杀虫蛋白的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种杀虫蛋白的用途，特别是涉及一种Cry2Ab蛋白质通过在植物中 表达来控制桃蛀螟为害植物的用途。
【背景技术】
[0002] 桃駐螟（Conogethespunctiferalis)属鳞翅目螟蛾科，为杂食性害虫，除危害玉 米、高粱等作物外，还危害桃、柿、板栗等果树，广泛分布于我国境内，北起黑龙江、内蒙古， 南至台湾地区、海南、广东、广西、云南南缘，东接前苏联东境、朝鲜北境，西面自山西、陕西 西斜至宁夏、甘肃后，折入四川、云南、西藏。危害玉米时，主要蛀食雌穗，也可蛀茎，受害株 率达30 % -80 %;危害高粱时，初孵幼虫蛀入高粱幼嫩籽粒内，用粪便或食物残渣把口封住， 在其内蛀害，吃空一粒又转一粒直至三龄前，三龄后吐丝结网缀合小穗中间留有隧道，在里 面穿行啃食籽粒，严重的把高粱粒蛀食一空。此外还可蛀杆，危害情况类似玉米螟。
[0003]玉米是中国重要的粮食作物，每年因桃蛀螟造成的粮食损失巨大，更甚者影响到 当地人口的生存状况。为了防治桃蛀螟，人们通常采用的主要防治方法有：农业防治、化学 防治和生物防治。
[0004] 农业防治是把整个农田生态系统多因素的综合协调管理，调控作物、害虫、环境因 素、创造一个有利于作物生长而不利于桃蛀螟发生的农田生态环境。如利用处理桃蛀螟越 冬寄主、拾毁落果和摘除虫果、改革耕作制度、种植抗桃蛀螟品种和种植诱集田等措施降低 桃蛀螟的危害。因农业防治必须服从作物布局和增产的要求，应用有一定的局限性，不能作 为应急措施，在桃蛀螟爆发时就显得无能为力。
[0005] 化学防治即农药防治，是利用化学杀虫剂来杀灭害虫，是桃蛀螟综合治理的重要 组成部分，它具有快速、方便、简便和高经济效益的特点，特别是桃蛀螟大发生的情况下，是 必不可少的应急措施，它可以在桃蛀螟造成危害前将其消灭。目前化学防治方法主要有化 学诱杀、药液喷雾等。但化学防治也有其局限性，如使用不当往往会导致农作物发生药害、 害虫产生抗药性，以及杀伤天敌、污染环境，使农田生态系统遭到破坏和农药残留对人、畜 的安全构成威胁等不良后果。
[0006] 生物防治是利用某些有益生物或生物代谢产物来控制害虫种群数量，以达到降 低或消灭害虫的目的。其特点是对人、畜安全，对环境污染少，对某些害虫可达到长期控制 的目的；但是效果常不稳定，并且不论桃蛀螟发生轻重均需同样投资进行。
[0007] 为了解决农业防治、化学防治和生物防治在实际应用中的局限性，科学家们经过 研究发现将编码杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，可获得一些抗虫转基因植物以防治植 物虫害。Cry2Ab杀虫蛋白是众多杀虫蛋白中的一种，是由苏云金芽孢杆菌库斯塔基亚种 (Bacillusthuringiensissubsp.kurstaki，B.t.k.)产生的不溶性伴抱结晶蛋白。
[0008]Cry2Ab蛋白被昆虫摄入进入中肠，毒蛋白原毒素被溶解在昆虫中肠的碱性pH环 境下。蛋白N-和C-末端被碱性蛋白酶消化，将原毒素转变成活性片段；活性片段和昆虫中 肠上皮细胞膜上表面上受体结合，插入肠膜，导致细胞膜出现穿孔病灶，破坏细胞膜内外的 渗透压变化及pH平衡等，扰乱昆虫的消化过程，最终导致其死亡。
[0009] 已证明转Cry2Ab基因的植株可以抵抗玉米螟、棉铃虫等鳞翅目（Lepidoptera)害 虫的侵害，然而，至今尚无关于通过产生表达Cry2Ab蛋白的转基因植株来控制桃蛀螟对植 物危害的报道。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一种杀虫蛋白的用途，首次提供了通过产生表达Cry2Ab蛋 白的转基因植株来控制桃蛀螟对植物危害的方法，且有效克服现有技术农业防治、化学防 治和生物防治等技术缺陷。
[0011] 为实现上述目的，本发明提供了一种控制桃蛀螟害虫的方法，包括将桃蛀螟害虫 至少与Cry2Ab蛋白接触。
[0012] 进一步地，所述Cry2Ab蛋白存在于至少产生所述Cry2Ab蛋白的宿主细胞中，所述 桃蛀螟害虫通过摄食所述宿主细胞至少与所述Cry2Ab蛋白接触。
