一种米老排成年优良单株的离体植株再生方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物的组织培养技术领域，特别涉及一种米老排成年优良单株的离体植株再生方法。
【背景技术】
[0002]米老排(Mytilarialaosensis Lecomte)隶属金缕梅科(Hamamelidaceae)壳菜果属(Mytilaria)，成年树高可达30m，胸径80cm。米老排天然分布于我国的广东、广西和云南及越南、老挝等地，在我国福建、江西等地也有人工栽培。
[0003]米老排木材为红褐色，木质结构细，纹理直，耐干湿变化，木材加工容易，色泽好、花纹美，油漆后光亮性好，易胶粘，适于制作家具、胶合板等。其干形通直，不易受虫蛀，耐腐蚀，可用作建筑材料；米老排木材纤维长2112.8um，与针叶材相近，是阔叶林中最长的一种；米老排具有生长快、人工林纤维材成熟期为7年、幼龄期短和制品强度高等特性，综合品质系数优良，是纤维板和优质制浆造纸原材料。
[0004]米老排为常绿阔叶树种，叶大肥厚，富含蛋白质、脂肪，容易腐烂，林分年总凋落量达7095.76kg/ha，形成较厚的林地内腐殖质层，具有涵养水源、改良土壤和提高土壤肥力的生态功能。同时表现出较强的防火性能，作为防火林带种植，不仅改变一直以来防火树种单一的现状，还有利于提尚森林生态系统的稳定性。
[0005]米老排树冠浓密，叶子肥大嫩绿，鲜叶的粗蛋白含量5.9%，比传统青饲料类的秋红薯藤蛋白质含量高3.5倍，比苦脉菜叶高2.95倍，与较高蛋白含量的玉米粉(含量为6.3%)也差不多，牛、羊、猪、兔等牲畜喜食。其萌芽力强、生物量大，每亩郁闭林可年产2500?3000kg鲜叶，是一种很有潜力的木本饲料树种。
[0006]鉴于米老排生长速度、木材性质、生态效果、防火作用等方面的特性，目前我国多个省如云南、广东、广西、福建、江西等将米老排推选为当地区经济价值较高、有发展前途的优良树种进行推广。
[0007]米老排人工栽培所用苗木都是采用种子苗造林，来自不同种源、家系种子的遗传变异，导致米老排苗木及其造林后的林分个体分化大，参差不齐，进而影响到人工林的造林质量、产量及经济效益。选择优良母本进行组培规模化育苗，实现良种无性化推广是米老排这一优良树种产业化开发的重要途径。
[0008]米老排的组织培养技术报道很少，且存在以下不足:①组培用的母本材料为3?5年生幼林中的单株，不是经过长期选择的成年优树。②外植体诱导培养时污染率高，无菌系建立效率低；③增殖率低(增殖倍率仅为1.6)，增殖芽伸长生长慢，芽质量差，每丛增殖芽高度达到1.0cm的芽最多为2.6株。④生根率不高(低于90% )，生根苗质量差，苗高最大的仅1.2cm，移栽及管理困难。⑤应用该技术进行组培快繁，速度慢，成本高，难以实现规模化。⑥由于幼树与成年大树的生理状态不同，以幼树为母本材料的组培方案不一定能适用于成年大树，这在很多树种上都存在。经验证，利用该组织培养方案对米老排成年大树基部萌枝进行组织培养，增殖培养的芽伸长慢、质量差、增殖倍率低，生根率低，技术不稳定。
[0009]因此，以生长速度快、干型及材性优良、抗逆性强的米老排成年优良单株为母本，以基部萌枝为外植体，通过基本培养基设计、激素种类、浓度及其配比的优化，建立其高效的离体植株再生技术，达到增殖芽健壮伸长生长快、增值率高、生根率高、生根苗健壮、移栽成活率高的目的。通过规模化育苗进行无性化推广，将为我国米老排人工林栽培所需优质种苗的繁殖提供技术支撑，对提升米老排人工林经济效益有着极其重大的意义。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一种米老排成年优良单株的离体植株再生方法。该方法具有不定芽诱导快、增殖倍率高、芽粗壮伸长快、生根率高、生根苗根系发达健壮、移栽成活率、规模化生产成本低等特点。
[0011]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种米老排成年优良单株的离体植株再生方法，包括如下步骤:
[0012](I)外植体采集:选取干型通直圆满、生长速度快、无病虫害的优良单株为母本，剪取树干基部萌枝，去叶后用纯净水清洗干净，备用；
[0013](2)外植体消毒和腋芽诱导:将枝条用无菌水清洗一遍，再依次用酒精溶液、升汞溶液浸泡消毒，用无菌水冲洗后接种到诱导培养基，放到培养室培养，得到腋芽；
[0014](3)增殖培养:将步骤(2)的腋芽切下并转接到增殖培养基上进行培养，得到增殖苗；
[0015](4)生根培养:从步骤(3)得到的增殖苗中切取芽转接至生根培养基上进行培养，得到组培生根苗；
[0016](5)炼苗与移栽:将步骤(4)组培生根苗移到温室进行炼苗移栽，得到容器苗。
