能够促进白芨种子萌发和幼苗生长的培养基及其配方和制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物组织培养技术领域，尤其是涉及一种能够促进白芨种子萌发和幼 苗生长的培养基及其配方和制备方法。
【背景技术】
[0002] 白芨为兰科白芨属多年生草本植物，白芨的干燥块茎，别名良姜、紫兰，李时珍释 其名曰：其根白色，连及而生，故曰白芨。白芨喜阴耐潮，多生于石壁、苔藓层中，原产于中 国，广布于长江流域各省，全国各地有少量栽培，朝鲜和日本也有分布。其花色艳丽、多彩， 在叶片的衬托下，格外端庄而优雅，非常适用于花坛布置和和室内盆栽。此外，白芨块茎含 黏液质和淀粉等，可作糊料，也可入药，其味苦、甘、涩，性微寒；归肺、肝、胃经，具有收敛止 血，消肿生肌的功能，在临床上使用较多。因其巨大的生物价值，使其在市场上供不应求。
[0003] 白芨的种子微小，每个果荚内含数万粒种子，室内人工授粉至种子成熟约80d，种 子呈橄榄形，自色微黄，种皮由1层膜质的长形死细胞构成，种皮细胞质及细胞器均己消 失，细胞侧壁加厚。胚位于种皮内部中央，由几十个细胞组成，处于原胚阶段，种子无胚乳， 无法提供发芽所需养分，在自然状态下极少萌发成苗。加之人们为了追求利益，对野生苗进 行大量挖掘，导致白芨数量急剧减少，资源匮乏，随着环境条件的恶化，野生白芨的分布范 围也日益缩小。快速繁殖白芨幼苗以挽救白芨资源已迫在眉睫。而传统的人工栽培通常采 用分株繁殖，其繁殖效率较低，周期长，不适宜用于商业化的规模种植，无法满足市场需求。 所以植物组织培养技术成为快速获取白芨种苗的最佳选择，其周期短，繁殖系数大，培养条 件人工可控，管理方便。
[0004] 白芨种苗组培快繁分为五个阶段：种子萌发，原球茎诱导，原球茎增殖培养，原 球茎分化培养，生根壮苗。胚龄的白芨种子萌发率较低，且受培养基的影响较大，现有采 用的适合萌发的培养基是MS，萌发率可达95%，继代培养中采用的丛芽增殖培养基为 MS+1. 0mg/L6-BA+0. 15mg/LNAA，生根培养基采用 1/2MS+1.Omg/LNAA+75g/L香蕉泥，为了获 得最佳的生长效果，在白芨的各个阶段生长阶段需要不同的培养基进行配合，较为繁琐，目 前仍然没有一种既能够很好地促进白芨种子的萌发又能够促进幼苗生长的培养基。
[0005] 白芨是兰科植物，兰科植物的生长往往伴随着真菌的参与。白芨种子萌发形成原 球茎后，菌丝会侵入原球茎的柄状细胞，生根阶段，其根是真菌与白芨形成的共生体，真菌 的菌丝可以侵入到根系细胞内，菌丝向根外生长，延伸到植物根系不能到达的基质中，从这 些地方获取大量的碳水化合物和N、P等营养物质，提供给白芨，能够促进白芨种子萌发和 幼苗生长，而现有技术中对白芨共生菌的研宄较少，未有能直接促进白芨共生菌生长的培 养基。此外，在组培生产过程中常出现细菌，真菌等杂菌感染，导致组培苗报废，直接影响组 培生产的成本和效率。目前没有一种直接向培养基本身加入无毒无害的天然添加物，以抑 制杂菌的生长，并使杂菌难以产生耐药性的技术。
