可很容易地将干燥的粒状混合物直接引入到沟中以便使种子接种。因而，从细菌-载体混合物的干燥而产生的材料很容易地适用于不同的运输方法，如任何已知的应用所需要的那样。
由本发明所制备的用根瘤菌接种的豆科种子涂层包括根瘤细菌与多孔的在化学上呈惰性的载体的混合物，其中细菌-载体混合物已由空气干燥成基本上不潮湿的状态。浓缩的细菌培养液对干燥载体的重量比应在约0.5～1.5的范围内最好约为1.0。上述的任何根瘤细菌菌种都可用于这种豆科植物种子涂层上。最好的载体是从由蛭石，珍珠岩及活性炭所组成的一组中选用，豆科植物种子涂层还包括糖。糖以饱和溶液方式引入到细菌悬浮液中，糖溶液与细菌悬浮液的重量比为在约0.5～1.5的范围内，最好约为1.0。适用的糖的例子包括蔗糖、乳糖、海藻糖醇、山梨糖醇及阿东糖醇。最好是在对豆科植物种子涂覆之前将干燥的细菌-载体混合物磨碎。如果这样做，则这样磨碎最好在该混合物已经空气干燥后进行。
当此方法特别对根瘤菌种有用(其农业用途现已为公众所承认)时，已发现不管是农业上应用还是其他应用，它对于使其他非根瘤细菌菌种的有活力的培养液干燥也是有用的。
下列非模仿的例子用来说明本发明。
例1本例中所用的细菌是从美国路易斯安那州的大豆田中分离出来的大豆根瘤细菌菌株。在包括例1的五个实验中的每个实验中，细菌在AMA-琼脂中培养14天，在培养后，通过从琼脂支持物上刮下培养物来收获细菌。在本例中所试验用的两种载体为珍珠岩和活性炭。当用珍珠岩时，细菌首先在两种不同温度(T1及T2)中保持不同小时数，然后与珍珠岩载体相混合。当活性炭被选作载体时，细菌首先与等重量的饱和蔗糖相混合，然后在不同温度(T1及T2)下保持不同小时数。在细菌已保持所需的时间之后，然后将细菌与等重量的活性炭相混合。表1所示为包含例1的五个实验的条件。表2包含例1的试验的结果，并以每克干燥产品中的活的细菌数表示。该结果说明了用本发明的农产品所能得到的稳定性。
表1例1的条件载体/细菌 糖/细菌 小时 小时实验培养重量比重量比在T1在T2(a) 14天 0.5 - 4小时 18小时AMA-琼脂 珍珠岩 23℃ 10℃(b) 14天 1.0 - 4小时 18小时AMA-琼脂 珍珠岩 23℃ 10℃(c) 14天 1.0 - 18小时 7小时AMA-琼脂 珍珠岩 23℃ 10℃(d) 14天 1.0 1.0 4小时 18小时
AMA-琼脂 活性炭 蔗糖 23℃ 10℃(e) 14天 1.0 1.0 18小时 7小时AMA-琼脂 活性炭 蔗糖 23℃ 10℃表2例1的结果(每克干燥产品中有活力的根瘤菌数)实验 1周 11周 13周 43周 48周(a) 109109107(b) 109108108(c) 109109108(d) 109108106(e) 109109109108例2在本例中试验的大豆根瘤细菌是从美国依利诺斯州的大豆田中分离的。在包括本例的四个实验中，用了两种不同的培养方法。在前两个实验中，细菌在AMA-琼脂中培养14天。在本例的后两个实验中，细菌在AMA-琼脂中培养7天。如在例1中那样在收获细菌后，在与载体混合前，在不同温度下，将细菌保持不同的时间周期。也如同例1那样，当活性炭为载体时，细菌首先与相当重量的饱和蔗糖混合，然后细菌保持在温度T1。在例2中所用的条件在表3中说明。本例的结果列于表4。
表3例2的条件载体/细菌 糖/细菌 小时 小时实验培养重量比重量比在T1在T2(a) 14天 1.0 1.0 4小时 18小时琼脂 活性炭 蔗糖 23℃ 10℃
(b) 14天 0.5 - 4小时 18小时琼脂 珍珠岩 23℃ 10℃(c) 7天 1.0 - 4小时 18小时琼脂 珍珠岩 23℃ 10℃(d) 7天 1.0 22小时 -琼脂 珍珠岩 23℃表4例2的结果(每克干燥产品中的有活力的根瘤菌数)实验 1周 5周 11周 15周 48周(a) 107107(b) 10101010106(c) 1095×108(d) 1095×1082×108例3在本例中试验的细菌(大豆根瘤细菌)是从美国衣阿华州田地中分离的。例3的条件列于表5，而例3的结果则以每克干燥产品中有活力的根瘤菌数表示并列于表6。
表5例3的条件载体/细菌 糖/细菌 小时 小时实验培养重量比重量比在T1在T2(a) 14天 1.0 - 4小时 18小时琼脂 珍珠岩 23℃ 10℃(b) 14天 1.0 1.0 4小时 18小时琼脂 活性炭 蔗糖 23℃ 10℃(c) 7天 1.0 24小时 -