[0013] 更进一步地，所述Cry2Ab蛋白存在于至少产生所述Cry2Ab蛋白的细菌或转基因 植物中，所述桃蛀螟害虫通过摄食所述细菌或所述转基因植物的组织至少与所述Cry2Ab 蛋白接触，接触后所述桃蛀螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡，以实现对桃蛀螟危害植 物的控制。
[0014] 所述转基因植物可以处于任意生育期。
[0015] 所述转基因植物的组织为根、叶片、茎杆、果实、雄穗、雌穗、花药或花丝。
[0016] 所述对桃蛀螟危害植物的控制不因种植地点和/或种植时间的改变而改变。
[0017] 所述植物来自玉米、向日葵、大豆、高粱、板栗、桃、石榴、苹果、番茄、茄子、甘蔗、草 坪草、棉花、油菜或草莓。
[0018] 所述接触步骤之前的步骤为种植含有编码所述Cry2Ab蛋白的多核苷酸的植物。 [0019]优选地，所述Cry2Ab蛋白的氨基酸序列具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。所 述Cry2Ab蛋白的核苷酸序列具有SEQIDN0:2所示的核苷酸序列。
[0020] 在上述技术方案的基础上，所述植物还可以包括至少一种不同于编码所述Cry2Ab 蛋白的核苷酸的第二种核苷酸。
[0021] 进一步地，所述第二种核苷酸编码Cry类杀虫蛋白质、Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶 抑制剂、凝集素、a-淀粉酶或过氧化物酶。
[0022] 优选地，所述第二种核苷酸编码CrylA. 105蛋白或Vip3A蛋白。
[0023] 进一步地，所述CrylA. 105蛋白的氨基酸序列具有SEQIDN0:3所示的氨基酸序 列。
[0024] 更进一步地，所述第二种核苷酸具有SEQIDN0:4所示的氨基酸序列。
[0025] 可选择地，所述第二种核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsRNA。
[0026] 为实现上述目的，本发明还提供了一种Cry2Ab蛋白质控制桃蛀螟害虫的用途。
[0027] 为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制桃蛀螟害虫的植物的方法，包括 向所述植物的基因组中引入编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列。
[0028] 为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制桃蛀螟害虫的植物种子的方法， 包括将由所述方法获得的第一植株与第二植株杂交，从而产生含有编码Cry2Ab蛋白的多 核苷酸序列的种子。
[0029] 为实现上述目的，本发明还提供了一种培养控制桃蛀螟害虫的植物的方法，包 括：
[0030] 种植至少一粒植物种子，所述植物种子的基因组中包括编码Cry2Ab蛋白的多核 苷酸序列；
[0031] 使所述植物种子长成植株；
[0032] 使所述植株在人工接种桃蛀螟害虫和/或桃蛀螟害虫自然发生危害的条件下生 长，收获与其他不具有编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤 和/或具有增加的植物产量的植株。
[0033] 本发明中所述的"接触"，是指昆虫和/或害虫触碰、停留和/或摄食植物、植物器 官、植物组织或植物细胞，所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞既可以是其体内表达 杀虫蛋白，还可以是所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞的表面具有杀虫蛋白和/或 具有产生杀虫蛋白的微生物。
