灵长类动物精液无甘油超低温冷冻保存的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于动物繁殖技术领域，具体涉及一种灵长类动物精液无甘油超低温冷冻保存的方法。
【背景技术】
[0002]精子的冷冻保存为濒危灵长类动物遗传资源的保护及人工饲养繁殖提供了一条有效的途径。防冻剂是影响精子冷冻存活率的一个极为重要的因素，在灵长类动物精子冷冻中，甘油仍是使用最广泛的渗透性防冻剂，但是甘油对精子的毒害作用又会使精子丧失运动能力和受精能力。
[0003]近年来，有研究人员报道了用其他渗透性防冻剂代替甘油冷冻保存非灵长类动物的精子并获得成功，这激起了人们将非甘油的渗透性防冻剂用于灵长类动物精子冷冻研究的兴趣。然而，有限的资料表明非甘油的防冻剂对灵长类动物精子冷冻保存的效果很不一致。Feradis等分别用甘油、二甲基亚砜和丙二醇来冻存取自食蟹猴附睾的精子，结果发现二甲基亚砜具有和甘油一样好的冻存效果，而丙二醇的冻存效果要差得多。与此相反的是，Sadleir对黑猩猩精子所做的冷冻研究表明甘油的冻存效果明显比二甲基亚砜的好，Gould和Styperek也发现二甲基亚砜对黑猩猩精子冷冻保存的效果不如甘油，而且用二甲基亚砜冻存的黑猩猩精子不能进行体外受精。
[0004]除上述几种渗透性防冻剂外，乙二醇也被用于羊精子和马精子冷冻的研究，而且有实验显示乙二醇对精子细胞的毒性低于甘油，然而，能否用它代替甘油来冻存灵长类动物精子却未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对上述现有技术中存在的不足，提供一种灵长类动物精液无甘油超低温冷冻保存的方法，用毒性较低的乙二醇代替甘油进行灵长类动物精液的超低温冷冻保存，实现用冷冻复苏精液成功进行灵长类动物的体外受精或人工授精。
[0006]本发明采取如下技术方案进行:
一种灵长类动物精液无甘油超低温冷冻保存的方法，通过以下步骤实现:
(1)冷冻保护液的配制
A)、称取1g乳糖、Ig葡萄糖、10000IU青霉素G钠盐、5mg硫酸链霉素依次溶于70mLMill1-Q超纯水中，再加入1mL卵黄并将其混合均匀，然后加水定容至10mL,于7000g离心Ih去除卵黄颗粒，取上清液用NaOH或HCl调节pH至7.0-7.2，制成冷冻保存稀释液；
B)取18mL上述稀释液，加入2mL乙二醇，预冷至4°C，得2X冷冻保护液；
(2)精液冷冻
A)室温下将灵长类动物精液与上述稀释液按1: 9的体积比在试管中混合，然后于4°C冰浴降温2小时；
B)、降温后的精子试管中缓慢加入等体积、预冷至4°C的2X冷冻保护液，继续在4°C平衡30分钟；
C)、平衡结束前，将防冻后的精子分别装入0.25 mL冷冻麦管并用封口机加热封口 ；
D)、将封口后的麦管置于液氮面上方5cm处熏蒸冷冻10分钟后投入液氮中冷冻保存；
E)、复苏时将冷冻麦管由液氮中迅速转移至37°C的水浴中解冻2分钟。
[0007]所述步骤(2)中的室温为20-23°C。
[0008]所述步骤(2)中是将冷冻保护液分五次加入试管，每次加入1/5体积，每次间隔5分钟，乙二醇的终浓度为5% (v/v)0
[0009]本发明的优点是:
本发明采用毒性较低的乙二醇代替甘油进行灵长类动物精液的超低温冷冻保存，冻存效果与含甘油的防冻剂无显著差异，为低毒防冻剂的研发提供科学依据。
【具体实施方式】
[0010]以下通过实施例对本发明做进一步描述。
[0011]实施例1:
称取1g乳糖、Ig葡萄糖、10000IU青霉素G钠盐、5mg硫酸链霉素依次溶于70mLMill1-Q超纯水中，再加入1mL卵黄并将其混合均匀，然后加Mill1-Q超纯水定容至10mL,于7000g离心I h去除卵黄颗粒；取上清液用IN NaOH或HCl调节pH至7.0-7.2，制成冷冻保存稀释液；向稀释液中加入体积比为10%的乙二醇制成2X防冻液；20-23°C室温下，将食蟹猴精子与稀释液按1:9的体积比在试管中混合，然后于4°C冰浴降温2小时；将等体积、预冷至4°C的2X防冻液缓慢加入降温后的精子中，继续在4°C平衡30分钟；将精子分别装入0.25 mL冷冻麦管并用封口机加热封口；将麦管置于液氮面上方5cm处熏蒸冷冻10分钟后投入液氮中保存。
