一种高虫草素含量的北虫草菌株选育方法及生产工艺的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及北虫草菌株选育方法领域，尤其涉及一种高虫草素含量的北虫草菌株 选育方法及生产工艺。
【背景技术】
[0002] 北虫草又称为蛹虫草、北冬虫夏草，隶属于真菌界的子囊菌门、肉座菌目、麦角菌 科，是虫草属的模式种，与冬虫夏草属同种，全球广泛分布。北虫草在鳞翅目昆虫上的子囊 座与虫体的药用价值与冬虫夏草相似，是我国极具开发价值的药用滋补真菌，可以作为冬 虫夏草的代用品。近年来随着研宄人员对北虫草滋补保健功效和多种药用价值的认识，其 开发利用研宄倍受关注，并在药理有效成分及人工栽培等各方面取得了很大的进展。现在 主栽食用菌品种育种工作开展的很多，但是北虫草新菌株的选育工作报道较少。现在市场 上北虫草商品多为尖头和棒状品种，而市场对子囊座膨大状同时虫草素高的商品草有需 求。
[0003] 真菌的交配型是控制其交配亲和性和有性生殖的遗传基础。已知真菌的交配型 系统分为同宗配合和异宗配合2大类。同宗配合是一种自体可孕的有性生殖方式，即该 真菌不需要两个不同来源的菌丝交配，只由同一有性孢子萌发生成的初级菌丝就可独立 完成有性生活史。同宗配合分成初级同宗配合（primaryhomothallism)和次级同宗配 合（secondaryhomothallism)。异宗配合是一种自体不孕的有性生殖方式，S卩由同一有 性孢子萌发形成的初级菌丝不能独立完成有性生活史，只有通过两个不同交配型的有性 孢子萌发生成的初生菌丝之间的交配，才能完成有性生活史。异宗配合根据控制交配型 的不亲和性因子是一对还是两对，也可分为两类：具有一对不亲和性因子的二极性异宗配 合（bipolarheterothallism)和具有两对不亲和性因子的四极性异宗配合（tetrapolar heterothallism)。就同一菌株所产生的有性孢子间的交配而言，二极性异宗配合菌的可亲 和率为50%，而四极性异宗配合菌的可亲和率为25%，北虫草属于二极性异宗配合真菌， 在有性生殖过程会带来遗传重组缺失突变等，使有性后代发生各种变异，通过子囊孢子的 分离和配对杂交，使我们有可能从中筛选到子囊座膨大虫草素高的北虫草。
[0004] 北虫草在有性生殖过程中往往会发生染色体水平和基因水平上遗传变异染色体 水平上的变异，主要是因为虫草在有性生殖过程中发生质配核配和减数分裂所致；而基因 水平上的变异主要是由于蛹虫草在生长过程中受到营养条件和环境条件的诱变所致，所以 即使是来自同一子实体的不同子囊孢子菌株间在菌落颜色形态生长速率等性状上也存在 一定差异，各自产生子实体的能力也不尽相同。试验表明菌落颜色为杏橙色的单孢子一般 是可孕的而且产子实体的能力较强，配对后比单独培养时产子实体的能力更强，菌落颜色 为淡柠檬黄色的单孢子一般是不可孕的，配对后一部分是可孕的有些产子实体的能力也很 强，将单孢子对峙培养后发现在单孢子间有扇形杂交区的配对培养产生子实体的能力强， 没有扇形杂交区的单孢子配对培养产生子实体的能力弱。
[0005] 现有技术通过组织分离（北虫草菌种的培育方法，CN102550290A;北虫草 最佳组织分离期筛选方法，CN103250566A;蛹虫草优良菌种的筛选和稳定繁殖方法，CN1710063)、分生孢子杂交（利用交配型对蛹虫草菌株复壮和提高子实体产量的方法， CN103609331A;)、多孢杂交（一种蛹虫草菌种的培养方法，CN102017866A)可以基本实现普 通北虫草和孢子粉的生产。但组织分离由于多次的无性繁殖，菌株中含有大量的衰退变异 菌，使菌种活力明显降低，表现为生长变慢、转色变慢、产量下降等；利用分生孢子和多孢杂 交存在菌株纯度不足，出草良品率低等问题。
[0006] 鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研宄和实践终于获得了本创作。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种高虫草素含量的北虫草菌株选育方法及生产工艺，用 以克服上述技术缺陷。
[0008] 为实现上述目的，本发明提供一种高虫草素含量的北虫草菌株选育方法，该具体 过程为：
[0009] 步骤a，优良单孢子菌株选育；
