专利名称：抗真菌植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有莴苣盘梗霉抗性的栽培莴苣[即Lactuca sativa(栽培莴苣)]植物。
真菌，莴苣盘梗霉是“霜霉病”病害的致病因子，这种病害每年都侵袭大批量的莴苣作物。莴苣育种者们已经尝试了许多年，试图繁育出对该真菌显示有抗性的莴苣，并且仅在将对莴苣盘梗霉的全身抗性导入到农艺学上重要的莴苣植物方面取得部分成功。
莴苣盘梗霉的一个特点是它能在相对短的时间间隔内产生新的菌株。新的莴苣盘梗霉菌株正不断地涌现。近来，至少已知有16个称为NL种的莴苣盘梗霉(36 Beschrijvende Rassenlijst voor Groentegewassen voor de Teelt onder Glas(1992)Eds.Aalbersberg IJ and Stolk J H，Centrum voor Plantenverdelingsen Reproductieonderzoek，Wageningen)并且也鉴别了其他种类的莴苣盘梗霉(Bonnier F J M等人(1992)Euphytica 61203-211)。已知的显示出对某些莴苣盘梗霉菌株有抗性的商品莴苣品种通常在其基因组中包含显性的抗性(Dm)基因，据认为其中的基因按基因至基因的系统起作用，该系统中的Dm基因或几个Dm基因与病原菌的显性无毒基因相一致(Bonnier，上文)。Dm是霜霉病的缩写;大写字母D表示该基因是显性的。只要没有证明抗性因子是由一个单个基因产生的，就将其特征记作为R。已经测定出对应于大多数R因子的Dm基因(R18因子例外)。在本文中使用的Dm基因术语也包含这样的R因子。
UPOV规则中描述的检测莴苣TG/13/4(1992年的最新修订本)和TG/13/7(1993年10月26日的最新修订本)的特异性、均匀性和稳定性的规定是指有用的Dm基因以及是指适合于测定莴苣中Dm基因存在的试验。UPOV中列举的有用的Dm基因是Dm2、Dm3、Dm4、Dm5/8、Dm6、Dm7、Dm10、Dm11、Dm16并且还包括R18因子。UPOV声明只有这些基因的测试应在常规方法基础上进行，并且检测Dm1、Dm4、Dm15和Dm10的存在需要特殊的试验。
向莴苣植物基因组中导入一个以上Dm基因并不产生显示出对莴苣盘梗霉有全身的和持续的抗性的莴苣类型。含有一个或多个能提供对特定莴苣盘梗霉菌株抗性的Dm基因的莴苣植株可显示出对其他莴苣盘梗霉菌株有很小的或没有抗性。
迄今在农艺学上重要的莴苣类型中的莴苣盘梗霉抗性(盘梗霉抗性)已在规定时间以外缺乏持久性。
为了所有这些原因，育种者们已经找到了另一种来源的盘梗霉抗性。这种抗性所基于的遗传机理并不依赖于Dm基因介导的抗性的遗传机理(在下文中将这种类型的抗性称为“非-Dm基因介导的抗性”)。
在一个野生莴苣品种Lactuca saligna(似柳树莴苣)中识别出非-Dm基因介导的抗性来源已有许多年了(Gustafsson I.(1989)Euphytica 40∶227-232;Netzer D.等人(1976)Hortscience 11(6)612-613)。已知非-Dm基因抗性至少在某些似柳树莴苣植株类型中能有效地抗所有已知莴苣盘梗霉菌株，尤其是抗所有可由有用的Dm基因和R18因子控制的菌株(参见UPOV，上文)。
在本领域内也将非-Dm基因介导的盘梗霉抗性称作为“水平抗性”和“免疫性”，即指它独立于Dm基因介导的抗性机理而起作用。从上面描述可得出，将非-Dm基团介导的抗性转移到商业上可接受的即栽培莴苣植株中是非常理想的。先前从未报道过这种形式的盘梗霉抗性被成功地转移到栽培莴苣中。将栽培莴苣和似柳树莴苣杂交的尝试导致产生了有不好的植物习性和繁殖力的表现型植株(de Vries I.M.(1990)Pl.Syst.Evol.171233-248)。
