一种凝结芽胞杆菌菌悬液的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生态制剂领域，涉及一种凝结芽胞杆菌菌悬液的制备方法，还涉及 所制备的菌悬液在在农业领域的应用。
【背景技术】
[0002] 中国作为一个人口众多的农业大国，我国耕地面积达19. 6亿亩，粮食安全生产事 关国计民生与社会稳定。近20多年来，受耕作制度的变化、气候变异以及产业结构调整等 因素的影响，全国农作物病害问题突发和爆发的频率增加，危害加剧。植物病害一直以来 都是农作物优质高产最重要的制约因素之一。全球植物病害导致主要农作物的平均损失， 约占总产量的10%~15%，每年直接经济损失高达数千亿美元。而农作物病害中，70%~ 80%是由真菌病原菌侵染所引致的。化学防治方法在我国农作物真菌病害防治中长期占据 着重要位置，但化学农药的使用会增大农民生产成本，而且反复施用将不可避免地带来环 境污染和农药残留等问题。
[0003] 随着人们对环境和自身健康的日益关注，研宄开发用量少、超高效、极低毒、安全 可靠、易降解、无环境污染的生物农药已成为当今世界各国防治农作物病害研宄的重要方 向。生物农药产业将对绿色食品的生产提供可靠的生产资料，提升农产品的质量和价值，促 进特色农业、生态农业和旅游观光农业的发展，从而带动农民的增收。现无论是迎接国际贸 易间绿色壁皇的挑战，还是增强我国农业自身竞争力、实现数量型农业向质量型农业的转 变，都迫切要求改变当前以化学防治为主的农作物真菌病害防治现状，提高农作物真菌病 害防治技术水平，从农作物真菌病害防治的角度来推动农产品生产过程的无公害化。促进 农村经济快速发展，建设社会主义新农村具有着重要意义。
[0004] 凝结芽胞杆菌，现已广泛应用于医疗、食品保健和畜牧等领域，作为医药的研宄最 为成熟，已经形成了较完整的生产工艺，其医药商品爽舒宝等的应用也较成熟。但是在农作 物病害防治方面的研宄，只是处于刚刚起步阶段，大多数处于实验室内研宄阶段，具有非常 大的应用潜力。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了改进现有技术的不足而提供一种凝结芽胞杆菌菌悬液的制 备方法。
[0006] 本发明的技术方案为：一种凝结芽胞杆菌菌悬液的制备方法，包括菌种活化、种子 培养、发酵培养、表面活性剂的添加四个步骤，其具体步骤如下：
[0007] A.菌种活化：将凝结芽胞杆菌CGMCC No. 6681菌株接到固体培养基平板中，设定 温度为34~38°C，培养时间为40~45h ;
[0008] B.种子培养：从步骤A培养好的平板中挑取一个单菌落，转接到装有种子培养 基的三角瓶中，在迴转式恒温调速摇瓶柜中，34~38°C，140~180r/min条件下摇床培养 12~20h得到种子培养液；
[0009] C.发酵培养：是将种子培养液转接到装有发酵培养基的三角瓶中，在迴转式恒温 调速摇瓶柜中以140~180r/min，34~38°C条件下培养40~45h，得发酵液；其中种子培 养液与发酵培养基的体积比为〇. 02~0. 07 :1 ;
[0010] D.表面活性剂的添加：将步骤C发酵培养得到的发酵液离心，弃上清液，取菌泥， 对无菌水配成含有5 X 101°~8 X 10 ltlCfuAiL菌悬液，再加入表面活性剂，得到凝结芽胞杆菌 菌悬液。
[0011] 凝结芽胞杆菌菌种的拉丁学名是：Bacillus coagulans，保藏日期是2012年10月 18日，保藏中心登记入册编号是CGMCC No. 6681。
[0012] 优选步骤A中所述的固体培养基组分为：蛋白胨10. 00-15. 00g/L，酵母膏 5. 00-8. 00g/L，氯化钠 5. 00-8. 00g/L，琼脂粉 18. 00-20. 00g/L，pH 7. 0 ~7. 2。
[0013] 优选步骤B中所述的种子培养基组分为：葡萄糖50. 00-60. 00g/L，蛋白胨 10. 00-15. 00g/L，酵母膏 5. 00-8. 00g/L，pH 7. 5-8. 0 (葡萄糖分消）。
[0014] 优选步骤C中所述的发酵培养基组分为：葡萄糖22. 00-25. 00g/L、蛋 白胨 10. 00-12. 00g/L、酵母膏 10. 00-15. 00g/L、MnSO4 ? H2O 0? 0002-0. 0003g/L、 CaCO30.0 2-0. 05g/L，pH 7. 5-8. 0 (葡萄糖与碳酸钙分消）。
[0015] 优选上述的表面活性剂为甘油、吐温80或十二烷基葡萄糖苷（APG)中的一种；表 面活性剂的添加量为表面活性剂在得到凝结芽胞杆菌菌悬液中的浓度为〇. 5-0. 8g/L。
[0016] 优选步骤B中种子培养基的体积占三角瓶体积的5~15%。优选步骤C中发酵培 养基的体积占三角瓶体积的5~15%。
[0017] 优选步骤D中离心转速为8000~10000r/min，离心时间为10~15min。