[0006] 为了对现有技术进行改进，人们进行了长期的探索，提出了各种各样的解决方 案。例如，中国专利文献公开了一种白芨快速繁殖方法[【申请号】CN201310265500. 3]，包 括以下步骤：种植地的选择：选择阴坡生荒地，翻地深度30cm?40cm，耙细整平，筑成一组 130?140cm宽、20?30cm的高畦，过磷酸钙和腐熟农家肥作基肥；外植体的选取与消毒： 在白芨收获季节，选取当年具有嫩芽的假鳞茎与老鳞茎毗连切下，采用浓度为〇. 5%?3% 高锰酸钾消毒，15?20分钟后采用75%的酒精中浸泡10?15分钟，用1 %次氯酸钠浸泡 5?10分钟，再采用无菌水冲洗干净，切去变色的部分后备用；嫩芽的萌发：将步骤2)中消 毒后的外植体接种到MS+0. 5mg/LBA+0. 01mg/LNAA培养基中，pH为5. 8,培养温度为25°C， 每天光照8小时，光照强度为900LX，接种后10?15天长成幼苗；丛生芽的增殖：将幼苗 接种在MS+0. 5mg/LBA+0. 01mg/LNAA培养基中，培养温度为25°C，光强1600LX，每天光照 8小时，45?60天得到白芨无根苗；生根培养：将高度有3. 5cm的白芨无根苗采用生根培 养基进行生根培养，温度为25°C，光照1600LX，每天光照10小时，30?45天形成完整植株 苗，所述生根培养基为 1/4MS+IBA0. 05mg/L、l/2MS+NAA0. 6mg/L或 1/4MS+NAA0. 6mg/L+l% 活性炭，所述培养基的pH为5. 8 ;植株苗的移栽：选择生长状态良好的完整植株苗，将培养 基清洗干净，移栽到基质中，并保持30 %?35 %的湿度得到炼苗；移栽炼苗及进行田间管 理：3?4月份将生长良好的炼苗移栽到步骤1)选择的种植地中，保持土壤30%?35%的 湿度，并进行田间管理，所述田间管理包括除草、追肥、灌溉、排水和病虫害防治，种植2?3 年后即可收获白芨。
[0007] 上述方案虽然在一定程度上解决了现有技术的不足，但是该培养基针对的外植体 为白芨的块茎，与种子繁殖相比，其繁殖系数小，内生菌多，此外，该培养基不能共同促进白 芨种子萌发和幼苗生长，未有能直接促进白芨共生菌生长的培养基，也不能够抑制杂菌生 长。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对上述问题，提供一种能够促进白芨种子萌发和幼苗生长的培 养基。
[0009] 本发明的另一目的是提供一种能够促进白芨种子萌发和幼苗生长的培养基的制 备配方。
[0010] 本发明的再一目的是提供一种工艺简单，操作方便的能够促进白芨种子萌发和幼 苗生长的培养基的制备方法。
[0011] 为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本能够促进白芨种子萌发的培养 基的制备配方，其特征在于，本制备配方包括下述组份：MS或1/2MS、0. 1?2.Omg/L的NAA、 0? 8?4.Og/L的活性炭、40?60g/L的马铃薯泥、40?60g/L的香蕉泥、1?7g/L的紫苏 梗、2?5g/L的威灵仙、3?10g/L的漏芦、2?9g/L的羌活、3?6g/L的紫花地丁、2?5g/ L的淡竹叶、1?4g/L的山豆根、2?5g/L的天冬和4?7g/L的芦根。