育种者所遇到的困难是由各种因素引起的，包括抗性基因的特性以及将来源于具盘梗霉抗性的不同类型的栽培莴苣(如野生型莴苣例如似柳树莴苣)的非-Dm基因介导的盘梗霉抗性成功地转移到可栽培的并由此而是农艺学上(和商业上)可接受的莴苣中的困难。的确非-Dm基因介导的盘梗毒抗性(如由似柳树莴苣中存在的非-Dm基因介导的盘梗霉抗性)被认为有隐性特性。再者，为了将非-Dm基因介导的盘梗霉抗性繁育到L.cativa中，首先必须使适用于育种程序的植株完全与栽培莴苣即农艺学上和商业上可接受的重要莴苣植株相一致。
现在已发现通过在F2水平上选择适合的莴苣盘梗霉抗性植株可以将与栽培莴苣不同源的非-Dm基因介导的盘梗霉抗性成功地转移到栽培莴苣植株中。再者，这些现象似乎表明在F2代具有非-Dm基因介导的抗性的植株和植株缺乏生长活力(这种活力是使用筛选出的F2植株与商品品种之间回交以恢复植株活力所必需的)之间有联系。F2群体至少在对莴苣盘梗霉抗性的特性方面有分离。可将从包含非-Dm基因介导的抗性的F2中选出的莴苣植株与农艺学上重要的莴苣品系进行杂交，然后杂交产物可用于进一步育种。
本发明涉及栽培莴苣植物，该植物与具有仅基于Dm基因介导的抗性的抗莴苣盘梗霉抗性的栽培莴苣植株相比，能提供具有更宽响应性及更稳定的对莴苣盘梗霉的抗性。
本发明提供了具有抗莴苣盘梗霉抗性能力的栽培莴苣植株(本发明的栽培莴苣植株)，该植株的抗莴苣盘梗霉的抗性包含非-Dm基因介导的抗性。
非-Dm基因介导的抗性优选来源于似柳树莴苣。合适的是，本发明的栽培莴苣植株是完全可育的。
本发明的栽培莴苣植株在其基因组中可包括一种或多种Dm基因或者不包括之。
本发明的栽培莴苣植株即L.sativa植株是适合于食用的莴苣植株。本发明的栽培莴苣植株的所有种子本质上都能产生显示有对莴苣盘梗霉的非-Dm基因介导的抗性的栽培莴苣植株。所述植株的表现型特征是足够均匀的以致于为商业所接受并且符合商业主管当局所提出的标准。
本发明的栽培莴苣植株本质上可以是四倍体(2n＝2x＝36)或二倍体(即2n＝2x＝18)，但优选的是二倍体。本文中所述的术语“植物”包含植株部分、细胞和种子。
植株部分的例子包括适用于消费的部分(莴苣头和其叶)以及适合于植物产生的部分，例如器管组织(例如叶、茎、根、芽等)、原生质体、体细胞胚胎、花药、雄蕊、叶柄和培养细胞等。利用植物组织培养技术也可以从植株部分栽培或繁殖本发明的栽培莴苣植株。这些技术是本领域内已知的。
在受到莴苣盘梗霉菌株侵袭和/或感染时，本发明的栽培莴苣植物与本身具有一个Dm基因或几个Dm基因介导的抗性的莴苣植株相比，能够表现出抗更宽范围的莴苣盘梗霉菌株的抗性。因此，在试验条件下能够观察到非-Dm基因介导的抗性，并且在正常的田间或温室条件下也能观察到这种抗性。
本发明的栽培莴苣植株可由下列方法获得ⅰ)进行初始的杂交，其中一个亲本的遗传物质是由在子叶和真叶中显示有非-Dm基因介导的莴苣盘梗霉抗性的野生型莴苣植株提供的，另一亲本的遗传物质是由对莴苣盘梗霉无抗性的栽培莴苣植株提供的，接下来进行自花授粉产生F2代，选择在子叶期和真叶期具有抗莴苣盘梗霉菌株抗性的植株(R退化植株);然后ⅱ)a)将R退化植株与具有所需表现型的栽培莴苣植株进行杂交;
b)自花授粉以至少产生F2代;
c)选择产生的R退化植株以及d)如果需要，重复步骤a)至c)，直到获得与栽培莴苣植株相适应的莴苣植株;以及ⅲ)e)将从相适应的莴苣植株中选择出的R退化植株与显示有所需表现型的不同栽培莴苣植株进行杂交;
f)自花授粉以至少产生F2代;
g)选择产生的R退化植株，并且h)如果需要，重复步骤e)至g)以便获得栽培莴苣植株，以及