[0017]步骤(I)中，所述的剪取树干基部萌枝采用基部环割促进基部萌枝；采集外植体前，每隔1d用多菌灵、百菌清交替喷洒萌枝4?5次；采集后的枝条除叶，用纯净水清洗干净，低温保湿备用。
[0018]步骤⑵中:
[0019]所述的诱导分化培养基为MX培养基+0.2?2.0mg/L 6-BA+0.02?0.2mg/LNAA+25 ?40g/L 鹿糖 +8g/L 卡拉胶；pH 为 5.8-6.0 ；
[0020]所述的MX 培养基含有如下成分:720mg/L NH4N03+400mg/L KN03+660mg/L Ca(NO3)2.2H20+370mg/L MgSO4.7H20+170mg/L KH2P04+65mg/L KC1 + 22.3mg/L MnSO4.4H20+8.6mg/L ZnSO4.7H20+6.2mg/L H3B03+0.83mg/L KI+0.25mg/LNa2MoO4.2H20+0.25mg/L CuSO4.5H20+0.05mg/L NiSO4.6H20+0.025mg/L CoC12+27.8mg/LFeSO4.7H20+37.3mg/L Na2.EDTA.H20+150mg/L 肌醇 +2.0mg/L 甘氨酸 +0.5mg/L 盐酸硫胺素+0.2mg/L烟酸+0.2mg/L盐酸吡哆醇pH 5.8、121°C灭菌15-20分钟。
[0021]所述的用酒精溶液、升汞溶液浸泡消毒采用如下方法进行:用浓度70?75%酒精溶液浸泡时间为20?30s，倒掉酒精溶液后无菌水冲洗I?2次，然后加入0.05%?0.1 %升汞溶液，浸泡3?lOmin，其间不断摇动，倒掉升汞溶液后用无菌水冲洗5?6次。
[0022]所述的培养采用如下方法进行:于25±2°C、60 μπιο?.πΓ2.s4光照la/d ;诱导培养25d，将长度> 2cm的腋芽切下转接到增殖培养基培养；培养30d，腋芽分化形成新芽丛，将芽高3 3cm幼嫩枝条切割成1.0?1.5cm的茎段转接入增殖培养基培养；
[0023]所述的腋芽为芽高为I?2cm的腋芽。
[0024]步骤⑶中，
[0025]所述的增殖培养基为MX培养基+0.5?1.5mg/L 6-BA+0.05?0.15mg/LNAA+25 ?40g/L 鹿糖 +8g/L 卡拉胶；pH 为 5.8-6.0 ；
[0026]所述的培养采用如下方法进行:于25±2°C、60ymol.m_2.s—1光照12h/d ;培养30d，茎段增殖形成芽丛，将芽高3 2cm的嫩茎切下，接入生根培养基。
[0027]步骤⑷中，
[0028]所述的生根培养基为MX培养基+0.1?0.5mg/L NAA+15?20g/L蔗糖+7g/L卡拉胶;pH 为 5.8-6.0 ；
[0029]所述的培养采用如下方法进行:于25±2°C、60 μπιο?.πΓ2.s—1光照12h/d ;
[0030]所述的芽为2cm芽。
[0031]步骤(5)中，
[0032]所述的组培生根苗为生根培养20d的生根瓶苗。
[0033]所述的培养采用如下方法进行:生根培养20d后，将生根瓶苗移到温室中适应外界环境5?7d,然后将组培瓶盖从半开到全开炼苗ld，将组培苗取出，洗净粘于根上的培养基，移栽到泥炭土:珍珠岩=3:1混合基质上，移栽后前20d采用盖膜保湿，然后揭开薄膜按常规幼苗管理。
[0034]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:本发明针对米老排现有组织培养技术中存在的组培无菌性建立困难、增殖培养的芽伸长慢、质量差、增殖倍率低，生根率低，技术不稳定等技术问题，根据米老排成年大树生理状态、离体培养的营养需求而采用MX基本培养基进行培养。其外植体的腋芽速度快；诱导率高、达100% ;增殖系数大、达4.32以上，增殖芽伸长生长快，培养30d芽高达5?6cm ;生根率可达100%，平均根数为13.4根/株；组培生根苗健壮、移栽成活率高。本发明具有不定芽诱导快、增殖倍率高、芽粗壮生长快、生根率高、生根苗根系发达健壮、移栽成活率等特点，可以用于大规模生产培养。
【附图说明】
[0035]图1为实施例1的优树无菌材料的腋芽诱导结果图；
[0036]图2为实施例1的诱导腋芽形成的芽丛结果图；
[0037]图3为实施例1的增殖培养基中的增殖芽结果图；
[0038]图4为实施例1的增殖芽的芽高测量结果图；
[0039]图5为实施例1的生根培养基中的生根苗根系结果图；
[0040]图6为实施例1的生根苗移栽结果图；
[0041]图7是实施例1的移栽苗的生长图。
【具体实施方式】
[0042]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0043]实施例1
[0044](I)外植体采集:选取干型通直圆满、生长速度快、无病虫害的优良单株为母本，优树树龄15年以上，于3?5月份或9?10月份晴