[0012] MS或1/2MS作为基础培养基，NAA促进种子的萌发，香蕉泥和活性炭利于白芨壮 苗生根。紫苏梗、威灵仙、漏芦、羌活、紫花地丁、淡竹叶、山豆根、天冬和芦根属于中药组份。 其中，紫苏梗、威灵仙、漏芦、羌活联合使用能够直接促进种子萌发和幼苗生长；紫花地丁、 淡竹叶、山豆根、天冬和芦根能够促进白芨共生菌的生长，因为白芨共生菌对白芨种子萌发 和幼苗生长均有促进作用，即能够间接促进白芨种子萌发和幼苗生长，直接促进和间接促 进相结合，利于提高白芨幼苗快速繁殖的效率。作为一种改进，本配方还包括紫萁小菇，将 紫萁小菇提取液或无菌培养物的提取液加入到培养基中能直接促进白芨共生菌的生长，此 夕卜，该种伴有紫萁小菇提取液的培养基能够使原球茎的营养器官的分化率及生长速度显著 加快。
[0013] 在上述的能够促进白芨种子萌发的培养基的制备配方中，本制备配方的优化组份 为：1/2MS、1.Omg/L的NAA、2.Og/L的活性炭、50g/L的马铃薯泥、50g/L的香蕉泥、5g/L的紫 苏梗、3g/L的威灵仙、6g/L的漏芦、5g/L的羌活、4g/L的紫花地丁、3g/L的淡竹叶、2g/L的 山豆根、3g/L的天冬和6g/L的芦根。
[0014] 在上述的能够促进白芨种子萌发的培养基的制备配方中，其特征在于，本制备配 方还包括1?5g/L的苍术、1?3g/L的艾叶、2?3g/L的白芷、2?5g/L的苦参、3?4g/L的蛇床子、2?4g/L的白鲜皮、3?5g/L的百部、2?4g/L的黄柏和3?5g/L的洋葱。苍 术、艾叶、白芷、苦参、蛇床子、白鲜皮、百部、黄柏和洋葱属于中药组份，其联合使用能有效 抑制杂菌生长在培养基上生长增殖，避免培养基污染。
[0015] 在上述的能够促进白芨种子萌发的培养基的制备配方中，其特征在于，优化组份 为：2g/L的苍术、lg/L的艾叶、3g/L的白J￡、4g/L的苦参、3g/L的蛇床子、2g/L的白鲜皮、 4g/L的百部、3g/L的黄柏和4g/L的洋葱。
[0016] 采用上述制备配方制备能够促进白芨种子萌发的培养基的方法，其特征在于，本 制备方法包括下述步骤：
[0017] A.浸出液的制备：取制备配方中的各中药组份，混合打磨成粉末，放入容器内且 加蒸馏水300?400ml，放冰箱内冷藏浸泡过夜，第二天煎煮15?45min，补足水分，让其自 然冷却沉淀后吸取上清液，再用滤纸过滤，所得的液体即为浸出液；
[0018]B.制备琼脂液和备用液：称取6?15g的琼脂，加蒸馏水300?400ml，加热并不 断搅拌，直至煮沸溶解呈透明状，再停止加热，得琼脂液；称取0. 1?2.Omg的NAA、0. 8? 4.Og的活性炭、40?60g的马铃薯泥和40?60g的香蕉泥，加适量水，加热并搅拌溶解后 得备用液；
[0019] C.组份混合：称取70ml?IOOml的MS或1/2MS培养基母液，在MS或1/2MS培 养基母液中加入浸出液和备用液，再加入适量B步骤中的琼脂液，充分搅拌，加热水定容到 IOOOml；
[0020] D.pH值调节：用盐酸或氢氧化钠将pH值调至5. 8?6.0,得培养基。
[0021] 在上述的能够促进白芨种子萌发的培养基的制备方法中，在步骤C中，在MS或 1/2MS培养基母液中先加入浸出液，搅拌均匀，再加入备用液，搅拌均匀。
[0022] 在上述的能够促进白芨种子萌发的培养基的制备方法中，在步骤C中，所述的pH 值调至5. 8。pH值为5. 8时最利于白芨种子萌发和幼苗生长。
[0023] 在上述的能够促进白芨种子萌发的培养基的制备方法中，在步骤A中，放冰箱 内冷藏浸泡过夜时冰箱内的温度为5?15°C，所述的浸泡过夜后的浸泡液先用武火煮沸 lOmin，再文火慢煎30min。放入冰箱过夜利于中药组份中的有效成分