ⅳ)将ⅲ)中获得的植株自花授粉以至少获得F4代。
其中在进行杂交的所述方法中的任何阶段，阻止欲杂交的雌性亲本自花授粉。
通常，获得本发明植株的育种方法包括鉴别一种在子叶期和真叶期显示有抗莴苣盘梗霉抗性的合适的野生型莴苣植株。优选的是，野生型莴苣植株是一种携带非-Dm基因介导的抗莴苣盘梗霉抗性的似柳树莴苣植株。这一结论通过例如，栽培野生型植株群体并且用莴苣盘梗霉菌株的混合物感染这些植株，或者将这些植株在子叶发育阶段与各个莴苣盘梗霉菌株接触一段时间，然后在真叶期用莴苣盘梗霉再感染，并且选择出在两个阶段都显示有抗性的那些植株。如果叶子上没有显示可见的孢子形成则证明有抗性。如果在育种程序中使用这样一个步骤称为R退化试验，即显示有抗莴苣盘梗霉抗性的植株是R退化的。然后将选择出的在两个叶发育阶段都显示有抗性的野生型莴苣植株生长为成熟植株并且与对莴苣盘梗霉无抗性的栽培莴苣植株进行杂交。适用于初始杂交的栽培莴苣植株类型适合选自于显示有所需的农艺学特征的栽培莴苣植株。选择所有植株类型都可基于其表现型。通过简单地将杂交植株产生种子，收集F1种子并且播种以产生随后自花授粉的植株，制造F2代可以获得初始杂交的子代。
在另一种可选方法中，可使用胚状体挽救技术，其中可从胚状体阶段的杂交植株中收获初始杂交产物并且在合适培养基中将其培养直到已经形成根和芽。一旦已经形成了足够的根和芽，然后可将得到的小植株转移到土壤中并且在合适的温室条件下生长，直到已经建立起一个植株群，然后从中可以选出合适的植株进一步用于育种程序。适用于胚状体挽救方法的方案是本领域内已知的，例如Maisonneuve B.，Agronomie(1987)，7(5)313-319。然后如前所述使F1代自花授粉产生F2代，并且根据表现型从中选择合适的植株。然后按本文概述的方案将合适的F2植株进行R退化试验，并且将R退化植株与携带了农艺学上所需特征的合适的栽培莴苣植株进行杂交以特别用于恢复生长活力，自花受粉产生F2代，从中再次选出合适的植株进行R退化试验。重复该步骤，直到获得与栽培莴苣相适应的莴苣植株。然后可将由此获得的含有非-Dm基因介导的盘梗霉抗性的相适应的植株作为原始品系用于任何进一步的可栽培莴苣育种程序中。一种相适应性的莴苣植株是一种容易与栽培莴苣类型进行杂交并且是自我可育的。由于莴苣是自花授粉植株，因此建立含有非-Dm基因介导的莴苣盘梗霉抗性的合适的原始品系是重要的。为了确立一个相适应的品系是否显示有非-Dm基因介导的抗性，按本文对于野生型莴苣植株所作描述在子叶期和第一个真叶期时将其用莴苣盘梗霉菌株进行感染。因此，优选的是，提供一种与在基因组中包含非-Dm基因介导的莴苣盘梗霉抗性的栽培莴苣相适应的莴苣植株。一旦获得与栽培莴苣相适应的植株，重复R退化试验步骤，以及选择用于与栽培莴苣植株进行杂交的R退化植株，并且自花授粉以至少产生F2代，直到获得一个在其基因组中掺入了非-Dm介导的基因抗性的农艺学上吸引人的栽培莴苣类型。将筛选出的含有非-Dm基因介导的抗性的植株品系重复地进行自花授粉直到获得栽培莴苣植株。进行自花授粉是为了至少获得F4代，优选地是获得F5代，更优选的是获得F6代，据认为其中一代或多代中，非-Dm基因介导的抗性是稳定地掺入到基因组中。据认为这样的植株适合于生产可销售量的能产生在其基因组中包含非-Dm基因介导的莴苣盘梗霉抗性的栽培莴苣植株的种子。
自花授粉植株的杂交要求阻止用作为雌性亲本的植株进行自我繁殖。通过用手摘除能承受用手工摘除的再生器官的雄性部分或者通过化学方法和/或使用花中的水完成去除雄性部分而完成上述工作。所述上述去雄方法是本领域内公知的。
本领域内熟练的技术人员将会认识到上面概述的育种程序将占用许多年并且上面概述的育种程序适合于各种类型的可栽培莴苣(包括室内、温室、室外田间莴苣等等)的育种。