[0010] 将成熟子实体倒悬于PDA培养基上方，自然弹射，18-22°c避光培养2-3天，可见星 芒状萌发点，选取单个萌发点，挑取多于100株于PDA斜面培养基上；20-23°C避光培养15 天后，光照3天，选择30株在PDA斜面培养基上萌发快、长势旺，菌丝粗壮，见光转色快，色 浓的菌株，转接至培养皿，20-23°C避光培养，挑选20株准备子实体培养；
[0011] 步骤b，制备液体菌种；
[0012] 取500ml三角瓶，每瓶加200ml液体培养基，接种约0. 5cm2斜面菌种，置摇床 16-23°C避光培养，100r?mirT1震荡培养4天；观察液体是否浑浊，若浑浊则剔除；
[0013] 步骤c，出草实验；
[0014] 将所得的液体菌种通过一定比例配对转接于瓶装小麦培养基上，于18-20°C避光培养7-15天，菌丝长满培养基后，培养温度调制20-23 °C，见光培养，光照强度 5001X-20001x，持续光照1-3天，转色后在膜上打孔通风，光照改为每天12小时，湿度控制 在65-85 %，培养40天后，选择子囊座膨大显著采收并测定虫草素含量；
[0015] 步骤d，选择子囊膨大状菌株；
[0016] 观察成熟子实体子囊座膨大程度，选取子囊座膨大显著且虫草素含量高的菌株， 从子囊座组织分离得到纯化菌株，转接到PDA斜面培养基，采用小麦培养基再次进行出草 试验；若上述20株菌株未出现子囊座膨大的菌株，则继续将剩余的菌，继续进行出草试验， 筛选子囊座膨大虫草素含量高菌株；
[0017] 观察成熟子实体子囊座膨大程度，选取子囊座膨大显著的菌株，从子囊座组织分 离得到纯化菌株，转接到PDA斜面培养基，采用小麦培养基再次进行出草试验；若上述20株 菌株未出现子囊座膨大的菌株，则继续将剩余的菌，继续进行出草试验，筛选子囊座膨大虫 草素含量高菌株。
[0018] 进一步地，上述步骤b中的液体培养基为：玉米粉1-3%、土豆1-3%、葡萄糖 1-3%、蛋白胨 0? 1-3%、磷酸二氢钾 0? 05-0. 5%、硫酸镁 0? 01-0. 05%、水 89-96. 9%，121°C 灭菌30min。
[0019] 进一步地，上述步骤c中的小麦的固体培养基：小麦1000g、豆柏10-100g、葡萄 糖10-50g、蛋白胨10-50g、磷酸二氢钾l-5g、硫酸镁0. 1-0. 5g、磷酸二氢钾l-5g、硫酸镁 0? 1-0. 5g、VB2-片、VB6-片、含水量 55-65%，121°C灭菌 30min。
[0020] 本发明还提供一种高虫草素含量的北虫草菌株的生产工艺，该具体过程为：
[0021] 步骤al，制作培养基，其配方为：小麦1千克，豆柏0. 05千克，虫草专用促生剂35 克，水1. 5千克；
[0022] 步骤a2,配制方法：将虫草专用促生剂放入水中，搅至完全溶解即成营养液；每盒 小麦按450克、水0. 7升分装入塑料盒；分装完后用耐高温塑料膜将每个塑料盒盖严并用耐 高温松紧绳扎一道；
[0023] 步骤a3,灭菌：灭菌锅内加适量水，把培养料盒放入灭菌锅，升温至100°C-121 °C， 保持1-8小时；取出，冷却后移入接种室；用优质气雾消毒剂或常规方法密闭消毒30分钟， 即可穿戴消毒衣服进入接种室接种；
[0024] 步骤a4,接种：进入接种室应迅速关好门；接种工具、菌种外壁、操作人员双手，用 75%酒精擦拭或浸沾消毒；采用液体菌种；在无菌条件下，打开封口材料，用接种枪将液体 种喷勾即可；接种量视容器大小而定，或在液体菌种中加入一定比例的无菌水或无菌营养 液再接种的；
[0025] 步骤a5,管理：萌发室内最初将温度保持16_20°C遮光萌发8-15天；当菌丝生长 至培养基1/2-2/3时，将温度升至20°C并进行划菌；将盒从萌发室转入培养室，每天24小 时光照转色1-3天，当培养基转为橘红和出现菌丝突起时，给予10_15°C的温差刺激，温度 提高到20-23°C;对培养室消毒30分钟，然后在塑料膜上用工具点6-18个孔，湿度保持 65-85%，室内适量通气为子座生长提供足够氧气；
[0026] 步骤a6,采收：子座呈橘红色或橘黄色球状不再生长时，总培养时间控制在50-70 天；打开盆口用小刀或剪刀将其从基部采下，放入洁净器具内及时烘干或晾干，勿暴晒以免 褪色，干燥后存放。
[0027] 与现有技术相比本发明的有益效果在于，本发明技术能够实现北虫草品种的多样 化，优选出子囊座膨大且虫草素含量高的北虫草菌；外形似蝌蚪，具有很好的市场前景。由 于菌种的特殊性，工业化生产要求