一种粳稻花药分化培养基配方的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种粳稻花药分化培养基，具体涉及一种高效率地提高粳稻花药愈伤 绿苗分化率的分化培养基配方，属于农业科学技术领域。
【背景技术】
[0002] 花药培养育种，是将花药培育成单倍体植株，再将染色体自然或人工加倍得到纯 合二倍体的一种育种方法，因此花药培养育种也叫单倍体育种。水稻是世界上最重要的粮 食作物之一，1968年水稻花药培养获得了成功。随后，利用该技术选育水稻品种受到各国育 种家的普遍重视。水稻花药培养育种主要特点表现为缩短育种周期，提高选择效率，加速有 效性状转移等。水稻花药培养育种已与常规杂交育种、远缘杂交育种、诱变育种以及转基因 技术育种相结合，发展形成了一套育种技术体系，在传统农业向高技术农业的转化中发挥 着纽带作用。
[0003] 我国于20世纪70年代开始花药培养育种，选育出了一大批水稻新品种，创造了巨 大的社会效益和经济效益。1975年中国科学院北京植物研宄所、黑龙江省农业科学院作物 育种研宄所和松花江地区农业科学研宄所水稻实验站组成的单倍体育种协作组首次育成 了粳稻品种"单丰1号"。1976年中国科学院遗传所和天津市农科所又育成了 "花育1号" 和"花育2号"，我国实现了花培育种从理论到应用的突破。常规育种与花药培养技术结合 起来育成了大量水稻新品种通过审定，比较有代表性的有20世纪80年代的中国农科院的 "中花"系列，其中中花8号、中花9号和中花10号年种植面积曾达到2万hm。90年代的 江西农科院选育的"赣籼"系列，黑龙江省农业科学院水稻研宄所选育出了龙粳系列品种， 2000年后又有不同的中花品种和龙粳品种被成功选育。经过30多年来全国各地育种研宄 队伍的潜心研宄，目前我国已有一大批通过花培育种的品种产生，并且大面积推广应用，我 国水稻花药培养育种的应用研宄在国际上一直保持领先地位。
[0004] 水稻花培育种有许多优势，但其培养效率并不是很理想，主要原因在于花培诱导 率、绿苗分化率低，即花药培养力低。花药培养力的高低由愈伤组织诱导率和分化率所决 定。不同的研宄者针对提高粳稻花培效率进行了研宄，其中通过对培养基进行优化，可使不 同材料的粳稻的花药培养力有不同程度的提高。包括培养基的改良、附加成分的增减、培养 条件的改善等等，其目的都在于提高愈伤组织的诱导率和绿苗的分化率。其中培养基是花 药培养的物质基础，直接关系到培养物的生长与分化，培养基组分是影响花培效率的一个 最重要的因素。
[0005] 通过多年粳稻花药培养的摸索和实践，我们不断优化培养基配方，并且不断尝试 加入一些提高粳稻绿苗分化率的有机添加物并组合其种类搭配及浓度，最终摸索出了一种 显著提高粳稻绿苗分化率的分化培养基配方。我们的研宄结果对于进一步推广和应用水稻 单倍体育种和理论研宄无疑有较大的现实意义和实用价值。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了种粳稻花药分化培养基，该培养基的配方如下： KNO3 1800 ~2000mg/L，NH4NO3 1550 ~1750mg/L，C8H7O2K 2200 ~2600mg/L，KH2PO4 160 ~180mg/L，CaCl2* 2H 20 430 ~450mg/L，MgSO4* 7H 20 360 ~380mg/L，Na2-EDTA 36 ~ 39mg/L，FeS04· 7H20 26. 5 ~28. 5mg/L，MnS04· 4H20 21 ~24mg/L，ZnS04· 7H20 8 ~9mg/L， H3BO3 5· 4 ~7. Omg/L，KI 0· 75 ~0· 85mg/L，CuS04· 5H 20 0· 02 ~0· 03mg/L，Na2MoO4* 2H 20 0· 2 ~0· 3mg/L，CoCl2· 6H 20 0· 02 ~0· 03mg/L，肌醇 90 ~110mg/L，甘氨酸 I. 8 ~2. 