苦参种苗快速繁殖方法

苦参种苗快速繁殖方法
【专利说明】苦参种苗快速繁殖方法
技术领域 [0001] 本发明涉及生物技术。利用组织培养技术快速繁殖苦参优质种苗。
【背景技术】 [0002] 苦参（SophoraeFlavescentisAit.)为豆科槐属植物，另Ij名苦甘草、苦 参草、苦豆根、山槐根、苦骨。生于沙质地和红壤地的向阳处。中国内陆约有12种，集中分 布于北方沙漠地区。苦参的根是传统中药，味苦、寒，微毒。用于清热燥湿、祛风杀虫、利尿、 平喘、镇静、镇痛、止血、止痢等。苦参主要的化学成分为苦参碱及黄酮类化合物。苦参碱 (matrine)具有抑制肿瘤细胞增殖和转移，促进凋亡，以及诱导肿瘤细胞分化等抗肿瘤的作 用。苦参具有抗炎、抗过敏、抗病毒的作用，并可通过多途径发挥抗肝纤维化作用；同时，可 改善肝脏微循环，促进肝细胞的修复，促进胆汁分泌、增加胆汁流速，以利于胆红素的摄取、 结合与排泄，使血清ALT下降，黄疽消退，且效果稳定，少波动，无明显毒副作用，使用安全 可靠，是值得临床推广应用治疗肝病的新一代药物。苦参黄酮提取物在抗心律失常，治疗糖 尿病，杀虫抗菌，抗肿瘤方面均有作用，有较好的应用前景 【背景技术】 [11]。此外，苦参还用做杀菌、杀虫 的农药 【背景技术】 [12]。苦参又是良好的抗风沙、耐盐碱植物。
[0003] 野生苦参资源越来越少和市场需求越来越多的矛盾十分突出，以播种繁殖为主的 人工种植，存在着发芽率低和遗传分化的问题。利用组织培养技术，可将优良单株快速繁殖 成无性系，在生产中广泛推广，并且完整保留原有植株的综合优良性状。

【发明内容】
[0004] 以苦参种子萌发的无根苗为外植体增殖效果较好。MS、White和改良的MS等3种基本培养基对诱导芽增殖效果差异不显著（F= 1. 1727)，而不定芽或侧芽高生长 却以改良的MS培养基生长最旺盛，并且芽苗粗壮。改良的MS培养基中分别加入了 80mg/L 酵母提取物、水解酪蛋白，说明苦参进入异养期后，对养分的要求较为复杂。在基本培养基 中分别6-BA和2-ip诱导芽体增殖的效果略好于ZT，但3种不同的细胞分裂素之间对诱导 芽体增殖的差异未达到显著水平（F= 7. 1328)。而培养基中激素含量不同时，芽体增殖率 显著不同（F= 79. 059*)，以每升培养基中加入2mg细胞分裂素的增殖效果最好。综合分析 养分条件、激素种类和用量，认为改良的MS+2mg/L6-BA可实现苦参组培苗的快速繁殖。
[0005] 苦参组培苗较易生根，在生根培养基上培养2周时部分芽苗开始发生不定根，多 为愈伤组织生根型。在1/2MS+IBA1. 5mg/L培养基上不定根的诱导效果最好（98% )，且根系 较发达，其次是1/2MS+IBA1. 5mg/L(73% )，1/2MS的生根率最低（56% )。待组培苗的不定 根长到I. 5cm左右时，取出，药浴（I. 2g/L的多菌灵水溶液）20min，移栽到不同基质中，浇透 水，控制适宜的温湿度。组培苗移栽到珍珠岩+蛭石（I: 1)为基质中成活率最高（96%)， 草炭土 +珍珠岩（I: 1)成活率60%，草炭土 +蛭石（I: 1)成活率38%。 【具体实施方式】
[0006] (1)外植体筛选：研宄培养基和激素对苦参芽体增殖的影响时，外植体均为新生 无菌苗的茎尖或茎段。在初级培养时，选用种子、休眠芽、萌动芽。在超净工作台上用75% 酒精先对外植体消毒30s，倒去酒精，用无菌水冲洗干净，再用0. 1 %的HgC12消毒lOmin，最 后用无菌水冲洗3?4次，备用。
[0007] 分别以休眠芽、种子、萌动芽等材料为外植体，培养1周以后，休眠芽外表皮变褐、 变黑，可能是表面消毒的原故。3周后休眠芽，接触培养基的部位陆续形成愈伤组织。接种 萌发芽时，生长较快，且形成愈伤组织，芽体增殖效果不佳。以种子为外植体时，表面消毒后 播种在MS培养基上，3天后陆续发芽，高生长迅速。3?4cm高的无菌苗从初级培养瓶中取 出，剪掉根系后，移栽到分化培养基上，无根苗基部很快形成愈伤组织，培养4周后，愈伤组 织发生不定芽，同时无根苗长出侧芽。表明由种子长出的幼苗在适宜的分化培养基上可以 大量增殖。