琼脂 珍珠岩 23℃表6例3的结果(每克干燥产品中的有活力的根瘤菌数)实验 1周 5周 6周 9周 14周 18周 19周(a) 10101010109107(b) 1010108106(c) 10101010109107例4在本例中试验的另一种大豆根瘤细菌是从美国路易斯安那州分离的。例4的条件列于表7，该例的结果列于表8。
表7例4的条件载体/细菌 糖/细菌 小时 小时实验培养重量比重量比在T1在T2(a) 14天 1.0 - 4小时 18小时琼脂 珍珠岩 23℃ 10℃(b) 14天 1.0 1.0 4小时 18小时琼脂 活性炭 蔗糖 23℃ 10℃表8例4的结果(每克干燥产品中的有活力的根瘤菌数)实验 1周 5周 9周 14周 19周(a) 10101010108107(b) 1010109109108107例5在本例中所利用的另一大豆根瘤菌是从美国依阿华州分离的。例5的条件列于表9。本例的结果列于表10。
表9例5的条件载体/细菌糖/细菌在T1在T2实验 培养 重量比 重量比 小时 小时(a) 14天 1.0 - 4小时 18小时琼脂 珍珠岩 23℃ 10℃(b) 14天 1.0 1.0 4小时 18小时琼脂 活性炭 蔗糖 23℃ 10℃表10例5的结果(每克干燥产品中的有活力的根瘤菌数)实验 1周 5周 9周 14周 19周(a) 10101010109108107(b) 108108107例6在本例中，以相同方法对两种非根瘤菌进行试验。称为LAIC-2及LA Ic-6的两细菌培养物是从美国路易斯安那州的大豆植物的根中分离的。两种培养物都不会如根瘤菌那样使豆科植物结根瘤。两培养物都是杆菌形的，LA Ic-2是长杆菌形而LA Ic-6是短杆菌，而根瘤菌当然是短杆形的。两培养物都是革兰氏染色阳性(根瘤菌为革兰氏染色阴性)，两培养物在对根瘤菌培养物不利的营养肉汤及琼脂中却能生长良好。使用珍珠岩作为粒状载体，制备这些培养物中每个培养物的干燥混合物。检查该干燥制品并发现其含有的有活力LA Ic-2为1.2×10个细菌/克，而含有的有活力LA Ic-6则为1.9×10个细菌/克。在每种情况下，约5%细菌复活。
应该了解的是，对上述制造在农业上有用的细菌组成物及此处所述的农业细菌产品的方法进行改变很可能是在本发明的精神之内。例如将其他成分加到本发明的干燥细菌产品中可能是有利的。其他农业产品如对细菌无害的干的或液体的肥料或除草剂或杀虫剂都可以加到该混合物中。此外在使用此处所揭示的干燥的细菌组成物作为种子涂层是特别有用的同时，也可施在沟中或再湿润或喷射或以某些其他形式施用。因而，本发明并不限于上述说明，但应根据下列权利要求
进行解释。
权利要求
1.一种制造在农业上有用的休眠细菌的接种物的方法，包括的步骤为(a)在无菌条件下温度在约0～30℃的范围内将基本上从其培养基分离出来的细菌浓缩悬浮液保持约0～96小时的一段时间。(b)将细菌悬浮液与多孔的在化学上呈惰性的粒状载体混合，使得干燥载体对浓缩细菌悬浮液的重量比在约0.5到1.5的范围内；及(c)在无菌条件下在22～30℃之间，使细菌与载体的混合物进行空气干燥，干燥时间约为2～10天。
2.权利要求
1所述的方法，其中细菌是根瘤细菌。
3.权利要求
1所述的方法，其中载体是蛭石。
4.权利要求
3所述的方法，还包括将细菌与载体的混合物磨成粉末的步骤。
5.权利要求
1所述的方法，其中的载体为珍珠岩。
6.权利要求
5所述的方法，还包括将细菌与载体的混合物磨成粉末的步骤。
7.权利要求
1所述的方法，其中载体为活性炭，并且还包括在保持细菌在0到30℃的步骤前，将饱和的糖溶液加到细菌的步骤，使得该溶液对细菌悬浮液的重量比的范围约为0.5到1.5。
8.权利要求
7所述的方法，还包括将细菌和载体的混合物磨成粉末的步骤。
9.权利要求
7所述的方法，其中在糖溶液中的糖是从蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨糖醇、阿东糖醇所组成的一组中选用的。
10.权利要求
9所述的方法，还包括将细菌与载体的混合物磨成粉末的步骤。
