一种植物免疫诱抗蛋白组合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种植物免疫诱抗蛋白组合物，具体涉及自于灰葡萄孢菌（BotrytiS cinerea)能促进植物生长和诱导植物产生免疫作用的蛋白组合物及其制备方法和应用，属 于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 提高农作物产量和保障国家粮食安全是我国社会稳定、经济发展的基础，也是首 要任务。长期以来由病原微生物引起的植物病害是威胁我国农业生产的重要因素之一。化 学防治对农业生产的发展起到了巨大的推动作用，但也严重污染了环境、破坏了生物多样 性、增强了病原菌的抗药性。我国现已成为世界第一农药生产和使用大国，单位面积平均化 学农药的用量比世界平均用量高2. 5-5. 0倍。每年遭受残留农药污染的作物面积达12亿 亩，其中污染严重的比率达40%，特别是蔬菜、水稻、果树和茶叶等作物。每年仅因蔬菜农药 残留导致的中毒事故就达约10万人次，每年因农药残留造成的外贸损失高达约70亿美元。 生物农药和生物肥料因其具有生产原料和有效成分天然，对人畜安全无毒，不污染环境，无 残留等特点成为国内外关注的热点。
[0003]植物在与病原菌长期的协同进化中，逐步形成了多种抵抗病原菌入侵的机制。植 物抵抗病原菌的侵染可通过组成性防卫机制与诱导性防卫机制来实现。植物组成性防卫机 制包括细胞壁的角质、蜡质、木质素等。诱导性防卫机制是植物的基础防卫反应，它可分为 局部性的防卫反应与系统性的防卫反应。植物细胞在受到病原菌侵染以后，几个到十几个 小时内在侵染位点引起过敏反应，导致植物细胞死亡，从而抑制病原菌在植物体内繁殖与 扩散。同时病原菌激活了植物的系统抗性，在几天到几周的时间内，可以使植物对同一种病 原菌，或其它病原菌侵染获得很强的抗性。系统抗性不同于其它抗病性反应的特征在于系 统抗性对于病原菌的侵染具有广谱抗性，并伴随有一系列的抗性基因发生变化，这种抗性 较为持久。利用植物的诱导抗性防治病害和开发绿色食品，是当前生态农业研究中一个新 的紧迫课题。而建立在该理论基础上的植物免疫诱抗剂被认为是植物保护的新技术和新途 径，符合我国农业可持续发展和环境保护的重大需求。
[0004] 不仅病原微生物能诱导植物的获得抗性，还有一类特殊化合物也能激活植物产生 防卫反应，统称之为蛋白质（elicitor)。蛋白质既能显著提高植物对多种病原物的广谱 抗性，又不会使病原物产生抗药性，对环境和农产品无污染。以此为依据，国内外科学家研 制出了多种蛋白质类植物免疫诱抗剂。目前国际上推出的诱抗剂产品主要有Messenger、 Oxycom、KeyPlex、Actigard、NCI、Chitosan 等。
[0005] 1992年美国的Wei从梨火疫病菌（Erwinia amylovora)中分离到harpinEa蛋白， 该蛋白质能够促进植物生长，诱导植物产生抗病性。2001年，美国康奈尔大学和EDEN生 物科技公司将harpinEa在大肠杆菌中表达，开发了新型绿色生物农药Messenger,登记剂 型为3%微颗粒剂。在多种大田作物、经济作物上应用，效果均十分明显。这种农药对黄瓜 病毒病、番茄青枯病的控制效果达70%以上，防治烟蚜的效果达70%以上，作物增产效果达 10%~20%，是一种较为理想的环境友好型生物农药。
[0006] 我国已经获得正式登记的植物免疫诱抗剂主要有康壮素、壳寡糖和脱落酸等21 个品种，这些免疫诱抗剂已经在我国农作物生产中起到了越来越重要的作用，也受到了生 产者特别是出口和有机食品种植者的广泛欢迎。
[0007] 2004年，康壮素（英文名Messenger)经我国农业部农药检定所审定通过取得了农 药临时登记证，首批推荐在番茄、辣椒、烟草和油菜上使用。经过多年试验，抗病增产效果显 著。来源于细菌的harpinEa蛋白被开发成绿色农药Messenger，用于病害防治取得了良好 的效果，为蛋白类蛋白质在农业生产中的应用提供了成功的范例。
[0008] 目前国内外已从灰葡萄孢菌中分离出许多能够引起植物产生抗病反应的蛋白质。 但是将灰葡萄孢菌蛋白蛋白质作为植物免疫诱抗剂应用于农业生产的实例，还未见报道。
