拮抗马铃薯疮痂病的微生物菌剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业和生物技术领域，涉及一种拮抗马铃薯疮痂病的微生物菌剂，具 体地说，涉及不同菌种之间通过协同作用进行有效复合所生产的一种能够有效治疗马铃薯 疮痂病的一种微生物菌剂。
【背景技术】
[0002] 马铃薯是我国重要的农作物之一，地位仅次于水稻、小麦和玉米，为我国第四大农 作物。马铃薯的种植区域广泛，病害也较为复杂，其中由多种植物病原链霉菌引起的马铃薯 疮痂病是当今影响马铃薯生产的重要病害之一。
[0003] 马铃薯疮痂病主要是由链霉菌引起的，其菌丝细长，连续分割生成大量孢子。孢 子圆筒形，致病菌一般经由土壤气孔从马铃薯表皮皮孔或伤口侵入，但在马铃薯块茎表 皮木栓化后侵入较难。马铃薯疮痂病在土壤高温干燥情形下适宜发病，适宜发病温度为 20-30°C，适宜酸碱度为pH5-8. 6。马铃薯疮痂病影响马铃薯的外观和品质，使薯块的质量下 降，降低了马铃薯的商品价值，使之市场竞争力降低，从而带来经济损失。
[0004] 可以说研究出能够抑制马铃薯疮痂病的微生物群体是利国利民的一项重要课题。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的问题是研制出一种能够高效拮抗马铃薯疮痂病的微生物菌剂， 该系列菌种特点主要是适应性强，稳定性好，不易老化、对病原菌拮抗性强等特点，并合理 利用微生物间的相互作用，配备高技术的生产发酵技术生产出优质的产品。该微生物菌剂 能高效拮抗马铃薯疮痂病的病原菌，刺激植物生长、改善作物品质等作用，从而达到增产、 高产的目的。
[0006] 本发明通过双层平板法测定菌种的抑菌能力，再用纸片法测定发酵液的抑菌 能力，最后通过响应面法确定最终产品的组成。其技术方案如下：一种拮抗马铃薯疮 痂病的微生物菌剂，其采用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)CGMCCl. 3382、放线菌 (Dactylosporangium sp.) ACCC No. 40661、玫瑰黄链霉菌（Streptomyces roseoflavus) ACCC No. 40400作为制备菌种；所述菌种的质量百分比如下：枯草芽孢杆菌30~35%、放线 菌30~35%、玫瑰黄链霉菌33~38%。
[0007] 本发明所述拮抗马铃薯疮痂病的微生物菌剂，其采用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)CGMCCl. 3382 发酵液、放线菌（Dactylosporangium sp. )ACCC No. 40661 发酵液、 玫瑰黄链霉菌（Streptomyces roseoflavus) ACCC No. 40400发酵液混合后作为混合菌剂， 经再次发酵制得。其中，所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) CGMCC1. 3382发酵液、 放线菌（Dactylosporangium sp. )ACCC No.40661 发酵液、玫瑰黄链霉菌（Streptomyces roseoflavus)ACCC No. 40400发酵液，各自的菌种数量均不低于IO8个/mL。三者混合的质 量百分比分别为30~35%、30~35%、33~38%。
[0008] 对于上文所述的技术方案，优选的情况下：所述的混合菌剂经再次发酵的接种量 为混合菌剂占总发酵培养基质量的1~5%。
[0009] 对于上文所述的技术方案，优选的情况下：所述再次发酵的发酵培养基为：葡萄 糖 15 ~30g/L、淀粉 10 ~15g/L、蛋白胨 15 ~23g/L、NaC15 ~10g/L、KH2PO4O. 1 ~0· 5g/ L，其余为蒸馈水；ρΗ6· 0~8· 0。
[0010] 对于上文所述的技术方案，优选的情况下：所述的再次发酵制得的终产物总菌数 至少为10 X IO8个/mL。
[0011] 对于上文所述的技术方案，优选的情况下：所述再次发酵的条件为30°C下培养 4~7天。
[0012] 对于上文所述的技术方案，优选的情况下：所述的枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)CGMCCl. 3382发酵液采用营养肉汁培养基发酵制备；放线菌 (Dactylosporangium sp. )ACCC No. 40661发酵液采用酵母膏麦芽膏培养基发酵制备；玫瑰 黄链霉菌（Streptomyces roseof lavus)ACCC No. 40400发酵液采用高氏合成一号培养基发 酵制备；其中：
