含有天然专门促消退介质及其前体的具有抗炎活性的油的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请要求2012年5月10日提交的美国临时专利申请号61/645, 281的优先权， 其内容明确地通过引用并入。其中引用的所有参考文献明确地通过引用并入。
技术领域
[0002] 本发明一般地涉及天然产物、炎症、病理学和医学的领域。更具体地，本发明涉及 从天然来源得到的专门促消退介质（SPM)和SPM前体，和它们在用于改善炎症和具有炎症 性组分的疾病的营养补剂以及药物和化妆品制剂中的用途。
【背景技术】
[0003] 炎症是动物做出的一种复杂生物应答，其尝试除去或中和病原体、刺激剂或细胞 损伤，并开始受损组织的愈合。炎症的经典身体征状包括痛（疼痛）、灼热（热）、红（发 红）、肿（肿胀）和功能丧失（功能缺失）。炎症应答的起始与多形核白细胞（嗜中性粒细 胞）、单核细胞和组织巨噬细胞的活化有关。这些细胞的活化会启动由各种小分子和肽介导 的促炎症性信号传递事件的级联，所述小分子和肽包括前列腺素、白三烯、趋化因子和细胞 因子以及活化的补体因子。这些信号传递事件刺激细胞的趋化性、内皮渗透性、血管舒张、 感觉神经的刺激和凝固的活化，这又会导致炎症的身体征状。重要的是，现在理解，炎症的 终止（即消退）也是炎症应答的一个主动调节部分，其涉及细胞和分子事件的协调集合，以 便恢复组织结构和功能。
[0004] 尽管炎症是有益的且实际上是良好的健康所必需的，但是它也可以出差错和造成 疾病。例如，缺血后的再灌注损伤（例如，在心肌梗塞或缺血性中风中）会刺激急性炎症应 答，该应答可以损伤组织。并且，当除去原始刺激以后正常炎症应答不能终止（消退）时， 慢性炎症可以接着发生。慢性炎症会损伤健康组织，并且可以造成或加重许多不同疾病，包 括、例如，动脉粥样硬化和血管系统的其它疾病、哮喘、痤疮、银肩病、类风湿性关节炎、慢性 阻塞性肺疾病、囊性纤维化、炎性肠病和不同种类的自身免疫病。慢性炎症还已经与II型 糖尿病、肥胖、阿尔茨海默氏病和癌症关联。
[0005] 现在公认炎症的消退构成一个主动生理学过程，该过程形成炎症应答的一个组成 部分。随着炎症性渗出物的消失以及适当组织结构和功能的恢复，消退由几种不同的分子 和细胞机制介导。这些包括：炎症性细胞因子的清除和代谢破坏；抗炎介质诸如转化生长 因子-β、白介素-10、膜联蛋白Al和脂氧素 A4的形成；促炎症性的嗜中性粒细胞的细胞凋 亡；免疫调节性的单核细胞/巨噬细胞和嗜酸性粒细胞的主动募集；和炎症性白细胞的胞 葬作用和流出。特别有关的是，已经发现，共同地命名为专门促消退介质（SPM)的物质家族 是消退的中枢调节剂。SPM具有有效的抗炎活性（即它们会减少嗜中性粒细胞浸润），主动 地刺激炎症性渗出物的除去和消失，促进感染的清除，和刺激伤口愈合。SPM是在炎症性损 伤的消退渗出物中鉴别出的一类新近表征的脂质介质，并且包含长链多不饱和脂肪酸的酶 促氧合衍生物，所述长链多不饱和脂肪酸是诸如ω-3多不饱和脂肪酸（U-3PUFA)、二十碳 五烯酸（EPA)和二十二碳六烯酸（DHA)。SPM对特定G蛋白偶联受体具有有效激动活性，由 此活化炎症消退的不同方面。SPM由长链《-3PUFA-衍生的脂质介质的几个不同家族组成： 消退素、保护素和maresin-它们中的每一种的成员通过刺激内源性消退机制来控制炎症 的持续时间和强度（Bannenberg和Serhan, 2010)。
[0006] SPM的生物合成涉及一个或两个分子的分子氧向多不饱和脂肪酸中的位置掺入和 立体特异性掺入，所述掺入由底物-和位置-选择性的脂肪酸加氧酶诸如环加氧酶Π 型脂 氧合酶（当被阿司匹林乙酰化时）和几种细胞色素 P450氧化酶催化。当前最好地理解的 充当SPM形成的底物的PUFA是EPA和DHA。
[0007] SPM的内源性形成的第一步涉及长链W-3PUFA以立体化学上确定的方式的酶促 氧合，从而导致特定脂肪酸氢过氧化物的形成。脂肪酸氢过氧化物可以经由几种生物合成 途径转化成SPM。第一种途径是过氧羟基的还原，以形成对应的单羟基化的脂肪酸。这些 单羟基化产物中的一些充当随后酶促氧合的中间体前体，以形成二羟基化的和三羟基化的 SPM。例如，17-羟基-二十二碳六烯酸（17-HDHA)，即15-脂氧合酶催化的与DHA的氧合 产物，是4种不同的三羟基化消退素 RvDl、RvD2、RvD3和RvD4的形成的底物。以此方式， 17-HDHA可以被视作SPM前体。在一个不同的生物合成途径中，首先形成的脂肪酸氢过氧化 物可以酶促地重排以形成环氧化物，并且此后酶促地水解，以形成二羟基化的产物。这样的 二羟基化的脂质介质的例子是保护素 Dl和maresin 1。
[0008] EPA和DHA因而构成动物和人类体内的内源性底物，从它们进行体内形成，以形成 EPA-和DHA-衍生的消退素（分别是所谓的E-系列和D-系列消退素）和DHA-衍生的保 护素和maresin，它们是在体内具有有效抗炎和消退活化活性的二羟基化的和三羟基化的 EPA和DHA衍生物（Bannenberg和Serhan, 2010)。消退素、保护素和maresin是SPM，并且 充当内源性受体配体或变构调节剂以有效地活化细胞应答，所述应答协调地活化抗炎作用 并且促进、刺激和触发炎症的消退。此外，现在还已知EPA和DHA的几种酶促地形成的环氧 化物衍生物本身同样具有有效的抗炎活性（Wagner, 2011)，并且被视作这里的SPM。先前文 献还已经描述了呈它们的游离羧酸形式的几种PUFA-衍生的脂质介质在鳟鱼和鲚鱼的细 胞和组织中的存在（Pettitt, 1989 ;Hong, 2005 ;Oh, 2011 ;Raatz, 2011)。SPM 的形成内源性 地发生在生物体内，在几种组织和细胞类型中，且发生在细胞内。SPM形成的底物是游离羧 酸形式的EPA和DHA ;这些游离脂肪酸已经被磷脂酶从含有EPA和DHA的膜磷脂中释放。先 前描述了在动物或人类的体外可以发现在活生物体的细胞或组织内天然地形成的SPM。
[0009] 现在已经通过化学合成方法合成了几种SPM。合成的SPM已经成为描绘由动物体 内的细胞形成的SPM的化学结构和活性的手段。并且，已经通过化学合成方法合成了 SPM 的结构类似物。合成形式的SPM的优点是它们的被良好控制的纯度。但是，SPM的化学合 成是一个技术上挑战性的且昂贵的过程，因为难以得到对于生物活性而言重要的精确立体 化学和双键几何形状。因此，非常感兴趣的是，接近并得到大量天然生物活性形式的SPM。
[0010] 与本发明特别有关的是，一些单羟基化的和环氧化的（epoxygenated)衍生物构 成具有比EPA和DHA更有效的抗炎活性的生物合成中间体，因为它们在几种SPM的生物合 成中是比EPA和DHA本身更接近的中间体。这些中间体前体因此被视作SPM前体。
[0011] 重要的是，应当指出，几种其它的长链《-3PUFA，诸如二十二碳五烯酸（ω-3)，也 可以被相同的加氧酶转化成氧合的衍生物，其中一些衍生物具有显著的抗炎活性。还存在 长链ω-ePUFA-衍生的抗炎的和刺激消退的（促消退的）脂质介质，诸如通过2个酶促氧 合步骤从花生四烯酸形成的脂氧素 A4,通过环加氧酶（其产生具有有效抗炎活性的脱水产 物）从花生四烯酸形成的前列腺素 D2,和从二十二碳五烯酸（ω-6)衍生出的具有抗炎活性 的脂质介质。在这方面重要的是理解，象EPA和DHA -样，花生四烯酸也是一种必需的长链 PUFA，并且通常存在于也含有长链ω-3脂肪酸的所有生物体中。
[0012] 尽管现在已知几种SPM的化学结构，并且已经在不同的炎症实验模型中稍微详细 地研宄了它们的抗炎和促消退活性，但是尚未开发出用于抑制或消退炎症的含有SPM的营 养补剂、化妆品制剂或经批准的药物制剂。
[0013] 因为增加的EPA和DHA的血液水平与降低的心血管疾病发病率和发展心血管疾病 的倾向有关，所以含有《-3PUFA的油的口服补充逐渐被用于改善炎症，具有某种程度的成 功。普遍认为饮食长链〇-3PUFA的抗炎潜力与EPA和DHA的组织水平的增加有关。通常 认为增加 EPA和DHA的内源性水平如下有利于抗炎状态：竞争从〇-6PUFA花生四烯酸（AA) 衍生出的活化炎症的类花生酸类的内源性形成，具有低得多的炎症效能和效力的EPA-和 DHA-衍生的3-系列前列腺素和血栓烷的形成，和调节免疫细胞功能的在膜结构域和膜蛋 白内的生物物理学变化。但是，最近的研宄已经证实，长链《-3PUFA充当内源性SPM的酶 促形成的内源性底物，其充当自身活性物质以在功能上拮抗炎症且其主动地促进消退。EPA 和DHA充当自身活性物质（其驱动炎症的消退）的形成的生理学底物的这种最近认识，提 供了长链《-3PUFA对于人健康而言的重要性质的更新理解。现在充分确定，增加的含有 EPA和DHA的食品的消耗会增加这些〇-3PUFA的组织水平。近年来，已经证实，EPA和DHA 的饮食补充实际上允许一些EPA-和DHA-衍生的氧合脂质介质在人类中的内源性形成的可 测量的增加（Anta, 2005 ;Shearer, 2010 ;Mas, 2012) 〇
[0014] 含有ω-3双键的长链多不饱和脂肪酸由藻类和其它微生物天然地形成，从而形 成长链ω-3脂肪酸（诸如EPA和DHA)的转移的生体营养链的基础（Gladyshev，2013)。哺 乳动物依赖于通过饮食源（主要通过含有显著EPA和DHA组织水平的鱼的消费，所述鱼又 从食物链得到这些必需的PUFA)对EPA和特别是DHA的充分供给。包括人类在内的哺乳 动物可以从α -亚麻酸内源性地合成EPA和DHA，但是，该转化的效率非常有限，并且对于 EPA和DHA的需求而言是不足的。含有EPA和DHA的食品的饮食摄入以及具有含显著EPA 和DHA水平的油的饮食补充，目前被视作得到日常摄入的适当方式，其可以显著地增加长 链U-3PUFA的水平，并由此得到增加的降低炎症反应和疾病的强度和持续时间的能力。
[0015] 饮食需求随着年龄和生命阶段而变化，并且因此，EPA和DHA对于人健康而言的必 需性质是条件性的。避免人类对长链《-3PUFA的大量需要对天然食物链的依赖和增长人 类对长链ω-3PUFA充足的总体需求，生物技术的新进展已经允许制备例如转基因植物和 微生物，它们被赋予生物合成能力以形成长链ω-3PUFA诸如EPA和DHA (Petrie，2012)。
[0016] 目前通过制剂的消费来实现含有长链ω -3PUFA的油的饮食补充，所述制剂包括 许多不同的呈现。目前采用的油绝大部分（以消费的体积计）由从鱼提取的含有EPA和 DHA的油组成，在所述鱼中，秘鲁鲚鱼占大部分。其它油包括从例如鲑鱼和鲔鱼提取的那些 油。存在多种可得到的不同级别的油，其范围从已经经过冷榨且已经经历非常少步骤仅从 油清除存在于油中的有色或有味物质的油，到已经为得到特定长链ω -3脂肪酸经过选择 性浓缩的油。含有适当浓度的长链《-3PUFA(通常至多大约30% )或具有通过蒸馏增加至 大约55 %的浓度的鱼油，被广泛地用在营养补剂中，所述营养补剂用于治疗例如高甘油三 酯血症和用于血管和眼健康。从鱼油制成的长链《-3PUFA浓缩物（其目前可以在制药产 业的工业规模生产）的一个好例子含有97%的乙酯形式的EPA。
[0017] 涉及脂质化学的一般方法、与油和脂肪酸有关的工业方法、以及常规药物科学，描 述在：（Remington, 2005 ;Martinez, 2007 ;Gunstone 和 Padley, 1997 ;Shahidi, 2005) 〇
[0018] 鱼油工业目前制备许多不同的含有EPA和DHA的油等级。也从其它生物体（诸如 磷虾、乌贼、藻类、酵母、原生动物）和从转基因植物提取含有EPA和DHA的油，所述转基因 植物被赋予编码酶的基因，所述酶允许生物合成EPA和DHA和其它长链ω -3PUFA诸如十八 碳四烯酸（SDA)。在市场上可得到的用于人消费的制剂包括油本身、包囊的油、乳剂和稳定 化的粉剂。在所有情况下，目的是提供饮食添加物和药物成分，它们用于给人类提供足够高 的剂量以辅助增加 EPA和DHA的内源性组织水平。尽管EPA和DHA相对快速地吸收和再分 布进特定细胞类型中，但是可以测量循环中的血小板和脂蛋白（在24小时内），普遍接受的 是，EPA和DHA在口服消费以后的健康促进作用需要大量时间，这是由于以下假定的需求： 增加的EPA和DHA的组织水平需要积累，并且需要在数周至数月内每天摄入至少数百毫克 EPA和DHA的剂量。
[0019] 提供EPA和DHA作为用于降低炎症反应以及预防和治疗炎性病症的必需营养物的 需要的一个特征是，通过饮食食物摄入和特殊补充得到的EPA和DHA向SPM的内源性酶促 转化是一个多步骤的酶促过程，其包括：磷脂酶对磷脂-结合的EPA和DHA的释放，继之以 由特定脂肪酸加氧酶催化的一个或多个酶促氧合反应以形成有活性的SPM。这些过程在健 康条件下适当地起作用，但是，低EPA和DHA组织水平以及身体组织中长链多不饱和脂肪酸 向SPM的有限或不足转化，被认为会促进、诱发炎性病症和增大的炎症反应或成为它们的 基础。
【发明内容】
[0020] 本发明是基于以下惊人发现：专门促消退介质（SPM)和SPM前体存在于从含有长 链〇-3PUFA的生物体提取的油中。使用包括下述步骤的方法，可以生产含有至少一种SPM 或SPM前体且具有抗炎或刺激消退（促消退）活性的油：测量SPM或SPM前体在含有长链 〇-3PUFA的油（诸如粗制的、精制的或浓缩的含有长链ω-3脂肪酸的油）中的存在或水 平，将所述油分级分离（fractionate)成多个级分，测量油级分的抗炎或刺激消退活性，和 任选地重复这3个步骤，以得到含有或富含至少一种SPM或SPM前体且具有抗炎或刺激消 退活性的油。SPM和SPM前体可以以可皂化物质的形式存在。此外，所述油可以含有长链 ω -3PUFA，诸如 EPA 和 DHA。
[0021] 可以用于这样的分级分离的技术包括提取和分离方法。用于得到含有或富含SPM 和SPM前体的油的特别重要的技术是采用二氧化碳作为溶剂的超临界流体萃取（SFE)和超 临界流体色谱法（SFC)。有效量的这些油向受试者的施用构成减少炎症或刺激炎症消退的 方法。所述油可以用于制备营养补剂、药物制剂和化妆品制剂，其包含有效量的具有抗炎或 刺激消退活性的油。这些补剂和制剂因而构成可以大量制备的抗炎和促消退组合物，且不 需要加入昂贵的化学合成的SPM。
[0022] 尽管与本文描述的那些类似或等效的方法和材料都可以用于实践或试验本发明， 但是下面描述了适合的方法和材料。在本文中提及的所有专利、专利申请和出版物通过引 用整体并入。在冲突的情况下，以本说明书（包括定义）为准。另外，下面讨论的特定实施 方案仅仅是示例性的，且无意成为限制性的。本领域技术人员考虑到本发明的描述会明白 本发明的其它方面。
【附图说明】
[0023] 从结合附图做出的下述详细描述，将会更清楚地理解本发明的上述和其它目的、 特征和优点，在附图中：
[0024] 图IA-H显示了 口服施用一系列连续洗脱的油级分（分别编号1-8)以后对通过 脂多糖（LPS)的皮下（s.c.)施用诱导的小鼠中皮下地发生的急性炎症性变化的影响，所 述油级分通过中间体长链《-3PUFA-乙酯浓缩物（含有70 %的组合的EPA-乙酯（EE)和 DHA-EE)的工业规模SFC分级分离得到。
[0025] 图2显示了中间体长链〇-3PUFA-乙酯浓缩物（含有70%的组合的EPA-EE和 DHA-EE)的工业规模SFC分级分离的连续洗脱的油级分中，多不饱和脂肪酸EPA和DHA的乙 酯化和可皂化形式的不同单羟基化衍生物的相对丰度。编号1-8的级分与如在图1中所示 的试验抗炎活性的那些相同。
[0026] 图3A.显示了中间体长链〇-3PUFA-乙酯浓缩物（含有70%的组合的EPA-EE和 DHA-EE)的工业规模SFC的几种连续洗脱的油级分（对应于如在图1和2中所示的相同级 分）中的D-系列消退素前体17-HDHA的乙酯的浓度。
[0027] 图3B.显示了发现在级分1中富含的17-1-HDHA-乙酯的手性高效液相色谱法-三 级四极杆质谱分析的结果，进行该分析以确定碱性水解以后得到的乙酯油级分1-8中的立 体异构体17S-HDHA和17R-HDHA的相对丰度（上图）。
[0028] 图4显示了在通过腹膜内施用酵母膜提取物酵母多糖A诱导的腹膜炎症的鼠模型 中，通过管饲法施用的油级分1和17S-HDHA的抗炎效应。
[0029] 图5A-C证实了几种特定的SPM和SPM前体在不同油级分中的存在。
[0030] 图6A-B表明，通过长链Q-3PUFA浓缩物的SFC分级分离，可以实现特定SPM和 SPM前体的选择性富集。
[0031] 图7显示了通过含有SPM前体的油刺激的炎症的消退。
【具体实施方式】
[0032] 已经发现