[0009] 如2001年V. Repka,等从灰葡萄孢菌中分离了一种蛋白质，该蛋白质主要成分是 蛋白质和糖，它可以引起植物的氧化爆发和病程相关蛋白的积累，提1?苯丙烷途径相关酶 的活性（V. R印ka?等，Vitis，2001，40 (4) :205-212) ;2011 年 Mohamed El Oirdi 等从灰葡 萄孢菌中分离了一种胞外多糖，通过SA信号转导途径可以有效地诱导番茄对灰霉病的抗 性（Mohamed El Oirdi?等，The Plant Cell, 2011，23:2405-2421)。
[0010] 申请人也从灰葡萄孢菌中先后分离了三种蛋白类蛋白质Pebci、PebC2和BcGSl， 它们的分子量分别为36kDa、14kDa和80kDa。其中PebCl、PebC2来源于灰葡萄孢菌的菌丝 体，二者的共同特征是能促进小麦幼苗生长、增加小麦抗旱性、诱导番茄对灰霉病的系统抗 性，显著提高番茄体内苯丙氨酸解氨酶（PAL)、过氧化物酶（POD)和多酚氧化酶（PPO)的活 性。但是这两种蛋白质不能引起烟草的过敏反应，不能提高烟草对烟草花叶病毒病的抗性； BcGSl是来源于灰葡萄孢菌胞外的一种分泌蛋白，它既可以促进小麦幼苗生长、增加小麦抗 旱性、诱导番茄对灰霉病的系统抗性，也可以引起烟草的过敏反应，显著提高烟草抗花叶病 毒病的能力。PebCl、PebC2和BcGSl三种蛋白质的共同特征是均具有耐热性，在沸水浴中 加热30分钟仍可以保持生物活性。
[0011] 利用灰葡萄孢菌来源的三种蛋白质的生物功能及其理化性质，开发研制灰葡萄孢 菌植物免疫诱抗蛋白植物保护产品，既可以充分利用每种蛋白质的生物功能，全面提高植 物对多种病虫草害的防治效果，又可以在生产工艺中减少纯化步骤，节约生产成本。
【发明内容】
[0012] 本发明旨在从灰葡萄孢菌中分离提取能够诱导植物产生抗性作用的免疫蛋白，促 进植物的生长发育，抵抗病虫草害对作物造成的危害，提高作物产量及品质，延长蔬菜水果 的保鲜期等。
[0013] 本发明的技术方案如下：
[0014] 一种植物免疫诱抗蛋白组合物，其中，有效成分包括分子量分别为36kDa、14kDa 和80kDa的三种活性蛋白质PebCl、PebC2和BcGSl中至少两种蛋白质的混合物。
[0015] 优选的，所述的活性蛋白质PebCl、PebC2和BcGSl在组合物中所占的质量百分数 均为大于零小于百分之百；更优选的，所述的活性蛋白质PebCl、PebC2和BcGSl的质量比为 0- 100 : 0-100 : 0-100;更优选的，所述的活性蛋白质PebCl、PebC2和BcGSl的质量比为 1- 100 : 1-100 : 1-100。
[0016] PebCl、PebC2和BcGSl为从灰葡萄孢菌中提取分离的可以诱导植物产生免疫作用 的活性蛋白质。
[0017] 发明人经试验证明，上述植物免疫诱抗蛋白组合物具有以下功能：
[0018] 1、具有促进植物生长、诱导植物产生免疫抗性的功能；
[0019] 2、具有诱导植物产生抗逆性的功能，其中，所述抗逆功能为抗旱性、耐盐碱性和/ 或耐寒性；
[0020] 3、可用于植物的病虫草害的防治；所述病虫草害的防治为植物的真菌、细菌、病毒 病害的防治，对植物害虫的趋避作用，对植物杂草具有竞争力生长优势；
[0021] 4、可用于蔬菜水果的保鲜；尤其对番茄、黄瓜、草莓、葡萄、苹果保鲜效果更佳；
[0022] 5、在制备加工生物农药、生物肥料、保鲜剂方面的用途；
[0023]6、可加工成种衣剂、可湿性粉剂、水分散粒剂、水剂、水乳剂、微乳剂、悬浮剂、粉 剂、微粒剂、生物液态肥、生物固态肥、生物凝胶肥。
[0024] 制备上述植物免疫诱抗蛋白组合物中活性蛋白质PebCl、PebC2和BcGSl的方法， 包括以下步骤：
[0025] 首先将灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea)接种于PDA固体平板上，25°C培养1周， 挑取菌落边缘处接种于200mL盛有察式液体培养基的500mL三角瓶中，25°C、180r/min培养 4-5天，得到灰葡萄孢菌的发酵液，发酵液抽滤得到灰葡萄孢菌菌丝体和滤液两个组分，将 菌丝体置于研钵中加液氮研磨成粉末，迅速加入pH为7. 0、浓度为20mmol/L的HEPES缓冲 液，混合均匀后，沸水浴20min，在高速冷冻离心机上12000r/min离心15min，收集上清