[0013] 营养肉汁培养基为蛋白胨5g，NaC15g，牛肉膏3g，蒸馏水定容至1.0 L ;
[0014] 酵母膏麦芽膏培养基为为酵母膏10. 〇g，葡萄糖4g，麦芽膏10. 0g，蒸馏水定容至 1.0 L ；
[0015] 高氏合成一号培养基为可溶性淀粉20.0g，KNO3LOg, FeSO4O. Olg, NaClO. 5g, MgSO4O. 5g，蒸馏水定容至 I. 0L。
[0016] 本发明实施例中通过响应面法确定最终产品的组成，最后通过双层平板法测定发 酵液的抑菌能力。经实地验证，其配方合理，功效稳定，能高效拮抗马铃薯疮痂病的病原菌、 增加产量，提高肥料利用率，改良土壤生态环境。
【具体实施方式】
[0017] 本发明所述的微生物菌剂采用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)CGMCCl. 3382、 放线菌（Dactylosporangium sp. ) ACCC No. 40661、玫瑰黄链霉菌（Streptomyces roseoflavus)ACCC No. 40400均可由商业途径获得。为方便描述后文简述为枯草芽孢杆菌、 放线菌、玫瑰黄链霉菌。
[0018] 实施例1 :发酵液的制备
[0019] 1)接种：配制各菌种的固体培养基，灭菌后严格进行无菌操作，从斜面转接至平 板，最适温度下培养2~3天；
[0020] 2) -级培养：将长好的平板挑取单菌落转接至装有一级液体培养基的50mL锥形 瓶中，无菌操作，30°C、130r/min培养24~48h ;
[0021] 3)二级发酵：将一级培养菌种接种于盛有二级液体培养基的500mL锥形瓶中， 无菌操作，30°C、130r/min培养24~48h，分别制得枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) CGMCCL 3382 发酵液、放线菌（Dactylosporangium sp. ) ACCC No. 40661 发酵液、玫瑰黄链 霉菌（Streptomyces roseoflavus) ACCC No. 40400 发酵液。
[0022] 上述方法中所用的培养基：
[0023] 所述枯草芽孢杆菌采用的固体培养基为营养肉汁琼脂培养基：蛋白胨5g， NaC15g，牛肉膏3g，琼脂15g，蒸馏水定容至1.0 L ;-级液体培养基和二级液体培养基均为 营养肉汁培养基：蛋白胨5g，NaC15g，牛肉膏3g，蒸馏水定容至1.0 L。
[0024] 所述的放线菌采用的固体培养基为酵母膏麦芽膏琼脂培养基：酵母膏10. 0g，葡 萄糖4g，麦芽膏10. 0g，琼脂20. 0g，蒸馏水定容至1.0 L ;-级液体培养基和二级液体培养基 均为酵母膏麦芽膏培养基：酵母膏10. 〇g，葡萄糖4g，麦芽膏10. 0g，蒸馏水定容至1.0 L ;
[0025] 所述玫瑰黄链霉菌采用的固体培养基为高氏合成一号琼脂培养基：可溶性淀粉 20. 0g，KNO3L 0g，FeSO4O. Olg，NaClO. 5g，MgSO4O. 5g，琼脂 20g，蒸馏水定容至 1.0 L ;- 级 液体培养基和二级液体培养基均为高氏合成一号培养基：可溶性淀粉20. 0g，KNO3L 0g， FeSO40.0 1g, NaClO. 5g, MgSO4O. 5g，蒸馏水定容至 I. 0L。
[0026] 实施例2 :发酵菌株培养条件的优化
[0027] 对实施例1培养获得的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)CGMCCl. 3382发酵液、 放线菌（Dactylosporangium sp. )ACCC No.40661 发酵液、玫瑰黄链霉菌（Streptomyces roseof lavus) ACCC No. 40400发酵液分别按30~35%、30~35%、33~38%的质量百分比 混合，将混合后的菌液接种于盛有发酵培养基的发酵罐中，接种量为总发酵培养基质量的 1~5%，30°C下培养4~7天，使发酵液中菌数达到10X IO8个/mL以上，即得到所述拮抗马 铃薯疮痂病的微生物菌剂。其中，所述发酵培养基为：葡萄糖15~30g/L、淀粉10~15g/ L、蛋白胨 15 ~23g/L、NaC15 ~10g/L、KH2P040. 1 ~0· 5g/L，其余为蒸馏水；ρΗ6· 0 ~8. 0。
[0028] 针对实施例1中所用的发酵培养基的①最适碳源、②最适碳源浓度、③最适氮源、 ④最适氮源浓度进行如下的优选实验；同时对发酵培养条件的⑤最适温度、⑥最适p