一种防治黄萎病的复合制剂及其制备方法、使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制剂领域，尤其涉及一种防治黄萎病的复合制剂及其制备方法、 使用方法。
【背景技术】
[0002] 黄萎病是世界性的土传真菌维管束病害，发病范围大流行性强，发病几率高，严 重影响作物产量和品质。黄萎病的致病菌在分类学上属于半知菌亚门，淡色孢科，轮枝菌 属，主要包括大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb)和黑白轮枝菌（Verticillium alboatrum)。最新的基因组测序比较分析表明，相对于黑白轮枝菌，大丽轮枝菌具有更多的 转座子、重复基因、参与信号转导和代谢调控的基因，这就导致黄萎病具有高度变异性，易 产生新的生理型。
[0003] 黄萎病属于土传病害，病菌以菌丝、厚垣孢子随病残体在土壤中越冬，一般可存活 6-8年，传染性极强，感染后无有效药物治理。黄萎病的寄主范围很广，并且在逐年扩大，目 前报道的寄主已有660余种，主要是锦葵科、茄科、蔷薇科、菊科、豆科和槭树科植物等。当 病菌侵染植株根部后，扩散至维管束；由于病原菌的快速繁殖，产生大量菌丝和孢子，同时 刺激附近的薄壁细胞产生胶状物质和木质素，堵塞导管，导致水分运输困难，抑制叶片蒸腾 作用和光合作用，引起植株萎蔫。水分运输的障碍导致根部营养物质的运输受到阻碍，继而 导致叶片、花蕾、果实早衰枯死。此外，病菌侵染植株后还会产生一种含糖蛋白的萎蔫毒素， 对CO 2的固定、H 20的光解、辅酶NAD+的还原以及细胞膜的通透性均有较大的毒害作用，导 致寄主维管束功能退化、植物代谢失调、引起植株萎蔫枯死，使得作物减产甚至绝收。
[0004] 黄萎病这类病害一直是农业生产中的难点，现在主要采取选育抗病品种、化学药 剂防治等方法。化学药剂的防治方法在防治病害的同时，无选择地大量伤害了有益生物，破 坏了土壤中的微生物菌群结构，导致土壤污染和退化。而选育抗病品种的方法，由于黄萎病 变异性较大且抗性品种选育年限长抗性单一，防治效果不甚理想。
【发明内容】
[0005] 本发明的实施例提供一种防治黄萎病的复合制剂及其制备方法、使用方法，可以 在防治黄萎病效果良好的情况下，改善土壤质量。
[0006] 为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案：
[0007] -种防治黄萎病的复合制剂，按照重量配比，所述复合制剂包括以下成分：由植物 乳杆菌制成的植物乳杆菌发酵液200份-400份，由枯草芽孢杆菌制成的枯草芽孢杆菌发酵 液200份-400份；
[0008] 其中，所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)于2014年2月20日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No. 8833 ;所述枯草芽孢杆 菌（Bacillus subtilis)于2014年2月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，保藏号CGMCC No. 8834。
[0009] 优选的，所述植物乳杆菌制成的植物乳杆菌发酵液中有效菌数大于IXlO9Cfu/ ml，所述枯草芽孢杆菌发酵液中有效菌体浓度为1-3 X 109cfu/ml。
[0010] 进一步优选的，按照所述重量配比，所述复合制剂还包括：黄腐酸钾50份-100份， 甲壳素20份-50份。
[0011] -种防治黄萎病的复合制剂的制备方法，按照上述的复合制剂中各成分的重量配 比，将植物乳杆菌发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液按所述重量配比混合均匀，然后将黄腐酸 钾、甲壳素加入，混合均匀。
[0012] 可选的，所述植物乳杆菌发酵液的获得方法包括：
[0013] 将冻干保存的植物乳杆菌粉剂接入MRS培养基中，在37°C下培养24小时；然后 1 %接种量接种于发酵培养基，在37°C下发酵16-18小时；其中，所述MRS培养基包括：牛 肉蛋白粉l〇g、鱼肉提取物l〇g、酵母提取物l〇g、葡萄糖l〇g、醋酸钠5g、柠檬酸铵2g、吐温 801g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0. 2g、四水硫酸锰0. 05g、七水硫酸镁0. 2g、定容至1000ml、 PH6. 2 ;所述发酵培养基包括：蛋白胨10g、酵母粉5g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、柠檬酸二铵 2g、吐温 801ml、K2HP04 2g、MnS04*4H20 0.25g、MgS04.7H20 0.58g、NaAc 5g、CaC03 15g，定 容至 1000ml，pH6. 4 ;
[0014] 所述枯草芽孢杆菌发酵液的获得方法包括：