[0012]对冷冻复苏的精子，分别检测其精子运动度、质膜完整率和顶体完整率，质膜完整性的检测采用荧光染料Hoechst 33342 (H342)和碘化丙锭(PI)双重荧光染色法，精子顶体完整性检测采用异硫氰酸荧光素标记的花生凝集素(FITC-PNA)荧光染色法进行，结果表明:冷冻复苏后的精子运动度、质膜完整率及顶体完整率分别为46%、55%和82%。
[0013]实施例2:
称取1g乳糖、Ig葡萄糖、10000IU青霉素G钠盐、5mg硫酸链霉素依次溶于70mLMill1-Q超纯水中，再加入1mL卵黄并将其混合均匀，然后加Mill1-Q超纯水定容至10mL,于7000g离心I h去除卵黄颗粒；取上清液用IN NaOH或HCl调节pH至7.0-7.2，制成冷冻保存稀释液；向稀释液中加入体积比为10%的乙二醇制成2X防冻液；20-23°C室温下将猕猴精子与稀释液按1:9的体积比在试管中混合，然后于4°C冰浴降温2小时；降温后的精子试管中分五次缓慢加入等体积、预冷至4°C的2X防冻液，每次加入1/5体积，每次间隔5分钟，乙二醇的终浓度为5% (v/v)，然后继续在4°C平衡30分钟；将防冻后的精子分别装入0.25 mL冷冻麦管并加热封口 ；将麦管置于液氮面上方5cm处熏蒸冷冻10分钟后投入液氣中保存。
[0014]对冷冻复苏的精子，分别检测其精子运动度、质膜完整率和顶体完整率，质膜完整性和顶体完整性的检测分别采用荧光染料Hoechst 33258 (H258)和异硫氰酸荧光素标记的花生凝集素(FITC-PNA)荧光染色法进行，结果表明:冷冻复苏后的精子运动度、质膜完整率及顶体完整率分别为45%、54%和82%。
[0015]上述实例仅仅是为清楚的说明本发明所作的举例，对于所述领域的普通技术人员来说，由此引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
【主权项】
1.一种灵长类动物精液无甘油超低温冷冻保存的方法，其特征在于，步骤如下: (1)冷冻保护液的配制 A)称取1g乳糖、Ig葡萄糖、10000IU青霉素G钠盐和5mg硫酸链霉素，依次溶于70mLMill1-Q超纯水中，再加入1mL卵黄并混合均匀，然后加水定容至10mL,于7000g离心Ih去除卵黄颗粒，取上清液用NaOH或HCl调节pH至7.0-7.2，制成冷冻保存稀释液； B)取18mL上述稀释液，加入2mL乙二醇，预冷至4°C，得2X冷冻保护液； (2)精液冷冻 A)室温下将灵长类动物精液与上述稀释液按1: 9的体积比在试管中混合，然后于4°C冰浴降温2小时； B)降温后的精子试管中缓慢加入等体积、预冷至4°C的2X冷冻保护液，继续在4°C平衡30分钟； C)平衡结束前，将防冻后的精子分别装入0.25 mL冷冻麦管并用封口机加热封口 ； D)将封口后的麦管置于液氮面上方5cm处熏蒸冷冻10分钟后投入液氮中冷冻保存； E)复苏时将冷冻麦管由液氮中迅速转移至37°C的水浴中解冻2分钟。
2.根据权利要求1所述的一种灵长类动物精液无甘油超低温冷冻保存的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的室温为20~23°C。
3.根据权利要求1所述的一种灵长类动物精液无甘油超低温冷冻保存的方法，其特征在于，所述步骤(2)中将2X冷冻保护液分五次加入试管，每次加入1/5体积，每次间隔5分钟，乙二醇的终浓度为5% (v/v)0
【专利摘要】本发明公开一种灵长类动物精液无甘油超低温冷冻保存的方法，本发明采用毒性较低的乙二醇代替甘油进行灵长类动物精液的超低温冷冻保存，冻存效果与含甘油的防冻剂无显著差异，为低毒防冻剂，有助于用冷冻复苏精液进行灵长类动物的体外受精或人工授精。
【IPC分类】A01N1-02
【公开号】CN104521945
【申请号】CN201410847292
【发明人】李亚辉, 杨明华
【申请人】云南农业大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月31日