[0008] 培养条件：将接种的培养材料放在培养室内培养架上培养。培养条件为，温度 22?28°C，每日光照时间10?12h，光照强度2000?30001x;在弱光（500?8001x)条件 下诱导不定根。（下同）
[0009] (2)芽体增殖培养：在研宄培养基、激素种类和激素浓度对芽体发生数量的影响 时，采用正交实验设计（L934)，见表1。
[0010] 选用3种基本培养基，即MS培养基、改良的MS培养基（在MS培养基中分别加入 80mg/L酵母提取物和水解酪蛋白）和White培养基；添加3种细胞分裂素诱导芽体分化， 分别是玉米素（ZT)、6_苄基氨基腺嘌呤（6-BA)和异戊烯基腺嘌呤（2-ip) ;3种细胞分裂素 的质量浓度分别为1. 〇、2. 0和3.Omg/L。9次试验，各50瓶。
[0011] 3种基本培养基的实验结果表明，基本培养基种类不同对诱导芽增殖效果差异不 显著（F= 1. 1727)，而不定芽或侧芽高生长却以改良的MS培养基生长最旺盛，并且芽苗粗 壮。MS培养基与White培养基上的芽苗细弱，生长缓慢。3种基本培养基的主要区别是，改 良的MS培养基中分别加入了 80mg/L酵母提取物、水解酪蛋白，说明苦参进入异养期后，对 养分的要求较为复杂。
[0012] 通过正交实验，结果表明6-BA和2-ip诱导芽体增殖的效果略好于ZT(见表2)，而 玉米素、6-苄基氨基腺嘌呤、异戊烯基腺嘌呤3种不同的细胞分裂素之间，对诱导芽体增殖 的效果未达到显著差异（F= 7. 1328)。因此，批量生产组培苗时，建议采用6-BA来诱导不 定芽，即经济又可靠。
[0013] 尽管3种细胞分裂素在诱导芽体增殖过程效果相似，而培养基中激素含量不同 时，芽体增殖率效果显著不同（F= 79. 059*)，以每升培养基中加入2mg细胞分裂素的增殖 效果最好（18.64a)，其次是培养基中加入3mg/L细胞分裂素（15.33a)，每升培养基中加入 Img的芽体增殖效果最差（8. 29b)，说明在上述培养基中加入2mg/L细胞分裂素对于芽体增 殖效果较为理想。综合分析基本培养基、激素种类和用量，认为改良的MS+2mg/L6-BA可实 现苦参组培苗的快速繁殖。
[0014] 表1.正交实验（L934)设计组培繁殖试验结果
[0015] TABLE2Theresultsofculturalpropagationoforthogonaldesign(L934)
[0016]
【主权项】
1. 以苦参种子萌发的无根苗为外植体进行增殖培养效果较好。
2. 为改良的MS+2mg/L6-BA可实现苦参组培苗的快速繁殖。
3. 苦参组培苗在1/2MS+IBA1. 5mg/L培养基上不定根的诱导效果最好，且根系较发达。
4. 苦参组培苗移栽到珍珠岩+蛭石（I : 1)为基质中成活率最高。
【专利摘要】本发明涉及苦参组织培养快速繁殖方法。苦参是一种豆科药用植物，将苦参种子萌发的幼芽作为外植体，接种到加入6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)或异戊烯基腺嘌呤(2-ip)改良的MS培养基，进行增殖培养。不定芽或侧芽在改良的MS培养基生长最旺盛，以改良MS+2mg/L6-BA增殖效果最好，并且芽苗粗壮；芽苗在1/2MS+IBA1.5mg/L培养基上不定根的诱导效果最好，且根系较发达，苦参组培苗多为愈伤组织生根型；取出生根苗，在1.2g/L的多菌灵水溶液中浸泡20min后，移栽到珍珠岩+蛭石为基质(1∶1)的秧盘中成活率最高。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104585026
【申请号】CN201410798845
【发明人】程广有
【申请人】程广有
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月15日