专利名称：一种培育脱病毒良种苗木的方法
技术领域：
本发明属栽培植物良种苗木技术领域。
人类栽培的植物(农作物、果树、林木、花卉等)在其长期无性繁殖过程中，大多感染并积累了多种病毒。世界各地报道的苹果病毒有39种，梨病毒23种，葡萄病毒43种、草莓病毒25种、桃病毒39种、李病毒28种、甜樱桃病毒36种、酸樱桃病毒21种、杏病毒19种、柑桔病毒20种、还有香蕉病毒、马铃薯病毒，郁金香病毒、唐菖蒲病毒、无花果病毒等。这些病毒在植物细胞内干扰了正常的生理代谢活动，引起植物体生长减弱，早衰，植株矮化，叶片变色、卷曲、皱缩、黄化，果实畸形，变小，不着色，含糖量降低，落花、落果，使栽培植物产量减产20％-100％，给人类的农业生产带来巨大的经济损失。在现代高效优质农业经济中，栽培植物病毒病已引起全世界的高度重视。七十年代以前人们发现把栽培植物的枝条放置在高温条件下进行热处理，可使部分病毒钝化，暂时失去生物活性，能降低病毒病对植物体的危害程度。但这种热处理方法并没有彻底从植物体内清除病毒，经过一个较长时间后病毒又会在植物体内重新蔓延。特别是对那些多年生植物来说，这种热处理方法效果不佳。以后人们又发现病毒在植物体内分布是不均匀的。植物的茎尖和根尖的分生组织区和伸长区这一微小区域内没有病毒。于是人们应用植物组织培养方法，切取0.2-0.5毫米无维管束组织的茎尖进行组织培养，获得了脱病毒的苗木。但是这种茎尖脱病毒方法切取的茎尖很小需要在显微解剖镜下进行工作，具体操作十分困难，茎尖培养成活率、脱毒率也很低。进入九十年代后，人们又将热处理方法与茎尖培养方法结合起来进行脱病毒。先将要脱毒的植物茎尖(如盆栽苗木或试管苗)放置在35-40℃条件热处理1个多月，在高温下病毒被钝化，使其在植物体内的繁殖传播速度大减。在这一高温环境中长出的新植株茎尖很可能脱掉病毒，可切取较长的茎尖1-3毫米进行培养，能获得脱病毒苗木。目前生产中培育脱病毒良种苗木采用的是上述这种方法。在实际生产操作中切取较大的茎尖(如3毫米长)培养成活率高，但脱毒率很低；切取较小的茎尖(1毫米以内)脱毒率较高，但成活率很低，而且培养成活的脱毒试管苗还有可能发生变异，改变优良品种的性状。所以，在实际生产中这些问题始终困扰着人们培育脱病毒良种苗木的正常工作。
本发明目的就是针对上述情况，采用完全无光黑暗条件对苗木进行热处理培养，成倍的扩大了茎尖无病毒区域，再切取茎尖进行培养，即能够完全脱除病毒，提高脱毒率，又能够切取较长的茎尖，提高茎尖培养成活率，防止发生良种苗木的变异。为实际生产提供了一种新的高效率培育脱病毒良种苗木的方法。
本发明一种培育脱病毒良种苗木的方法是先将要脱病毒的苗木采用植物组织培养的方法，把它们培养成试管苗，最好是在试管内生根阶段的苗或丛生芽状阶段的苗。把这种生长旺盛的试管苗放置在完全无光黑暗的条件下进行热处理培养45-60天。热处理温度为35-40℃。或者将要脱病毒的盆栽苗木(最好是刚经过休眠阶段的苗木)放置在完全无光黑暗的条件下进行热处理培养45-50天，热处理温度为35-40℃。苗木经过45-60天的无光黑暗热处理以后，试管苗茎尖能长出1-4厘米长的淡黄色的几乎无叶片的新生茎尖；盆栽苗木能长出5-10厘米的淡黄色的顶端几乎无叶片的新生茎尖。对这些新生茎尖进行纵向石蜡切片观察发现试管苗新生茎尖的分生组织区和伸长区，这些无微管束区长度可达5-10毫米以上；盆栽苗木新生茎尖的分生区和伸长区(无微管束区)长度可达10-15毫米以上。病毒在植物体内主要就是通过微管束来传播的，微管束能将下部成熟植物体内的病毒传送到微管束区与伸长区交界处，茎尖分生区和伸长区无微管束，所以茎尖分生区和伸长区属于植物体上无病毒区域。通过无光黑暗热处理培养，阻止了植物体内正常的光形态建成过程，使茎尖的分生区和伸长区的细胞分化成微管束的过程被减慢，所以分生区和伸长区这一无病毒区域被扩大。再加上35-40℃的长期热处理，使植物体内的病毒被钝化，暂时失去植物活性，不能繁殖和快速传播。所以经过无光黑暗条件下热处理苗木的新生茎尖，无病毒区域被扩大。本发明的特点在于无光黑暗条件下长期热处理苗木，能极大地扩大新生茎尖的无病毒区域。
