一种青枯菌噬菌体的应用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于作物细菌性病害防控技术领域，具体涉及一种青枯菌噬菌体的应用方法。
【背景技术】
[0002]青枯病是由應(简称青枯菌)侵染引起的系统性病害，它是一种典型的维管束病害，最显著的症状是枯萎，发病严重时会造成整株死亡，给农作物生产造成重大经济损失。在农作物的种植生长过程中，青枯病的防治有化学药剂防治、合理轮作如玉米轮作、种植抗病品种、提前移栽避开青枯病发生高峰期、调整土壤微生物结构、施用功能型生物有机肥等综合措施防控青枯病，但仍然不能完全有效的防控青枯病的发生。对青枯菌具有专一性和裂解性的青枯菌噬菌体能控制土壤中或植株中青枯菌的数量，降低青枯菌的致病力，在青枯病的生物防控中具有良好的应用前景，但是噬菌体的应用方式受到很多环境因素如紫外线、阳光、雨水等因素的影响。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种青枯菌噬菌体的应用方法，为简便快捷和有效地利用青枯菌噬菌体防控青枯病提供一种应用方法，该方法可以减少青枯菌噬菌体的施用量，避免阳光、紫外线、雨水等外界因素的影响，还能避免或延缓病原青枯菌与其噬菌体因长期接触通过的协同进化作用而获得对噬菌体的抗性。
[0004]本发明的技术方案为:将青枯菌噬菌体液置于斜插在烟株茎杆的无菌注射器针头中，然后用无菌矿物油覆盖青枯菌噬菌体液防止蒸发和污染，使青枯菌噬菌体通过无菌注射器针头直接进入烟株茎杆中。
[0005]青枯菌噬菌体液的制备方法为:采用共培养的方法扩繁青枯菌噬菌体株系，在灭菌后的500ml三角瓶中，加入300mlCPG液体培养基和300 μ I含青枯菌的无菌水，在28°C下震荡培养2-4h，吸光值OD6c?约为0.2-0.3之间，再加入300 μ I含噬菌体的无菌水，在28°C下继续震荡培养2-3h ;之后以8000r/min的转速离心培养液lOmin，取上清液，用0.22 ym的滤膜过滤，取滤液备用。
[0006]CPG液体培养基采用以下方法制作:水解酪蛋白:lg ;蛋白胨:10g ;葡萄糖:5g ;蒸馏水:1000ml ;酸度调节到约pH7.0，在121°C下灭菌30min ;冷却至55°C左右，分装到培养皿中备用。
[0007]无菌矿物油的制备方法为:将300ml矿物油倒入500ml螺口瓶，在121°C下灭菌30min，然后冷却后保存备用。
[0008]无菌注射器针头的制备方法为:用无菌水泡针头过夜，无菌水冲洗两次，高压灭菌后50°C烘干，待冷却至室温后，分装好保存备用。
[0009]前述每个烟株茎杆注射青枯菌噬菌体液50-100微升。
[0010]前述在插入烟株茎杆的无菌注射器针头中，滴入无菌矿物油的量为50-100微升。
[0011]前述烟株茎杆输入青枯菌噬菌体时间为:烟株移栽到培养钵或田间后的旺长时期。
[0012]本发明根据青枯病是典型细菌性维管束病害的特征，设计利用噬菌体资源以防治青枯病的应用方法，将青枯菌噬菌体液通过无菌注射器针头直接输入烟株茎杆中，该方法应用于作物青枯病的防控，可以减少青枯菌噬菌体的施用量，避免阳光、紫外线、雨水等外界因素的影响，还能避免或延缓病原菌青枯菌与其噬菌体因长期接触通过的协同进化而获得对噬菌体的抗性。在本发明中采用无菌矿物油将噬菌体液覆盖住，可以防止水分的蒸发，使噬菌体更有效的在渗入烟中；每个烟株茎杆中注射青枯菌噬菌体液的50-100微升，兼顾了青枯病防治效果与成本的平衡；针头插入时间为烤烟移栽后的旺长时期，该时期既利于烟株对青枯菌噬菌体的吸收，也利于青枯病的提前防治。
【具体实施方式】
[0013]下面结合实例对本发明进一步详细的说明，但实例不是对本发明的限定。
[0014]I 材料
无菌水、青枯菌噬菌体株系、CPG液体培养基、注射器针头、注射器、矿物油等。
[0015]CPG液体培养基采用以下方法制作:水解酪蛋白:lg ;蛋白胨:10g ;葡萄糖:5g ;蒸馏水:1000ml ;酸度调节到约pH7.0，在121°C下灭菌30min ;冷却至55°C左右，分装到培养皿中备用。