2mg/ 1^，脯氨酸160~20〇11^/]^，叶酸0.35~0.4511^凡，丙氨酸1.1~1.311^/]^，赖氨酸1.3~ 1.5mg/L，维生素 BI 0.35 ~0.45mg/L，维生素 B6 0.45 ~0.55mg/L，3-吡啶甲酸 0.45 ~ 0· 55mg/L，蔗糖23~27g/L，植物凝胶5~6g/L ; NAA 0.45 ~0.55mg/L，KT 1.8 ~2.2mg/L，调环酸钙 0.6 ~0.8mg/L，山梨醇 23 ~27g/ L，水解蛋白 0· 9 ~I. lg/L，生物素 0· 07 ~0· 09mg/L，PH 5. 8-6. 0。
[0007] 本发明所述的培养基具有高效率地提高粳稻花药愈伤组织绿苗分化率的优点，可 以显著提高粳稻花药培养效率。下面的实施例以及对比实验可以清楚地反映本发明所述培 养基的特点。
【具体实施方式】
[0008] 实施例1 配制如下配方的培养基： KNO3 1900mg/L, NH4NO3 1650mg/L, C8H7O2K 2400mg/L, KH2PO4 170mg/L, CaCl2* 2H 20 440mg/L，MgSO4. 7H 20 370mg/L，Na2-EDTA 37. 5mg/L，FeSO4. 7H 20 27. 5mg/L，MnSO4. 4H 20 22. 5mg/L，ZnSO4* 7H 20 8. 5mg/L，H3BO3 6. 2mg/L，KI 0. 8mg/L，CuSO4* 5H 20 0. 025mg/L， Na2MoO4* 2H 20 O.25mg/L，C〇C12,6H20 0.025mg/L，肌醇 100mg/L，甘氨酸 2. Omg/L，脯氨酸 180mg/L，叶酸 0· 4mg/L，丙氨酸 I. 2mg/L，赖氨酸 I. 4mg/L，维生素 BI 0· 4mg/L，维生素 B6 0.5mg/L，3-吡啶甲酸 0.5mg/L，蔗糖 25g/L，植物凝胶 5.5g/L; NAA 0.5mg/L，KT 2.0mg/L，调环酸钙 0.7mg/L，山梨醇 25g/L，水解蛋白 l.Og/L，生物 素 0· 08mg/L，PH 5· 9。
[0009] 选取粳稻品种通科粳和黑壳紫粳的花药愈伤组织作为供体，当诱导培养后的花药 愈伤组织长到2毫米大小时，转到分化培养基上诱导绿苗，培养条件控制为：温度26°C、湿 度75%、光照30001x 14h/暗10h。愈伤组织形成后(长到2mm左右)，计算愈伤组织分化率。 绿苗分化率（％) =分化绿苗数/转移的愈伤块数X 100%。
[0010] 实施例2 配制如下配方的培养基（C8H7O2K添加浓度的优选）： KNO3 1900mg/L, NH4NO3 1650mg/L, KH2PO4 170mg/L, CaCl2* 2H20 440mg/L, MgSO4* 7H 20 370mg/L，Na2-EDTA 37. 5mg/L，FeSO4. 7H20 27. 5mg/L，MnSO4. 4H20 22. 5mg/L，ZnSO4. 7H20 8. 5mg/L，H3BO3 6. 2mg/L，KI 0. 8mg/L，CuSO4* 5H20 0. 025mg/L，Na2MoO4* 2H20 0. 25mg/L， C〇C12?6H20 0.025mg/L，肌醇 100mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，脯氨酸 180mg/L，叶酸 0.4mg/L， 丙氨酸1.2mg/L，赖氨酸L4mg/L，维生素 BI 0.4mg/L，维生素 B6 0.5mg/L，3_ [!比啶甲酸 0.5mg/L，鹿糖 25g/L，植物凝胶 5.5g/L; NAA 0.5mg/L，KT 2.0mg/L，调环酸钙 0.7mg/L，山梨醇 25g/L，水解蛋白 l.Og/L，生物 素 0· 08mg/L，PH 5· 9。