[0018] 本发明还提供了上述所制备的凝结芽胞杆菌（CGMCC No. 6681)菌悬液在抑制作 物病菌、杀灭作物害虫、促进作物生长方面的应用。
[0019] 生防试验如下：
[0020] 凝结芽胞杆菌抑菌谱测定
[0021] 真菌的活化与培养：挑取真菌菌丝或胞子置PSA平板中央，28°C倒置培养。采用平 板对峙法，待活化好的病原真菌菌落长至一元硬币大小时，用打孔器（d = 6~8_)在活化 好的病原菌的菌落边缘打取菌丝块，将菌丝块挑入PSA平板中线1/3处，培养40~45h后， 在同一条中线1/3处打好的孔中接入15~20 y L的凝结芽胞杆菌CGMCC No. 6681菌悬液。 接种后的培养皿置于28°C温度下培养，待凝结芽胞杆菌CGMCC No. 6681菌悬液干了之后倒 置，每处理重复3次，以只接病原菌的培养基作为对照。
[0022]
【主权项】
1. 一种凝结芽胞杆菌菌悬液的制备方法，其具体步骤如下： A. 菌种活化：将凝结芽胞杆菌CGMCC No. 6681菌株接到固体培养基平板中，设定温度 为34~38°C，培养时间为40~45h ; B. 种子培养：从步骤A培养好的平板中挑取一个单菌落，转接到装有种子培养基的三 角瓶中，在迴转式恒温调速摇瓶柜中，34~38°C，140~180r/min条件下摇床培养12~20h 得到种子培养液； C. 发酵培养：是将种子培养液转接到装有发酵培养基的三角瓶中，在迴转式恒温调速 摇瓶柜中以140~180r/min，34~38°C条件下培养40~45h，得发酵液；其中种子培养液 与发酵培养基的体积比为〇. 02~0. 07 :1 ; D. 表面活性剂的添加：将步骤C发酵培养得到的发酵液离心，弃上清液，取菌泥，对无 菌水配成含有5 X IOltl~8 X 10 1(lcfu/mL菌悬液，再加入表面活性剂，得到凝结芽胞杆菌菌悬 液。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤A中所述的固体培养基组 分为：蛋白胨10. 00-15. 00g/L，酵母膏5. 00-8. 00g/L，氯化钠5. 00-8. 00g/L，琼脂粉 18. 00-20. 00g/L，pH 7. 0 ~7. 2。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤B中所述的种子培养基组分为： 葡萄糖 50. 00-60. 00g/L，蛋白胨 10. 00-15. 00g/L，酵母膏 5. 00-8. 00g/L，pH 7. 5-8. 0。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤C中所述的发酵培养基组分为： 葡萄糖 22. 00-25. 00g/L、蛋白胨 10. 00-12. 00g/L、酵母膏 10. 00-15. 00g/L、MnSO4 ? H2O 0? 0002-0. 0003g/L、CaCO30.0 2-0. 05g/L，pH 7. 5-8. 0。
5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的表面活性剂为甘油、吐温80或 十二烷基葡萄糖苷中的一种；表面活性剂的添加量为表面活性剂在得到凝结芽胞杆菌菌悬 液中的浓度为0. 5-0. 8g/L。
6. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤B中种子培养基的体积占三角瓶 体积的5~15%。
7. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤C中发酵培养基的体积占三角瓶 体积的5~15%。
8. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤D中离心转速为8000~1000 Or/ min，离心时间为10~15min。
【专利摘要】本发明涉及一种凝结芽胞杆菌菌悬液的制备方法，将凝结芽胞杆菌CGMCC No.6681菌株接到固体培养基平板中菌种活化，然后种子培养、发酵培养，最后发酵培养得到的发酵液离心，弃上清液，取菌泥，对无菌水配成含有5×1010～8×1010cfu/mL菌悬液，再加入表面活性剂，得到凝结芽胞杆菌菌悬液。本发明所该方法制得菌悬液在植物的体表定殖能力增强，集促生、抑菌和杀虫于一体，其多种功效决定了其推广具有非常大的前景，符合现代农业的要求。CGMCC No.668120121018
【IPC分类】A01N63-02, A01P3-00, A01P7-04, A01P21-00
【公开号】CN104738093
【申请号】CN201510134705
【发明人】胡永红, 刘艳, 杨文革, 刘邮洲, 章泳, 殷晶晶
【申请人】南京工业大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年3月25日