[0016]青枯菌噬菌体液的制备方法为:采用共培养的方法扩繁青枯菌噬菌体株系，在灭菌后的500ml三角瓶中，加入300mlCPG液体培养基和300 μ I含青枯菌的无菌水，在28°C下震荡培养2-4h，吸光值OD6c?约为0.2-0.3之间，再加入300 μ I含噬菌体的无菌水，在28°C下继续震荡培养2-3h ;之后以8000r/min的转速离心培养液lOmin，取上清液，用0.22 ym的滤膜过滤，取滤液备用。
[0017]无菌矿物油的制备方法为:将300ml矿物油倒入500ml螺口瓶，在121°C下灭菌30min，然后冷却后保存备用。
[0018]无菌注射器针头的制备方法为:用无菌水泡针头过夜，无菌水冲洗两次，高压灭菌后50°C烘干，待冷却至室温后，分装好保存备用。
[0019]2本发明的实施步骤如下:
在烟株移栽到培养钵或田间后的旺长时期，将50-100微升青枯菌噬菌体液置于斜插在烟株茎杆基部的无菌注射器针头中，然后用50-100微升无菌矿物油覆盖青枯菌噬菌体液防止蒸发和污染，使青枯菌噬菌体通过无菌注射器针头直接进入烟株茎杆中即可。
[0020]本发明将青枯菌噬菌体液通过无菌注射器针头直接输入烟株茎杆中，既可以减少青枯菌噬菌体的施用量，避免阳光、紫外线、雨水等外界因素的影响，还能避免或延缓病原青枯菌与其噬菌体因长期接触通过的协同进化作用而获得对噬菌体的抗性。
【主权项】
1.一种青枯菌噬菌体的应用方法，其特征在于:将青枯菌噬菌体液置于斜插在烟株茎杆的无菌注射器针头中，然后用无菌矿物油覆盖青枯菌噬菌体液防止蒸发和污染，使青枯菌噬菌体通过无菌注射器针头直接进入烟株茎杆中。
2.根据权利要求1所述的青枯菌噬菌体的应用方法，其特征在于:所述青枯菌噬菌体液的制备方法为:采用共培养的方法扩繁青枯菌噬菌体株系，在灭菌后的500ml三角瓶中，加入300mlCPG液体培养基和300 μ I含青枯菌的无菌水，在28°C下震荡培养2_4h，吸光值OD_约为0.2-0.3之间，再加入300 μ I含噬菌体的无菌水，在28°C下继续震荡培养2_3h ；之后以8000r/min的转速离心培养液lOmin，取上清液，用0.22 μ m的滤膜过滤，取滤液备用。
3.根据权利要求2所述的青枯菌噬菌体的应用方法，其特征在于:所述CPG液体培养基采用以下方法制作:水解酪蛋白:lg ;蛋白胨:10g ;葡萄糖:5g ;蒸馏水:1000ml ;酸度调节到约pH7.0，在121°C下灭菌30min ;冷却至55°C左右，分装到培养皿中备用。
4.根据权利要求1所述的青枯菌噬菌体的应用方法，其特征在于:所述无菌矿物油的制备方法为:将300ml矿物油倒入500ml螺口瓶，在121°C下灭菌30min，然后冷却后保存备用。
5.根据权利要求1所述的青枯菌噬菌体的应用方法，其特征在于:所述无菌注射器针头的制备方法为:用无菌水泡针头过夜，无菌水冲洗两次，高压灭菌后50°C烘干，待冷却至室温后，分装好保存备用。
6.根据权利要求1所述的青枯菌噬菌体的应用方法，其特征在于:每个烟株茎杆注射青枯菌噬菌体液50-100微升。
7.根据权利要求1所述的青枯菌噬菌体的应用方法，其特征在于:在插入烟株茎杆的无菌注射器针头中，滴入无菌矿物油的量为50-100微升。
8.根据权利要求1所述的青枯菌噬菌体的应用方法，其特征在于:烟株茎杆输入青枯菌噬菌体时间为:烟株移栽到培养钵或田间后的旺长时期。
【专利摘要】本发明公开了一种青枯菌噬菌体的应用方法，将青枯菌噬菌体液置于斜插在烟株茎秆的无菌注射器针头中，然后用无菌矿物油覆盖青枯菌噬菌体液防止蒸发和污染，使青枯菌噬菌体通过无菌注射器针头直接进入烟株茎秆中。本发明根据青枯病是典型细菌性维管束病害的特征，设计利用噬菌体资源以防治青枯病的应用方法，该方法应用于作物青枯病的防控，可以减少青枯菌噬菌体的施用量，避免阳光、紫外线、雨水等外界因素的影响，还能避免或延缓病原青枯菌与其噬菌体因长期接触通过的协同进化作用而获得对噬菌体的抗性。
【IPC分类】A01P1-00, A01N63-00
【公开号】CN104542717
【申请号】CN201510008569
【发明人】蔡刘体, 陆宁, 石俊雄, 陈兴江
【申请人】贵州省烟草科学研究院
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月8日