[0011] C8H7O2K 的添加浓度设置以下 8 种：0 ;400mg/L ;800mg/L ; 1200mg/L ; 1600mg/L ; 2000mg/L ；2800mg/L ；3200mg/L〇
[0012] 同样选取该两个粳稻品种花药愈伤作为供体，操作方法、培养方法同实施例1，计 算绿苗分化率。
[0013] 实施例3 配制如下配方的培养基(脯氨酸添加浓度的优选）： KNO3 1900mg/L, NH4NO3 1650mg/L, C8H7O2K 2400mg/L, KH2PO4 170mg/L, CaCl2* 2H 20 440mg/L，MgSO4. 7H 20 370mg/L，Na2-EDTA 37. 5mg/L，FeSO4. 7H 20 27. 5mg/L，MnSO4. 4H 20 22. 5mg/L，ZnS04· 7H 20 8. 5mg/L，H3BO3 6. 2mg/L，KI 0. 8mg/L，CuS04· 5H 20 0. 025mg/L， Na2MoO4* 2H 20 0· 25mg/L，CoCl2· 6H 20 0· 025mg/L，肌醇 100mg/L，甘氨酸 2. Omg/L，叶酸 0· 4mg/L，丙氨酸 I. 2mg/L，赖氨酸 I. 4mg/L，维生素 BI 0· 4mg/L，维生素 B6 0· 5mg/L，3- [!比 啶甲酸0. 5mg/L，蔗糖25g/L，植物凝胶5. 5g/L ; NAA 0.5mg/L，KT 2.0mg/L，调环酸钙 0.7mg/L，山梨醇 25g/L，水解蛋白 l.Og/L，生物 素 0· 08mg/L，PH 5· 9。
[0014] 脯氨酸的添加浓度为以下 8 种：0 ;30mg/L ;60mg/L ;90mg/L ;120mg/L ;150mg/L ; 210mg/L ；240mg/L〇
[0015] 同样选取该两个粳稻品种花药愈伤作为供体，操作方法、培养方法同实施例1，计 算绿苗分化率。
[0016] 实施例4 配制如下配方的培养基(丙氨酸添加浓度的优选）： KNO3 1900mg/L, NH4NO3 1650mg/L, C8H7O2K 2400mg/L, KH2PO4 170mg/L, CaCl2* 2H 20 440mg/L，MgSO4. 7H 20 370mg/L，Na2-EDTA 37. 5mg/L，FeSO4. 7H 20 27. 5mg/L，MnSO4. 4H 20 22. 5mg/L，ZnSO4* 7H 20 8. 5mg/L，H3BO3 6. 2mg/L，KI 0. 8mg/L，CuSO4* 5H 20 0. 025mg/L， Na2MoO4* 2H 20 O.25mg/L，C〇C12,6H20 0.025mg/L，肌醇 100mg/L，甘氨酸 2. Omg/L，脯氨酸 180mg/L，叶酸（λ 4mg/L，赖氨酸 L 4mg/L，维生素 BI (λ 4mg/L，维生素 B6 (λ 5mg/L，3-吡啶 甲酸0· 5mg/L，蔗糖25g/L，植物凝胶5. 5g/L ; NAA 0.5mg/L，KT 2.0mg/L，调环酸钙 0.7mg/L，山梨醇 25g/L，水解蛋白 l.Og/L，生物 素 0· 08mg/L，PH 5. 9。
[0017] 丙氨酸的添加浓度设置以下 6 种：0 ;0· 3mg/L ;0· 6mg/L ;0· 9mg/L ;1. 5mg/L ; I. 8mg/