[0034] 本发明所述的"控制"和/或"防治"是指桃蛀螟害虫至少与Cry2Ab蛋白接触，接 触后桃蛀螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡。进一步地，桃蛀螟害虫通过摄食植物组织 至少与Cry2Ab蛋白接触，接触后全部或部分桃蛀螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡。抑 制是指亚致死，即尚未致死但能引起生长发育、行为、生理、生化和组织等方面的某种效应， 如生长发育缓慢和/或停止。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以 用于产物的消耗和/或生成。此外，含有编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列的控制桃蛀螟害 虫的植物和/或植物种子，在人工接种桃蛀螟害虫和/或桃蛀螟害虫自然发生危害的条件 下，与非转基因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤，具体表现包括但不限于改善的茎 杆抗性、和/或提高的籽粒重量、和/或增产等。Cry2Ab蛋白对桃蛀螟的"控制"和/或"防 治"作用是可以独立存在的，不因其它可"控制"和/或"防治"桃駐螟害虫的物质的存在而 减弱和/或消失。具体地，转基因植物（含有编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列）的任何组 织同时和/或不同步地，存在和/或产生，Cry2Ab蛋白和/或可控制桃蛀螟害虫的另一种 物质，则所述另一种物质的存在既不影响Cry2Ab蛋白对桃蛀螟的"控制"和/或"防治"作 用，也不能导致所述"控制"和/或"防治"作用完全和/或部分由所述另一种物质实现，而 与Cry2Ab蛋白无关。通常情况下，在大田，桃蛀螟害虫摄食植物组织的过程短暂且很难用 肉眼观察到，因此，在人工接种桃蛀螟害虫和/或桃蛀螟害虫自然发生危害的条件下，如转 基因植物（含有编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列）的任何组织存在死亡的桃蛀螟害虫、和 /或在其上停留生长受到抑制的桃蛀螟害虫、和/或与非转基因的野生型植株相比具有减 弱的植物损伤，即为实现了本发明的方法和/或用途，即通过桃蛀螟害虫至少与Cry2Ab蛋 白接触以实现控制桃蛀螟害虫的方法和/或用途。
[0035] 在本发明中，Cry2Ab蛋白在一种转基因植物中的表达可以伴随着一个或多个Cry 类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质的表达。这种超过一种的杀虫毒素在同一株转基因 植物中共同表达可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因来实现。另外，一种植物 (第1亲本）可以通过遗传工程操作表达Cry2Ab蛋白质，第二种植物（第2亲本）可以通 过遗传工程操作表达Cry类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质。通过第1亲本和第2亲 本杂交获得表达引入第1亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。
[0036]RNA干扰（RNAinterference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA(double-strandedRNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。因此在本 发明中可以使用RNAi技术特异性剔除或关闭目标昆虫害虫中特定基因的表达。
[0037]在分类系统上，一般主要根据成虫翅的脉序、连锁方式和触角的类型等形态特征， 将鳞翅目分为亚目、总科、科等，而螟蛾科是鳞翅目中种类最多的科之一，全世界已发现1 万种以上，仅中国记录就有几千条。大部分螟蛾科昆虫是农作物的害虫，多数以蛀茎形式为 害，如二化螟和玉米螟。尽管桃蛀螟与二化螟、玉米螟等同属于鳞翅目螟蛾科，除了在分类 标准上存在相似性，在其它形态结构上则存在极大差异；就好比植物中的草莓与苹果一样 (同属于蔷薇目蔷薇科），它们都有花两性，辐射对称，花瓣5片等特征，但是其果实以及植 株形态却是千差万别。桃蛀螟不管是从幼虫形态还是成虫形态上来看，都具有其独特的特 征。如桃蛀螟又被称为豹纹蛾，是因为其成虫翅上有豹纹。而与其同属的玉米螟，翅上完全 没有豹纹，而又有一些波浪纹。成虫阶段是昆虫要行使交配繁殖的重要阶段，翅上的花纹配 合释放的性信息素，来吸引同伴，进而完成交配与繁殖后代。所以外表上的小小差异，其实 体现出的是个体繁殖以及群体繁衍上的根本区别。