本发明一种培育脱病毒良种苗木的方法是第一条途径，按照植物组织培养方法，在无菌条件下切取经过无光黑暗热处理的新生茎尖长5-8毫米，接种到新配制的茎尖培养基上。在光照强度1500-3000勒克斯，温度25-28℃条件下进行培养，使茎尖生长，分化。经过几代反复扩大增殖培养，对每一个茎尖的无性系苗木进行病毒检测。采用指示植物检测法、酶联免疫法，电子显微镜检测法，确定这一无性系苗木完全脱病毒后，应用植物组培快速繁殖方法对脱病毒良种苗木进行繁殖，为生产提供大批量脱病毒良种苗木。第二条途径，经过无光黑暗热处理的盆栽苗木，可切取10-12毫米长的茎尖，嫁接到事先准备好的无病毒砧木上，每一个茎尖嫁接一个砧木。当茎尖接穗成活生长后，对每一个茎尖苗木进行病毒检测，确定这一茎尖苗木无病毒后，以这一脱病毒良种苗木为母体，剪取其新枝条作接穗，进行大量嫁接繁殖脱病毒良种苗木。本发明的特点在于切取5-8毫米长的经过无光黑暗热处理试管苗的茎尖，通过组培快速繁殖方法大量繁殖脱病毒良种苗木；切取10-12毫米长的经过无光黑暗热处理的盆栽苗木茎尖，通过嫁接方法大量繁殖脱病毒良种苗木。
采用本发明方法培育脱病毒良种苗木，具有操作方法简单、易行、脱病毒率和成活率很高等优点，在实际生产中应用效果良好。用本发明方法脱葡萄扇叶病毒、卷叶病毒、茎痘病毒，栓皮病毒，试管苗经过无光黑暗热处理培养后，可直接切取8毫米长的茎尖，不需要在显微解剖镜下操作切取0.3毫米长的茎尖，所以本发明方法操作简单易行。这样8毫米长的茎尖接种到培养基上成活率都在100％。用指示植物检测病毒，结果脱病毒率为100％。因此本发明方法脱病毒率高，成活率高。培育出来的脱病毒葡萄良种苗木在生产中栽培结果后，葡萄果粒增大，甜度明显提高，结果产量增产70-80％，经济效益显著增加。
实施例1冬季将经过休眠期的感染有梨石痘病毒的盆栽库尔勒香梨，放置在完全无光黑暗条件下，在38℃±1℃的环境中热处理培养60天。要定期给盆栽香梨浇水，防止因缺水造成苗木死亡。同时在温室中，播种无病毒的杜梨种子，培养杜梨营养钵苗作嫁接砧木。切取无光黑暗热处理的香梨茎尖10毫米长，操作时要注意刀具器械不要与茎尖下部组织相接触，以免交叉感染病毒。采用劈接法将香梨茎尖嫁接到杜梨砧木上，2周后香梨茎尖开始萌动、生长，茎尖嫁接成活率为80％，每一个茎尖嫁接一个砧木，并按顺序编号。春夏季香梨茎尖嫁接苗长大后进行病毒检测，可采用血清学快速检测法，检测结果脱除梨石痘病毒的苗木为95％。将培育得到的无毒库尔勒香梨良种苗木作为采穗母株，采其枝芽作接穗，大量繁殖脱毒香梨苗木，为生产栽培提供无毒良种苗木。
实施例2新疆哈密大枣感染病毒后，大枣变小，叶片出现明显缺绿斑块，落花落果严重，产量大幅下降。将感染病毒的哈密大枣，通过植物组织培养方法，培养出试管丛生芽。将这种哈密大枣试管苗放置在完全无光黑暗的条件下，在38℃±0.5℃环境中热处理培养50天。这时候哈密大枣试管苗重新生长出2-3厘米长的淡黄色无叶片茎尖。在无菌室的净化工作台上，直接切取8毫米长的茎尖，操作时刀具器械不要接触茎尖下部组织，防止病毒交叉感染新茎尖组织。将每一个茎尖分别接种到一个三角瓶中的新培养基中，并对每一个三角瓶中的茎尖进行编号。茎尖培养基为MS培养基+1.0毫克/升的激动素+1.0毫克/升的6-基氨基嘌呤+0.02毫克/升萘乙酸。在光照强度1500-3000勒克斯，温度25-30℃条件下，培养1周茎尖开始萌动、生长，茎尖培养成活率为100％。经过几代的诱导增殖培养，每个茎尖可以获得许多试管丛生芽。采用酶联免疫法对试管苗进行病毒检测，结果脱病毒率为100％。然后通过植物组培快速繁殖方法，大批量地生产脱病毒良种枣苗，为生产栽培提供无毒良种苗木。
权利要求
1.一种培育脱病毒良种苗木的方法，其特征在于对要脱病毒的苗木，先放置在完全无光黑暗的条件下，进行热处理培养一个时期，再切取较长的茎尖，培养出脱病毒良种苗木。
2.根据权利要求1所述的培育脱病毒良种苗木的方法，其特征是要脱病毒的苗木可以是试管苗，也可以是盆栽苗木。
3.根据权利要求1所述的培育脱病毒良种苗木的方法，其特征是热处理温度为35-40℃，热处理时间为40-60天。
4.根据权利要求1所述的培育脱病毒良种苗木的方法，其特征是切取试管苗茎尖的长度为5-8毫米，切取盆栽苗茎尖的长度为10-12毫米。
5.根据权利要求1所述的培育脱病毒良种苗木的方法，其特征是切取的茎尖可以通过植物组织培养方法培育出脱病毒苗木，也可以通过将茎尖嫁接到无病毒砧木上的方法培育出脱病毒苗木。
全文摘要
本发明将感染有各种病毒的苗木放置在完全无光黑暗的条件下,进行高温热处理培养,温度35—40℃,时间40—60天。经过无光热处理苗木茎尖的无病毒区域被扩大,可切取5—10毫米长的茎尖,通过植物组培快速繁方法和茎尖嫁接方法,培养出脱病毒良种苗木。本发明方法具有操作简单、易行,脱病毒率和茎尖培养成活率高,而且苗木无变异,能保持良种苗木的全部优良特性等优点。本发明为培育脱病毒良种苗木提供了一个新的方法。
文档编号A01H4/00GK1255283SQ9812326
公开日2000年6月7日 申请日期1998年11月29日 优先权日1998年11月29日
发明者陈方, 李康 申请人:陈方, 李康