[0015] 将所述枯草芽孢杆菌划线接种于LB固体培养基37°C培养48h ;接种环挑取菌体接 种于液体LB培养基中，180rpm、37°C培养24h ;以1%接种量接种于玉米粉豆柏培养基，进 行发酵培养；发酵条件为：温度37°C，罐压0.1 Mpa，通风0. 8-lvvm，转速180rpm，培养时间 为2-3天，获得枯草芽孢杆菌发酵液；其中，所述LB固体培养基包括：胰蛋白胨10g、酵母 提取物5g、氯化钠10g、琼脂20g、去离子水1000ml、pH7. 0 ;所述玉米粉豆柏培养基包括：玉 米粉2%，豆柏粉7%，磷酸氢二钠0.4%，磷酸二氢钾0.03%，MgSO4* 7H20 0. 1%，消泡剂 0. 02-0. 005%，pH6. 8-7. 0。
[0016] -种防治黄萎病的复合制剂的使用方法，包括：
[0017] 将所述复合制剂稀释，灌根或者生长期全株喷施。
[0018] 上述技术方案提供的一种防治黄萎病的复合制剂及其制备方法、使用方法，由植 物乳杆菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液制成复合制剂，该复合制剂中含有活性复合菌发酵 液，含有丰富的具有植物病害防治的抗菌物质，包括脂肽类、肽类、磷脂类、氨基酸类、核酸 类、脂肽类抗生素表面活性素和多烯类物质等多种化合物，它们可以抑制有害病菌孢子萌 发，具有杀灭真菌、细菌、病毒和菌原体等作用，其中表面活性素对多种植物病原真菌有抑 制活性，其代谢产物抗逆性强，既可防病，又能促进植株生长；发酵液中还含有多种胞外多 糖、活性酶类、氨基酸、植物激素、维生素等，具有增强作物光合作用，促进植株生长的作用， 还可以改善土壤中微生物菌群结构，抑制有害真菌、细菌、病毒等作用。故，本发明实施例提 供的生物制剂可以在防治黄萎病效果良好的情况下，提升土壤环境。
[0019] 保藏说明：所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)于2014年2月20日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号；保藏号CGMCC No. 8833 ;所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)于 2014年2月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址 为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No. 8834。
【具体实施方式】
[0020] 下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例 仅用于说明本发明而不用于限止本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通 常按常规实验方法进行。
[0021] 本发明实施例提供了一种防治黄萎病的复合制剂，按照重量配比，所述复合制剂 包括以下成分：由植物乳杆菌制成的植物乳杆菌发酵液200份-400份，由枯草芽孢杆菌制 成的枯草芽孢杆菌发酵液200份-400份。
[0022] 其中，所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)于2014年2月20日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号CGMCC No. 8833;所述枯 草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)于2014年2月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心CGMCC，保藏号CGMCC No. 8834。
[0023] 本发明实施例中所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum)和所述枯草芽孢 杆菌（Bacillus subtilis)都是从山东省莱芜市黄萎病和枯萎病高发地块健壮棉花植株的 根际土壤黄萎病发病严重地块中生长健壮的植株根际土壤中分离的。所述植物乳杆菌命名 为LP-I。所述枯草芽孢杆菌命名为BS-I。
[0024] 上述两种菌株的分离方法：平板划线法（中国科学院南京土壤所微生物室.土壤 微生物研宄法[M].北京：科学出版杜，1985)，其中LP-I分离所用培养基为MRS(乳酸细菌 培养基）培养基（牛肉蛋白粉l〇g、鱼肉提取物l〇g、酵母提取物l〇g、葡萄糖l〇g、醋酸钠 5g、柠檬酸铵2g、吐温80 lg、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0. 2g、四水硫酸锰0. 05g、七水硫酸镁 0. 2g、定容至1000ml、pH6. 2)，BS-1分离所用培养基为LB培养基（胰蛋白胨10g、酵母提取 物5g、氯化钠10g、琼脂20g、去离子水1000ml、pH7. 0)。
[0025] 上述两种菌株的鉴定方法为：形态学特征鉴定和16S rDNA基因片段序列测序。
[0026] BS-I鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)。BS-I形态学特征：芽孢杆菌 属。单个细胞〇. 7-0. 8 X 2-3微米，芽孢中生，椭圆，胞囊不膨大，无荚膜，周生鞭毛，能运动， 革兰氏染色阳性。NA培养基培养24小时后，菌