下面给出了进一步阐明本发明的实施例。同时也要理解到所述实施例不应看作是要以任何方式限制本发明。
实施例1通过将包含莴苣盘梗霉菌株的混合物的接种物应用到播种后第六天的叶上，并且分别在播种后13天和18天时观察子叶以及植株成年期的第一批叶的方法，从而检测S3113和S3114抗莴苣盘梗霉菌株N11到N116，以及其他分离到的内部命名为TV、ITA1和GER的盘梗霉真菌菌株的莴苣盘梗霉抗性。证明S3113和S3114对所检测的所有莴苣盘梗霉菌株都有抗性，如表1所示，其中通过Dm基因本身产生的抗性对至少一个莴苣盘梗霉菌株敏感。
在表1中，-和(-)分别表示对莴苣盘梗霉有抗性或部分抗性，以及(+)表示对莴苣盘梗霉敏感。
表1重要的Dm基因 盘梗梅NL种 S&G分离物 2 - - - - - - - + + - + - + + - + - - - + + + + + +- 3 - - - - - - - + - - + - + + + - - + + + + + + +- - 5/8 - - - - - - + + + - + - + + + + + + + + + + +- - - 6 - - - - - + + - - - + + + + + - + (-) + + - +- - - - 7 - - - - - + + + - + + + + + + - + + + + +- - - - - 11 - - - - - - - + - - - (-) + + + + + - + +- - - - - - 16 - - - - - - - - - - + + - - - + + - +- - - - - - - 18 - - - - - - - - - - - - - - - - + +S 3113 - - - - - - - - - - - - - - - - - -S 3114 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 2 - - - 7 - - - - - - + - - + - + - - - - + + + + +2 - - - - 11 - - - - - - - + - - - - - - + + + - + +- 3 - - 7 - - - - - - - + - + + + - - + + + + + + +- 3 - - - 11 - - - - - - - - - - - - - + + + + - + +- - 5/8 - 7 - - - - - + + - - - + + + + + - + + + + +- - 5/8 - - 11 - - - - - - - + - - - - (-) + + + + + + +- - - 6 - 11 - - - - - - - - - - - (-) + - + (-) + - - +2 3 - - 7 - - - - - - - - - + - + - - - - + + + + +2 3 - - - 11 - - - - - - - - - - - - - - + + + - + +- 3 5/8 - 7 - - - - - - - - - - + + - - + + + + + + +- 3 - 6 - 11 - - - - - - - - - - - - - - + (-) + - + +- - 5/8 6 - 11 - - - - - - - - - - - - + - + (-) + - - +2 - - - - - 16 - - - - - - - - - - - - - - - + + - +- 3 - - - - 16 - - - - - - - - - - - - - - - + + - +- - - - - 11 16 - - - - - - - - - - (-) + - - - + - - +- 3 - - - 11 16 - - - - - - - - - - (-) - - - - + - - +- - - - - - - 18 - - - - - - - - - - - - - - - - + +- - - 6 - - - 18 - - - - - - - - - - - - - - - - - +S 3113 - - - - - - - - - - - - - - - - - -S 3114 - - - - - - - - - - - - - - - - - -
实施例2用单个的莴苣盘梗霉菌株，以及NL16、GER和TV莴苣盘梗霉菌株的混合物分别检测S3113和S3114的抗莴苣盘梗霉抗性，并且与仅含有一个Dm基因介导的抗莴苣盘梗霉抗性的不同的商品莴苣品种的抗性进行比较。如从表2中所看到的，S3113和S3114对检测的所有莴苣盘梗霉菌株都有抗性，而仅含有Dm基因介导的抗性的莴苣类型对某些莴苣盘梗霉菌株敏感。
表2品种 Dm基因 NL16 Ita 1 TV、NL16和GER的混合物Dandie Dm 3 + + +UCDm 2 Dm 2 + + +Judy Dm 3,Dm 11 + + +Ramona Dm 3,Dm 11 + + +Safier Dm 3+Dm 7+Dm 16 + - +Capitan Dm 11 + + +Mariska R 因子 18 - + +S3113 - - -S3114 - - -接种物NL 16，Ita 1，NL 16+GER+TV的混合物在子叶期感染播种后0+6天观察子叶播种后0+13天观察叶播种后0+18天-抗性+敏感已于1993年5月19日将S3113和S3114保存于苏格兰的国际保藏机构，工业和海洋细菌有限公司的国家收集处(National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd，International Depository Authority，Scotland)，并且分别给予保藏号为NCIMB40556和NCIMB40557。
育种计划育种计划1该计划描述了一个最初将非-Dm基因介导的莴苣盘梗霉抗性导入到栽培莴苣中的育种程序的实施例。可将得到的植株S3113用于进一步的自花授粉。S3113在基因组中既含有非-Dm基因介导的盘梗霉抗性基因也含有Dm基因、Dm3和Dm11。
在这个育种程序中产生的雌性植株在图的左边，雄性植株在图的右侧。已将似柳树莴苣标记为“B28”，一种机构内部的命名，结果表明该植株含有一种经鉴定的对莴苣盘梗霉的非-Dm基因介导的全身抗性，B28-60是命名第一个农艺学上重要的莴苣品系的机构内部命名，在该品系中，导入了非-Dm基因介导的莴苣盘梗霉抗性，并且该品系与栽培莴苣相适应(即自我适应、完全可育、容易与栽培莴苣杂交)，并且可以在随后的所有育种程序中用作为原始品系。B28-60是由F2×Palmyran杂交后自交得到的F3。命名“Novir”是指第一个从INRA得到的对任何莴苣盘梗霉菌株没有抗性的莴苣。其它命名“Palmyran”、“Jessy”、“Ramona”、“Judy”、“Thirana”和“Penny”是指在其基因组中含有Dm基因、Dm3和Dm11的S&G Seeds BV商品品种。“E-207”、“E-99”是指机构内部制备的S&G种子试验品系。Ramsal-19是另一个可以在短时间的条件下生长，并且含有B28抗性的农艺学上重要的莴苣品系的机构内部命名。Ramsal-19用作为所有温室莴苣类型的原始系，并且是由F2×Ramona杂交后自交得到的F3。上述列出的所有品种与从至少是含有抗莴苣盘梗霉的非-Dm基因介导的抗性的F2选出的植株杂交。在整个育种计划的杂交和/或自交中使用的所有F2植株都是筛选出的R退化植株。将F2×Thirana，和F4×Judy杂交以便导入在商业上有吸引力的、经改善的商品表现型，借助于早期导入的B28抗性，该商品表现型还含有一个稳定导入的B28抗性。自交产生的F6即S3113被认为是作为在其基因组中稳定地导入B28抗性的品种。
育种计划2基本上按照育种计划1中选择的育种方式，所不同的是F2×E-207，即从杂交筛选得到的(自交得到的)F2植株与不同类型“E-99”、F2R(也是一种S&G Seeds B.V.试验品种)杂交，从F2R退化自交得到的F4与其它的商品类型“Penny”(一种S&G Seeds B.V.商品类型)杂交，并且自交得到来自于选定的的F2R退化植株的F6，即S3114。
育种计划1植株品系材料似柳树莴苣×栽培莴苣
育种计划2植株品系材料似柳树莴苣×栽培莴苣
权利要求
1.对莴苣盘梗霉有抗性的栽培莴苣植株，其特征在于它们在其基因组中包含非-Dm基因介导的莴苣盘梗霉抗性。
2.根据权利要求1所述的栽培莴苣植株，其特征在于非-Dm基因提供了抗荷兰盘梗霉种NL1-7、NL9-16、TV和ITA1的抗性。
3.根据权利要求1或2所述的栽培莴苣植株，其中非-Dm基因是从似柳树莴苣中获得的。
4.根据权利要求1-3中任何一项所述的栽培莴苣植株，其中可栽培的莴苣植株是完全可育的。
5.根据权利要求1-4中任何一项所述的栽培莴苣植株，该植株在其基因组中包含一个非-Dm基因和一个或多个Dm基因。
6.获得权利要求1-5所述的栽培莴苣植株的方法，该方法包含ⅰ)进行初始的杂交，其中一个亲本的遗传物质是由在子叶和真叶中显示有非-Dm基因介导的莴苣盘梗霉抗性的野生型莴苣植株提供的，另一亲本的遗传物质是由对莴苣盘梗霉抗性的栽培莴苣植株提供的，接下来进行自花授粉产生F2代，选择在子叶期和真叶期具有抗莴苣盘梗霉菌株抗性的植株(R退化植株);然后ⅱ)a)将R退化植株与具有所需表现型的栽培莴苣植株进行杂交;b)自花授粉以至少产生F2代;c)选择产生的R退化植株以及d)如果需要，重复步骤a)至c)，直到获得与栽培莴苣植株相适应的莴苣植株;以及ⅲ)e)将从相适应的莴苣植株中选择出的R退化植株与显示有所需表现型的不同栽培莴苣植株进行杂交;f)自花授粉以至少产生F2代;g)选择产生的R退化植株，并且h)如果需要，重复步骤e)至g)以便获得栽培莴苣植株，以及ⅳ)将ⅲ)中获得的植株自花授粉以至少获得F4代。其中在进行杂交的所述方法中的任何阶段，阻止欲杂交的雌性亲本自花授粉。
7.根据权利要求6所述的方法，其中起始杂交的雄性亲本是一种栽培莴苣植株，并且雌性亲本是一种似柳树莴苣植株。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中杂交中所用的雄性亲本是栽培莴苣植株，并且雌性亲本携带来自于似柳树莴苣的非-Dm基因介导的抗莴苣盘梗霉抗性。
9.根据权利要求6-8中任何一项所述方法获得的栽培莴苣植株。
10.根据权利要求1-5和9中任何一项所述的栽培莴苣植株的头或叶。
11.根据权利要求1-5和9中任何一项所述的栽培莴苣植株的种子或其它繁殖物质。
全文摘要
本发明公开了抗莴苣盘梗霉的、并且在其基因组中包含非-Dm基因介导的莴苣盘梗霉抗性的栽培莴苣植株，以及生产所述的抗莴苣盘梗霉抗性的莴苣的方法。
文档编号A01H5/10GK1099800SQ9410593
公开日1995年3月8日 申请日期1994年5月26日 优先权日1993年5月27日
发明者B·M·D·莫罗 申请人:山道士有限公司