11.一种制造在农业上有用的休眠细菌的接种物的方法，包括的步骤为(a)在无菌条件下，温度在范围为约22～30℃，将在最小量的液体培养基中的细菌的浓缩悬浮液保持约3～25小时;(b)在无菌条件下，温度在范围为约0～15℃，将细菌悬浮液再保持约3～20小时。(c)将浓缩的细菌悬浮液与多孔的化学上呈惰性的载体混合，使得干燥载体对浓缩细菌悬浮液的重量比在约0.5～1.5的范围内;及(d)在无菌条件下，使细菌与载体的混合物干燥约2～10天的一段时间。
12.权利要求
11所述的方法，其中细菌是根瘤细菌。
13.权利要求
11所述的方法，其中载体是蛭石。
14.权利要求
13所述的方法，还包括将细菌与载体的混合物磨成粉末的步骤。
15.权利要求
11所述的方法，其中载体是珍珠岩。
16.权利要求
15所述的方法，还包括将细菌与载体的混合物磨成粉末的步骤。
17.权利要求
11所述的方法，其中载体是活性炭，还包括在保持细菌在0到30℃的步骤前，将饱和糖溶液加到细菌中的步骤，使得糖溶液对细菌悬浮液的重量比的范围为约0.5～1.5。
18.权利要求
17所述的方法，还包括将细菌与载体的混合物磨成粉末的步骤。
19.权利要求
17所述的方法，其中在糖溶液中的糖从由蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨糖醇和阿东糖醇所组成的一组中选用。
20.权利要求
19所述的方法，还包括将细菌与载体的混合物磨成粉末的步骤。
21.一种豆科植物种子用的接种物，包括干燥的休眠的但有活力的根瘤菌与多孔的化学上呈惰性的载体的混合物，其中细菌与载体的混合物已被空气干燥成基本上不潮湿状态及干燥前浓缩的细菌悬浮液对干燥载体的重量比的范围为约0.5～1.5。
22.权利要求
21所述接种物的涂层，其中载体是蛭石。
23.权利要求
22所述的涂层，其中细菌与载体的混合物已经被磨成粉末。
24.权利要求
21所述接种物的涂层，其中载体是珍珠岩。
25.权利要求
24所述的涂层，其中细菌与载体的混合物已经被磨成粉末。
26.权利要求
21所述的接种物的涂层，其中的载体是活性炭，该涂层还包括糖。
27.权利要求
26所述的涂层，其中细菌、载体与糖的混合物已被磨成粉末。
28.权利要求
26所述的涂层，其中糖从蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨糖醇和阿东糖醇所组成的一组中选用。
29.权利要求
28所述的涂层，其中细菌、载体与糖的混合物已被磨成粉末。
30.一种农业上有用的组成物包括涂有由干燥的、休眠的但有活力的根瘤菌与多孔的、在化学上呈惰性的载体混合而成的涂层的豆科植物种子，其中细菌与载体的混合物已被空气干燥成基本上不潮湿的状态且干燥前浓缩的细菌悬浮液对干燥载体的重量比的范围是约0.5～1.5。
31.权利要求
30所述的种子，其中载体是蛭石。
32.权利要求
30所述的种子，其中细菌与载体的混合物已被磨成粉末。
33.权利要求
30所述的种子，其中载体是珍珠岩。
34.权利要求
33所述的种子，其中细菌与载体的混合物已被磨成粉末。
35.权利要求
30所述的涂层，其中载体是活性炭，该涂层还包括糖。
36.权利要求
35所述的种子，其中细菌、载体与糖的混合物已被磨成粉末。
37.权利要求
35所述的种子，其中糖营养物选自一个由蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨糖醇和阿东糖醇所组成的组。
38.权利要求
37所述的种子，其中细菌、载体与糖的混合物已被磨成粉末。
专利摘要
对一种制造在农业上有用的干燥休眠细菌的接种物的方法作了描述。为了制造接种物在无菌条件下，温度在约0～30℃的范围内，将基本上从其培养基分离出来的根瘤菌或其他细菌的悬浮液保持不同的时间。然后将细菌悬浮液与多孔的、在化学上呈惰性的粒状载体相混合，使得载体对细菌的重量比的范围是约0.5～1.0。最后在无菌条件下，将细菌与载体的混合物空气干燥约2到10天。
文档编号C12N1/04GK86102971SQ86102971
公开日1986年12月31日 申请日期1986年4月24日
发明者阿伦·波 申请人:阿格拉塞特斯导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan