一种防风愈伤组织超低温保存技术的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种防风愈伤组织超低温保存技术。
【背景技术】
[0002]培Saposhnikovia di vari ca ta)为伞形科药用植物，其干燥根入药，含有多种生物化学成分，具有解热、镇痛、抗炎、抑菌、抗肿瘤、抗病毒等作用。但由于人为盲目、过度采挖，以及其生境恶化，防风野生资源已近枯竭，现多采用人工栽培，而栽培品种又易受到环境条件影响，很多出现退化，质量不高，建立其组织培养再生体系，将组织培养技术应用于防风工业化生产变得十分必要，但随着愈伤组织继代次数和培养条件的变化，后代易发生变异。为了避免连续继代造成的愈伤组织变异，建立新的种质资源保存方法，因此对防风愈伤组织进行超低温冷冻保存及植株再生也是十分必要的。
[0003]目前关于防风的研究主要集中在植物资源、化学成分分析、生药鉴定、药理作用和临床应用等方面，这些研究为以防风为基源制剂的临床应用奠定了一定的基础。随着生物技术的发展，超低温保存植物愈伤组织技术已日趋完善，愈伤组织用液氮超低温保存后，其生理代谢、分化能力下降和基因特异性丧失等问题可得到控制，可以作为一种长期稳定保存种质资源和工业化，免去了不必要的人力、物力、财物浪费。以超低温冷冻方法保存的愈伤组织可在其后很长时间里根据人们的需要将其取出并用于生产，从而有效地保护了珍稀植物的种质资源。至今为止，尚未见有关防风愈伤组织超低温保的报道，这严重制约了防风种质资源的保存。因此，非常有必要建立防风离体超低温保存技术体系，为科学研究提供了极大帮助。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种防风愈伤组织超低温保存技术，本发明经过愈伤组织诱导、预培养、装载、脱水、冷冻、洗涤、再培养及再生等过程实现了防风愈伤组织超低温保存，从而实现本发明的目的。
[0005]本发明的一种防风愈伤组织超低温保存技术，包括以下的工艺步骤:
(I)外植体的处理:选取当年收饱满的防风种子，以洗洁精水轻轻刷洗，置于自来水中冲洗10?30min后置于清水中浸泡8?12h,再转入50?120mg/mL的赤霉素溶液中浸泡10?15h，然后在超净工作台中以75?80%乙醇溶液浸泡10?30s，无菌水冲洗3?5次，再用含有0.01?0.05%吐温-20的0.1?0.5%升汞溶液消毒5?lOmin，无菌水冲洗3?5次后用无菌滤纸吸干表面的水分后备用。
[0006](2)愈伤组织诱导:用无菌解剖刀在经步骤(I)处理后的种子上割I?3刀造成伤口后接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，接种后在25?28°C条件下进行全暗培养直至形成愈伤组织。
[0007](3)预培养:将步骤(2)得到的3周龄的长势良好的愈伤组织转接至预培养基中进行预培养，接种后在I?5°c条件下培养I?5天后检测细胞存活率。
[0008](4)装载处理:将经步骤(3)处理后存活的愈伤组织切成Icm3左右大小，放入1mL冷冻管后加40%?60%玻璃化保护剂PVS2在室温下装载处理10?40min。
[0009](5)脱水及冷冻:将经步骤(4)处理后的愈伤组织转至预冷至2°C的100%的玻璃化保护剂PVS2中在I?5°C处理20?60min后将冷冻管投入液氮中冷冻处理。
[0010](6)化冻及洗涤:愈伤组织在液氮中保存24h后，取出冷冻管，在40°C水浴中化冻，化冻过程中不断振荡冷冻管，使管内愈伤组织和保护剂受热均匀。然后用含0.5?1.0mol/L的MS培养液在室温下洗涤3?5次，每次lOmin。
[0011](7)再培养:将经化冻后的愈伤组织用无菌水冲洗5?8次后立即转移至继代培养基中进行增殖培养。接种后先在25?28°C条件下全暗培养10?20天，然后置于每天光照12?16小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养。
[0012](8)芽诱导:将步骤(7)培养至15?20天的长势良好的愈伤组织转接至分化培养基中进行不定芽诱导，接种后先在25?28°C条件下全暗培养2?5天，然后置于每天光照12?16小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至形成不定芽。
[0013](9)生根培养:当丛生芽长至2.5?3.5cm高时，将丛生苗切割成单苗接种至生根培养基中进行生根培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养I?4天，然后置于每天光照12?16小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至长出根。
[0014](10)试管苗移栽:当小苗长出的新根系长达2?3.5cm,并且长出侧根，苗闻5cm以上时，将培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗5?7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入由黄沙土和火碳泥(I:1)混合成的基质中并定植于大田中。
[0015]上述步骤(2)所述的诱导培养基为:MS+ I?5mg/L 2，4-D+ 0.5?2mg/L 6-BA+0.1 ?lmg/L KT+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值为
5.4 ?5.8。
[0016]上述步骤(3)所述的预培养基为:MS+1.0?3.0mg/L 6-BA+1.0?3.0mg/LNAA+1.0% ?5.0%DMS0+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH值为5.4?5.8。
[0017]上述步骤(4)所述的玻璃化保护剂PVS2为:30%甘油+15%乙二醇+15%DMS0+0.4mol/L 的蔗糖。
[0018]上述步骤(5)所述的继代培养基为:MS+0.5?3.0mg/L 6-BA+0.1?1.0mg/LNAA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0019]上述步骤(8)所述的分化培养基为:MS+0.1?0.5mg/L NAA+1.0?2.0mg/L6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 琼脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0020]上述步骤(9)所述的生根培养基为:l/2MS+0.05?0.5mg/L 6-BA+0.1?1.0mg/L NAA+2.0% ?2.5% 蔗糖 +0.4% ?0.6% 琼脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值为 5.4 ?5.8。
[0021]本发明的优点是:以防风种子诱导得到的愈伤组织为材料建立了防风离体超低温保存技术体系，从而有效地保护了防风优良种质资源。本发明经过愈伤组织诱导、预培养、装载、脱水、冷冻、洗涤、再培养及再生等过程实现了防风愈伤组织超低温保存，可作为一种长期稳定保存种质资源的方法，降低保存经济成本，有效地保护了珍稀的种质资源，为科学研究提供了极大帮助。
【具体实施方式】
[0022]以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0023]实施例:
(I)外植体的处理:选取当年收饱满的防风种子，以洗洁精水轻轻刷洗，置于自来水中冲洗1min后置于清水中浸泡8h,再转入50mg/mL的赤霉素溶液中浸泡1h,然后在超净工作台中以75%乙醇溶液浸泡10s，无菌水冲洗3次，再用含有0.01%吐温-20的0.1%升汞溶液消毒5min,无菌水冲洗3次后用无菌滤纸吸干表面的水分后备用。
[0024](2)愈伤组织诱导:用无菌解剖刀在经步骤(I)处理后的种子上割I刀造成伤口后接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，接种后在28°C条件下进行全暗培养直至形成愈伤组织。所述的诱导培养基为:MS+ 4mg/L 2，4-D+ lmg/L 6-BA+ 0.5mg/L KT+3.5%蔗糖+0.5%琼脂+0.05%活性炭，pH值为5.8。
[0025](3)预培养:将步骤(2)得到的3周龄的长势良好的愈伤组织转接至预培养基中进行预培养，接种后在2°C条件下培养I天后检测细胞存活率。所述的预培养基为